MAPC或其子细胞在繁殖淋巴造血组织中的用途

摘要

本发明涉及MAPC及其衍生的子细胞在受试者的淋巴造血系统的组织中提供淋巴造血细胞。

说明书

相关申请/专利

本申请为2005年5月5日提交的PCT/US 2005/015740的部分继 续申请，PCT/US 2005/015740为2002年2月1日提交序列号为 10/048,757的美国申请的部分继续申请，10/048,757为2000年8月4 日提交的PCT/US 00/21387的美国国家阶段申请并于2001年2月15 日用英文公开为WO 01/11011，依据U.S.C.35第119(e)条，PCT/US 00/21387要求1999年8月5日提交的序列号为60/147,324和1999年 11月10日提交的序列号为60/164,650的美国临时申请的优先权。

本申请也为2003年8月11日提交的序列号为10/467,963的美国 申请的部分继续申请，10/467,963为2002年2月14日提交的 PCT/US02/04652的美国国家阶段申请并于2002年8月22日用英文公 开为WO 02/064748，依据U.S.C.35第119(e)条，PCT/US02/04652 要求2001年2月14日提交的序列号为60/268,786、2001年2月15日 提交的序列号为60/269,062、2001年8月7日提交的序列号为 60/310,625和2001年10月25日提交的序列号为60/343,836的美国临 时申请的优先权，这些申请和公布文本通过引用的方式纳入本说明书。

政府权利声明

本研究由编号为RO1 DK58295的美国国家拨款资助。政府对本发 明享有某些权利。

技术领域

本发明涉及非胚胎干细胞领域，特别是多能成体干细胞(MAPC) 在提供淋巴造血功能和产生功能性免疫中的用途。

背景技术

造血作用

在原肠胚形成的过程中，中胚层被未来的内胚层所诱导，并且沿 背腹(dv)轴模式化。骨形成蛋白(bone morphogenic protein，BMP) 对于确定细胞分化为腹侧中胚层非常重要(Hemmati-Brivanlou A and Thomsen 1995；Bhardwaj G et al.2001；Leung AYH et al.2004)。在哺 乳动物中，腹侧中胚层的细胞迁移到胚外卵黄囊，在这里它们可以引 发原始的造血作用(Yoder M 1997)。原始的造血作用是暂时性的，主 要由表达胚胎血红蛋白的红系细胞组成。永久造血发生于主动脉-性腺 -中肾(AGM)区域，在这里造血干细胞(HSC)扩增并迁移到胎儿 肝脏和脾脏以产生所有谱系的造血细胞。出生后主要的造血组织为骨 髓。

已经研究了骨髓(BM)微环境在支持HSC的自我更新细胞分裂 中所起的作用。结果表明β1-整联蛋白介导的信号传导控制着HSC的 自我更新和分化(Verfaillie C et al.1991；Verfaillie C 1992；Lewis ID et al.2001；Hurley RW et al.1995；Jiang Y et al.2000；Jiang Y et al. 2000)，以及糖胺聚糖在HSC龛起到细胞作用性群体(orchestrator) 的作用(Lewis ID et al.2001；Gupta P et al.1996；Gupta P et al.1998)。

干细胞

胚胎干(ES)细胞具有无限自我更新的能力，且可以分化成为所 有的组织类型。ES细胞来自胚泡的内细胞群或者植入后胚胎的原始生 殖细胞(胚胎生殖细胞或EG细胞)。ES和EG细胞来自小鼠，最近 也来自非人灵长类和人。当引入胚泡时，ES细胞可以分化为所有的组 织。ES细胞疗法的缺点是当移植到出生后动物中时，ES和EG细胞 会形成畸胎瘤。

ES(和EG)细胞可以使用抗SSEA 1(小鼠)和SSEA 4(人)抗 体通过阳性染色来识别。在分子水平上，ES和EG细胞表达许多这些 未分化细胞所特有的转录因子。这些转录因子包括Oct-4和rex-1。Rex 的表达依赖于Oct-4。也发现LIF-R(小鼠中)和转录因子sox-2和rox-1。 Rox-1和sox-2也在非ES细胞中表达。ES细胞的另一个标志为存在端 粒酶，它为这些细胞提供了在体外无限自我更新的潜力。

Oct-4(在人中为Oct-3)为原肠形成前期胚胎、卵裂早期胚胎、 胚泡内细胞群细胞和胚胎癌(EC)细胞中表达的转录因子(Nichols J.， et al 1998)，并且当细胞受诱导分化时下调。Oct-4的表达在决定胚胎 发生和分化的早期步骤方面起到重要作用。Oct-4与Rox-1一起引起了 锌指蛋白Rex-1的转录活化，Oct-4也用于维持ES的未分化状态 (Rosfjord and Rizzino A.1997；Ben-Shushan E，et al.1998)。此外， 也需要在ES/EC和其它更加分化的细胞中表达的sox-2与Oct-4一起 维持EC/ES的未分化状态(Uwanogho D et al.1995)。鼠ES细胞和原 始生殖细胞的维持需要LIF。

所述Oct-4基因(在人中为Oct-3)可被转录为至少两种人的剪接 变体，Oct 3A和Oct 3B。Oct 3B剪接变体存在于许多分化细胞中，而 有报道说Oct 3A剪接变体(以前也称为Oct 3/4)为未分化的胚胎干 细胞所独有(Shimozaki et al.2003)。

成体干细胞已经在大多数组织中被鉴定出来。造血干细胞为中胚 层衍生的，且可根据细胞表面标记和功能特征来纯化。从骨髓、血液、 脐带血、胎儿肝脏和卵黄囊分离出的造血干细胞为可再次引发造血作 用和生成多个造血系统的祖细胞。造血干细胞可以回输到红系细胞、 嗜中性粒细胞-巨噬细胞、巨核细胞和淋巴造血细胞池。

Jiang et al.(2002)公开了当鼠LaxZ⁺MAPC被移植到遭受未致死 量辐射的NOD-SCID小鼠体内时，这些干细胞有助于造血系统；但是， 处于低造血移植水平，包括没有T-淋巴细胞。此外，Jiang et al.公开 了人MAPC不能在体外进行造血分化。

造血细胞移植

造血细胞移植用于治疗恶性和良性造血障碍的历史已经超过30 年(Thomas ED 1999)。尽管自体的骨髓(BM)或外周血(PB)移植 一直被用于治疗某些恶性肿瘤，污染的肿瘤细胞常常会导致复发。而 且尽管同种异体移植能够治疗几种恶性障碍，但是许多患者缺少适合 的HLA匹配供体，因此无法对其使用这种疗法。此外，同种异体移植 物通常伴随着致残性有时是致命性的移植物抗宿主病(GVHD；Howe CWS and Radde-Stepanick T.1999)。

因此，仍旧存在着评估用于在受试者体内提供淋巴造血功能的潜 在新型细胞源的需要。

发明内容

非胚胎干细胞群，特别是多能成体祖细胞(MAPC)能够有效地 提供淋巴造血功能。MAPC在体内能够进行性地分化，在这里它们可 以形成淋巴造血干细胞和祖细胞，这些细胞能够发育成更加成熟的淋 巴造血细胞类型。或者，活体外形成的MAPC分化子细胞能够被用于 提供淋巴造血功能。如果需要的话，可以将它们给予受试者，在受试 者中它们可以进一步分化；或者可以给予由MAPC在体外形成的终末 分化细胞。

MAPC为“多能成体祖细胞”(非ES、非EG、非生殖)的缩写， 它具有分化成为超过一种胚胎细胞系细胞类型的能力。它可以形成全 部三种原始生殖层(外胚层、内胚层和中胚层)的细胞类型。ES细胞 中存在的基因也存在于MAPC中(例如端粒酶、Oct3/4、rex-1、rox-1、 sox-2)。端粒酶或Oct3/4可以被认定为未分化状态主要产物的基因。 端粒酶是无复制性衰老的自我更新所必需的。

一个实施方案提供了一种在淋巴造血系统组织中提供淋巴造血细 胞的方法，包括给予有此需要的受试者有效量的MAPC，其中所述 MAPC在受试者体内提供淋巴造血功能。

一个实施方案提供了一种在淋巴造血系统组织中提供淋巴造血细 胞的方法，包括给予有此需要的受试者有效量的淋巴造血细胞，所述 淋巴造血细胞是通过MAPC在活体外分化产生的，其中所述淋巴造血 细胞为受试者提供淋巴造血功能。

在一个实施方案中，也给予了有效量的一种影响天然杀伤细胞的 试剂。在一个实施方案中，将可以刺激淋巴造血系统的因子与MAPC 或其分化子细胞一同给药；这类因子包括但不限于生物制剂(如促红 细胞生成素(EPO))或小分子。

在一个实施方案中，所述受试者遭受了辐射、化学疗法或具有遗 传缺陷(例如由于基因异常导致缺少身体所需物质)。在另一个实施方 案中，受试者患有先天性淋巴造血障碍或获得性恶性或良性淋巴造血 障碍。在一个实施方案中，所述障碍包括白血病、骨髓增生异常综合 症、淋巴瘤、遗传性红血球异常、贫血、遗传性血小板异常、免疫障 碍、淋巴组织增生障碍、吞噬细胞障碍或血凝障碍。在另一个实施方 案中，所述障碍包括慢性髓细胞性白血病(CML)。在一个实施方案 中，所述障碍包括范可尼贫血(Fanconia Anemia，FA)。

在一个实施方案中，MAPC或由MAPC分化而来的淋巴造血细胞 的细胞基因组可利用下述方法改变，所述方法包括(a)插入预选的分 离的DNA，(b)用预选的分离的DNA取代细胞基因组的一个区段或 者(c)使至少一部分细胞基因组缺失或失活。

在一个实施方案中，细胞基因组的该区段编码一个非功能性范可 尼贫血的基因(例如基因/基因产物，所述基因/基因产物不能执行其常 规功能，或以较低水平执行其功能，因而导致疾病、障碍或者疾病或 障碍症状)，所述预选的分离的DNA编码一个功能性范可尼贫血基因 (例如基因/基因产物，所述基因/基因组以一种不会导致疾病、障碍或 者疾病或障碍症状的方式执行其功能)，所述细胞基因组的区段被所述 预选的分离的DNA通过同源重组的方法所取代。在一个实施方案中， 所述范可尼贫血基因为FA-C。

在一个实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在另一个实施方案 中，所述MAPC或其子细胞为为自体的、同种异体的、异种的或其组 合。

在一个实施方案中，所述MAPC分化成为淋巴、髓细胞或红细胞 系中的一种或多种的细胞。

在一个实施方案中，所述组织为所述受试者胸腺、脾、血液、骨 髓或淋巴结中的一种或多种。

一个实施方案提供了MAPC或由MAPC分化而来的淋巴造血细 胞在制备用于治疗淋巴造血障碍的药剂中用途。在一个实施方案中， 所述障碍为为白血病、骨髓增生异常综合症、淋巴瘤、遗传性红血球 异常、贫血、遗传性血小板异常、免疫障碍、淋巴组织增生障碍、吞 噬细胞障碍或血凝障碍。

给予的MAPC或子细胞可以通过在体内分化成为脾、胸腺、淋巴 结、血液或骨髓而导致淋巴造血组织的生成。可选地或附加地，给予 的MAPC或子细胞可以通过分泌细胞因子而导致淋巴造血组织的生 成，所述细胞因子可以帮助内源MAPC或其他干细胞归巢和募集，如 造血干细胞或其它更加分化的细胞。可选地或附加地，MAPC或子细 胞可以分泌因子，所述因子可以作用于内源干细胞或祖细胞，导致它 们分化，从而增强功能。此外，MAPC或子细胞可以分泌作用于干细 胞、祖细胞或分化细胞，导致它们分裂的因子。此外，MAPC或子细 胞可以提供血管发生功能或者减少或预防凋亡。

附图说明

图1描绘了造血干细胞和造血区室的结构。

图2描绘了MAPC的淋巴造血植入(A).10⁶个GFP⁺MAPC被 移植到用275cGy和抗NK抗体(抗去唾液酸GM1)处理过的 NOD-SCID小鼠体内(#6)。13周后，将该动物处死并用活体显微镜 (使用安装于MZFL III荧光立体显微镜上的Retiga照相机；用Q Imagin软件采集图像)评估次级淋巴器官(脾、肠系膜淋巴结、胸腺 和外周淋巴结，以及肠和肝)。(B).描绘了骨髓(BM)中源自MAPC 的造血细胞。使用FACS评估来自骨髓(BM)的细胞。骨髓cKit、 Thy1和Sca1的数据仅代表对GFP阳性细胞设门。与生成造血祖细胞 (cKit，Sca1，Thy1⁺)的观点一致，BM的Methocult培养物证明了 GFP⁺CFU-E和CFU-Mix。(C).描绘了胸腺、脾和外周血(PB)的 FACS分析。用FACS评估来自胸腺、PB和脾的细胞；除上面关于胸 腺的图外，数据仅代表对GFP阳性细胞设门。

图3描绘了体外mMAPC的造血功能。将mMAPC与EL08-1D2 细胞用SCF、Tpo、IL3、IL6共同培养2周，随后在含有SCF、IL3、 IL6和Epo的Methocult培养基中培养。在第0、14、29天，使用 Q-RT-PCR检测造血(数据未出示)和内皮标志(A)。(B)描绘了第 15天时Methocult培养基中的BFU-E和CFU-Mix。

图4A-B描绘了小鼠骨髓中MAPC植入水平的FACS分析。

图5A-B描绘了小鼠脾脏中MAPC植入水平的FACS分析。

图6描绘了小鼠外周血中MAPC植入水平的FACS分析。

图7描绘了第二小鼠受体体内植入水平的FACS分析(第二次移 植后四周；给第二受体注射全骨髓(BM)，所述全骨髓来自预先注射 了MAPC的小鼠)

具体实施方式

MAPC具有在体外和体内再生全部原始生殖层(内胚层、中胚层 和外胚层)的能力。在本文中，它们相当于胚胎干细胞，但是与分离 自骨髓的间充质干细胞不同。这些细胞的生物潜能已经在各种生物模 型中得以证明，包括小鼠、大鼠，以及大鼠或NOD/SCID小鼠体内人 干细胞异种植入(Reyes，M.and C.M.Verfaillie 2001；Jiang，Y et al. 2002)。该细胞群已经显示出克隆潜能。将单个遗传标记的MAPC注 射到小鼠胚泡、植入的胚泡和发育足月的胚胎中(Jiang，Y et al.2002)。 嵌合体动物的出生后分析示出了所有组织和器官的重组，包括肝。双 重染色实验表明基因-标记的干细胞会导致这些动物具有占较大百分 比的明显有功能的心肌细胞。这些动物在胚胎期和成年期都没有表现 出任何心脏异常或心律不齐。在这些动物中没有观察到异常或器官功 能障碍。

定义

本文中所用到的下述术语由下列含义定义：

“MAPC”为“多能成体祖细胞”的缩写。它是指能够产生超过一种 胚胎细胞系细胞类型的一种非胚胎、非生殖的干细胞。在分化时它可 以形成全部三种生殖层(即内胚层、中胚层和外胚层)的细胞系。像 胚胎干细胞一样，人MAPC表达端粒酶、Oct 3/4(即Oct 3A)、rex-1、 rox-1和sox-2(Jiang，Y et al.2002)。来自人、小鼠、大鼠或其他哺乳 动物的MAPC看来似乎只是正常的、良性的、到目前为止已知甚至能 在传代晚期细胞中表达端粒酶的体细胞(即非生殖细胞)。MAPC中 的端粒序列长度没有减小。MAPC是核型正常的。MAPC可以表达 SSEA-4和多潜能性维持因子(nanog)。MAPC相关术语“成体”没有 严格限制。它指非胚胎体细胞。

由于注射到哺乳动物体内的MAPC能够迁移并同化到多个器官 中，所以MAPC为自我更新的干细胞。因此，它们可用于器官再生， 以自我更新状态或者处于与所研究的器官相容的分化状态。MAPC具 有代替已经损坏、死亡或者其它具有异常功能的细胞类型的能力，所 述异常功能是由遗传或获得性疾病导致的。或者，如下所述，它们会 有助于组织中健康细胞的维护或新细胞的产生。

MAPC相关术语“多能”是指产生超过一种胚胎细胞系细胞类型的 能力。在分化时MAPC能够形成全部三种原始生殖层(即内胚层、中 胚层和外胚层)的细胞系。

“扩增”是指细胞的繁殖而不出现分化。

“祖细胞”是在干细胞分化过程中产生的细胞，所述祖细胞具有一 些，但不是全部的其终末分化子细胞的特征。确定的祖细胞(如“造血 祖细胞”)是指细胞系而不是具体的或终末分化的细胞类型。缩写 “MAPC”中所用术语“祖”没有将这些细胞限制为特定的细胞系。

“自我更新”是指生成复制的子代干细胞的能力，所述子代干细胞 具有与亲代干细胞相同的分化潜力。本文中用到的一个相似的术语是 “增殖”。

“植入”(engraft)或“植入”(engraftment)是指细胞与所研究的 现有组织接触并整合其中的过程。在一个实施方案中，MAPC或其衍 生子细胞植入到淋巴造血系统中超过约10％、超过约15％、超过约 20％、超过约25％、超过约30％、超过约35％、超过约40％、超过 约45％、超过约50％、超过约55％、超过约60％、超过约65％、超 过约70％、超过约75％、超过约80％、超过约85％、超过约90％、 超过约95％或约100％。

持久性是指细胞在体内抵抗排异反应和随时间(例如日、周、月、 年)保持或增加数量的能力。因此，通过持续，MAPC或子细胞能够 增殖淋巴造血系统组织并重建任何有缺陷的组织。

“免疫耐受”是指外源(例如同种异体或异种的)组织、器官或细 胞在受体受试者体内的存活(按数量和/或时间长度计算)。这种存活 通常是对移植受体进行免疫应答能力的抑制，否则所述的免疫应答可 能会是针对引入的外源细胞而发生的。免疫耐受可能包括以日、周、 月或年为单位计算的持续性免疫抑制。NK介导的免疫耐受包含于免 疫耐受的定义之中。

术语“分离的”是指不与一个或多个细胞或者一个或多个细胞组分 相关联的一个或多个细胞，所述一个或多个细胞或者一个或多个细胞 组分在体内是与该细胞相关联的。

“富集群”意为相对于体内或原代培养物中一种或多种非-MAPC 细胞类型，MAPC数量的相对增加。

“细胞因子”是指可以诱发或增强细胞运动的细胞因子，例如 MAPC或其他干细胞、祖细胞或分化细胞的归巢。细胞因子也会刺激 这类细胞分裂。

“分化因子”是指可诱发定向分化的细胞因子，优选生长因子或血 管生成因子。

“受试者”是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包 括但不限于人、家畜、体育动物和宠物。

本文所用的“治疗”(treat)“治疗”(treating)或“疗法”(treatment) 包括治疗、预防、改善或抑制损伤或疾病相关状况或者损伤或疾病相 关状况的症状。

“有效量”通常是指能够提供所需的局部或全身效果的量，如增强 的性能。例如，有效剂量是足够实现有益或所需临床结果的量。剂量 可以分一次或多次给予，并且可以包括任何预选量的细胞。关于有效 剂量是多少的准确测定应该基于每个受试者的个别因素，包括体型、 年龄、所要治疗的损伤或疾病和从损伤发生或疾病发作开始至今的时 间。本领域的技术人员，特别是医师，应该能够决定构成有效剂量的 细胞数量。

“共同给药”可以包括两种或多种试剂的同时和/或依次给药。

给予的MAPC或子细胞可以通过在体内分化为各种细胞而帮助淋 巴造血组织的生成。这些细胞可以提供淋巴造血功能、植入、再生、 增殖或重建各种淋巴造血组织。可选地或附加地，给予的细胞可以通 过分泌细胞因子而帮助淋巴造血组织的生成，所述细胞因子能够帮助 内源MAPC或其他干细胞或者其它更加分化的细胞的归巢或募集。可 选地或附加地，MAPC或子细胞可以分泌作用于内源干细胞或祖细胞 并导致其分化的因子。此外，MAPC或子细胞可以分泌作用于干细胞、 祖细胞或分化细胞并导致其分裂的因子。因此，MAPC或子细胞可以 通过营养作用来提供益处。营养作用的实例包括但不限于改善细胞存 活率和细胞归巢到所需位置。治疗益处可以上述途径的组合来实现。

“淋巴造血功能”是指可以提供血液、骨髓、脾、淋巴结和胸腺的 细胞。这些细胞包括图1所示的那些细胞。淋巴造血功能可以提供细 胞的增殖；也可以包括细胞的分化；也可以包括募集原始细胞以增殖 淋巴造血系统的一个或多个组织；也可以包括在淋巴造血系统的一个 或多个组织中减少凋亡细胞的比例或数量。淋巴造血细胞包括造血干 细胞和来自淋巴系、髓细胞系、红细胞系的细胞，例如B细胞、T细 胞、单核巨噬细胞系的细胞、红血球、以及来自造血干细胞的其他细 胞(例如，参见图1)。

为了在受试者体内提供淋巴造血功能，几种途径是可行的。在一 个实施方案中，可以给予MAPC并且使得它在体内提供淋巴造血功 能。如本文所述，这可以通过MAPC自身分化或通过其它如内源细胞 募集的方法来实现。或者，可以给予更加成熟的细胞，这些细胞是在 活体外从MAPC分化得来的。这类细胞包括所有分化阶段的子细胞， 包括能够产生所有成熟造血细胞类型的造血干细胞，包括不是能形成 每一种该类细胞的定向祖细胞，以及包括完全成熟淋巴造血细胞的进 一步分化类型。

术语“包括”(comprises)、“包括”(comprising)及类似的术语具 有美国专利法中所述含义且可意为“包括”(include)、“包括” (including)及类似含义。本文所用到的“包括”(including)或“包括” (includes)或类似术语意为包括但不限于。

MAPC

序列号为10/048,757(PCT/US 00/21387(公开为WO 01/11011)) 和10/467,963(PCT/US 02/04652(公开为WO 02/064748))的美国专 利申请中描述了人MAPC，它们关于MAPC的说明内容通过引用的方 式纳入本说明书。MAPC已经在其它哺乳动物体内被识别出来了。例 如，PCT/US 00/21387(公开为WO 01/11011)和PCT/US 02/04652(公 开为WO 02/064748)中也描述了鼠MAPC。WO 02/064748中也描述 了大鼠MAPC。

MAPC生物性地和抗原性地区别于MSC，MAPC代表着比MSC 更加原始的祖细胞群，且表现出分化为上皮、内皮、神经、成肌、造 血、成骨、成肝、软骨形成和脂肪形成系的能力(Verfaillie，C.M.2002； Jahagirdar，B.N.et al.2001)。在NOD-SCID小鼠体内，MAPC能够增 殖培养物而不会失去分化潜能，并且表现出有效长期的植入和按多个 发育系分化，而不形成畸胎瘤(Reyes，M.and C.M.Verfaillie 2001)。

来自骨组织的粘附细胞在本文所述的培养基中富集并生长为高群 体倍增。在早期培养点时，可以在群体中检测到更高的异质性。然后， 许多粘附间质细胞在细胞倍增约30次时经历复制衰老，之后更加同质 的细胞群继续扩增并维持长端粒。

分离和生长

本领域中描述了人和鼠的MAPC分离方法。在PCT/US 00/21387 (公布为WO 01/11011)和PCT/US 02/04652(公开为WO 02/064748) 中描述了这些方法。这些方法以及本文所公开的MAPC的特征都通过 引用的方式纳入本说明书。

MAPC最初是从骨髓中被分离的，但随后从其他组织中得到确认， 包括脑和肌肉(Jiang，Y.，et al.，2002)。因此，MAPC能够从多个来源 分离得到，包括骨髓、胎盘、脐带和脐带血、肌肉、脑、肝、脊髓、 血液或皮肤。例如，MAPC可以来自骨髓穿刺物，所述骨髓穿刺物可 以通过本领域技术人员能够实现的标准方法获得(例如，参见Muschler， G.F.，et al.，1997；Batinic，D.，et al.，1990)。因此本领域技术人员能够获 得骨髓穿刺物、脑或肝活组织检查和其他器官，并且根据这些细胞中 表达(或不表达)的基因，使用本领域技术人员能够实现正向或负向 选择技术来分离细胞(例如，通过功能或形态测定法，如上述申请中 公开的那些方法，这些都通过引用的方式纳入本说明书)。

如U.S.10/048,757中所述的来自人骨髓的MAPC

骨髓单核细胞来自骨髓穿刺物，所述骨髓穿刺物可以通过本领域 技术人员能够实现的标准方法获得(例如，参见Muschler，G.F.et al. 1997；Batinic，D.et al.1990)。多能成体干细胞存在于骨髓中(或其它 器官如肝或脑)，但不表达白细胞共同抗原CD45或成红血细胞特异血 型糖蛋白-A(Gly-A)。细胞的混合群经过Ficoll Hypaque分离处理。 然后用抗-CD45和抗-Gly-A抗体对细胞进行负向选择处理，耗尽 CD45⁺和Gly-A⁺细胞群，然后将余下的接近0.1％的髓单核细胞进行回 收。也可将细胞置于纤连蛋白包被的孔中，按如下所述培养2-4周以 耗尽CD45⁺和Gly-A⁺细胞群。

或者，正向选择可以利用细胞特异性标记的组合来分离细胞。正 向和负向选择技术都是本领域技术人员可以实现的，且用于负向选择 的许多单克隆和多克隆抗体也是本领域可以实现的(例如参见 Leukocyte Typing V，Schlossman，et al.，Eds.(1995)Oxford University Press)并可以从许多来源购得。

Schwartz，et al.，美国专利5,759,793中(磁性分离)、Basch et al.1983(免疫亲和色谱法)和Wysocki and Sato 1978(荧光活化的细 胞分选)描述了从细胞群混合物分离哺乳动物细胞的技术。

将回收的CD45^-/Gly A^-细胞置于用约5-115ng/ml(可以使用约 7-10ng/ml)血清纤连蛋白或其它适合的基质包被的培养皿上。将细胞 在达尔伯克氏必需基本培养基(Dulbecco’s Minimal Essential Medium， DMEM)或其它适合的细胞培养基中维持，添加约1-50ng/ml(可以 使用约5-15ng/ml)血小板源生长因子-BB(PDGF-BB)，约1-50ng/ml (可以使用约5-15ng/ml)表皮生长因子(EGF)，约1-50ng/ml(可以 使用约5-15ng/ml)胰岛素样生长因子(IGF)或约100-10,000IU(可 以使用约1,000IU)LIF，约10^-10至10^-8M地塞米松或其他适合的类 固醇，约2-10μg/ml亚油酸和约0.05-0.15μM抗坏血酸。其他适合的培 养基包括，例如，MCDB、MEM、IMDM和RPMI。细胞可以在不含 血清、含约1-2％胎牛血清或者例如含约1-2％人AB血清或自体血清 的环境中维持。

当大约每3天以约2×10³细胞/cm²的浓度重新播种，一般可以获 得超过40次的细胞倍增，有些群经过了超过70次的细胞倍增。起始 的20-30次细胞倍增的细胞倍增时间为约36-48小时。之后细胞倍增时 间延长到了60-72小时之久。

MAPC的端粒长度在约11-13KB之间，所述MAPC来自于5个 供体(年龄在约2岁至约55岁之间)，以大约2×10³细胞/cm²的密度 重新播种培养，经过约23-26次细胞倍增。这比从相同供体获得的血 液淋巴细胞的端粒长度长约3-5KB。分别在约23和约25次细胞倍增 后评估的来自2个供体的细胞端粒长度，以及约35次细胞倍增后评估 的细胞端粒长度都没有变化。这些MAPC的核型是正常的。

处于U.S.10/048,757所述条件下的人MAPC的表型

用FACS对约22-25次细胞倍增后获得的人MAPC进行的免疫表 型分析表明所述细胞没有表达CD31、CD34、CD36、CD38、CD45、 CD50、CD62E和-P、HLA-DR、Muc 18、STRO-1、cKit、Tie/Tek； 并且表达了低水平的CD44、HLA-I类和β2-微球蛋白，并表达了CD10、 CD13、CD49b、CD49e、CDw90、Flk1(N＞10)。

一旦细胞在以约2×10³/cm²重新播种的培养基中经历了超过40次 的倍增，表型就会变得更加同质并且没有细胞会表达HLA-I类或CD44 (n＝6)。当细胞以更高的汇合生长时，它们会表达高水平的Muc18、 CD44、HLA I类和β2-微球蛋白，这一点类似于所述的MSC(N＝8) 的表型(Pittenger，1999)。

免疫组织化学表明以约2×10³/cm²的播种密度生长的人MAPC会 表达EGF-R、TGF-R1和-2、BMP-R1A、PDGF-R1a和-B，以及一小 亚群(在约1和约10％之间)用抗SSEA4抗体染色的MAPC(Kannagi， R 1983)。

利用Clontech cDNA测定法测定了以约2×10³细胞/cm²的播种密 度培养了约22和约26次细胞倍增的人MAPC的基因表达情况：

A.MAPC不表达CD31、CD36、CD62E、CD62P、CD44-H、cKit、 Tie；IL1、IL3、IL6、IL11、G CSF、GM-CSF、Epo、Flt3-L或CNTF 的受体；和低水平的HLAI类、CD44-E和Muc-18mRNA。

B.MAPC表达细胞因子BMP1、BMP5、VEGF、HGF、KGF、 MCP1的mRNA；细胞因子受体Flk1、EGF-R、PDGF-R1α、gp130、 LIF-R、活化素-R1和-R2、TGFR-2、BMP-R1A；粘着受体CD49c、 CD49d、CD29；和CD10。

C.MAPC表达hTRT和TRF1的mRNA；POU结构域转录因子 oct-4、sox-2(oct-4和sox-2是维持ES/EC未分化状态所需的，Uwanogho D.1995)、sox-11(神经发育)、sox-9(软骨形成)(Lefebvre V.1998)； 同源结构域转录因子：Hoxa4和-a5(颈和胸骨骼特化；呼吸道的器官 发生)(Packer，A.I.2000)，Hox-a9(成髓作用)(Lawrence，H.1997)、 Dlx4(头部前脑和周围结构的特化)(Akimenko M.A.1994)、MSX1 (胚胎中胚层、成体心脏和肌肉、软骨和骨生成)(Foerst-Potts，L. 1997)、PDX1(胰腺)(Offield，M.F.1996)。

D.RT-PCR确认了Oct-4、LIF-R和hTRT mRNA的存在。

E.此外，RT-PCR显示MAPC中表达了Rex-1mRNA和Rox-1 mRNA。

来自人和鼠骨髓以及来自鼠肝和脑的MAPC中表达了Oct-4、 Rex-1和Rox-1。人MAPC表达了LIF-R并可以用SSEA-4阳性染色。 最后，人们发现在培养超过30次细胞倍增的人MAPC中Oct-4、LIF-R、 Rex-1和Rox-1mRNA的水平会升高，这会产生表型更加同质的细胞。 相比而言，以高密度培养的MAPC不会表达这些标记。这伴随着约 40次细胞倍增前的衰老以及无法分化成为除成软骨细胞、成骨细胞和 脂肪细胞外的细胞。

如U.S.10/048,757所述培养MAPC

根据本文所述分离的MAPC可以用本文和U.S.10/048,757中公开 的方法来培养，这些方法通过引用的方式纳入本文。

简言之，为培养MAPC，优选在低血清或不含血清的培养基中培 养以维持细胞处于非分化的状态。如本文所述，用于培养细胞的无血 清培养基添加如表1所述的添加物。人MAPC不需要LIF。

表1

  胰岛素   约10-50μg/ml(约10μg/ml)*   转铁蛋白   约0-10μg/ml(约5.5μg/ml)   硒   约2-10ng/ml(约5ng/ml)   牛血清白蛋白(BSA)   约0.1-5μg/ml(约0.5μg/ml)   亚油酸   约2-10μg/ml(约4.7μg/ml)   地塞米松   约0.005-0.15μM(约0.01μM)   L-抗坏血酸2-磷酸   约0.1mM   低葡萄糖DEME(DEME-LG)   约40-60％(约60％)   MCDB-201   约40-60％(约40％)   胎牛血清   约0-2％   血小板源生长因子   约5-15ng/ml(约10ng/ml)   表皮生长因子   约5-15ng/ml(约10ng/ml)   胰岛素样生长因子   约5-15ng/ml(约10ng/ml)   白血病抑制因子   约10-10,000IU(约1,000IU)

*括号中给出了优选浓度

将约10ng/mL LIF加入到人MAPC中不会影响短期细胞生长(在 25次细胞倍增前细胞倍增时间相同，Oct 4(Oct 3/4)表达的水平)。 相比于使用人细胞所看到的情况，当将新鲜鼠髓单核细胞(在第0天 时耗尽CD45⁺细胞)置于MAPC培养基中时，没有看到生长。当将鼠 髓单核细胞置于MAPC培养基中并且培养14天，然后耗尽CD45⁺细 胞时，细胞的形态和表型类似于人MAPC的情况。这表明需要造血细 胞分泌的因子来支持鼠MAPC的初始生长。当用PDGF-BB和EFG 单独培养时，细胞倍增缓慢(超过6天)而且不能维持培养物超过约 10次细胞倍增。加入约10ng/mL LIF显著增强了细胞生长。

一旦在培养基中得以建立，可以用含约40％FCS和约10％DMSO 的DMEM将细胞冷冻并储存为冷冻储液。其它制备培养细胞冷冻储 液的方法也是本领域技术人员可以实现的。

因此，MAPC可以在本领域可得到的培养基中维持并扩增。这类 培养基包括但不限于达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s MediumDMEM)、DEME F12培养基伊格尔氏 最低限度必需培养基F-12K培养基Iscove’s改良的达尔伯克氏 培养基RPMI-1640培养基很多培养基也可以用低葡萄糖配方， 含有或不含丙酮酸钠。

也应当考虑的是使用哺乳动物血清添加的细胞培养基。血清通常 包含存活和扩增所需的细胞因子和组分。血清的实例包胎牛血清 (FBS)、牛血清(BS)、小牛血清(CS)、胎牛血清(FCS)、新生牛 血清(NCS)、山羊血清(GS)、马血清(HS)、人血清、鸡血清、猪 血清、绵羊血清、兔血清、血清替代品和牛胚胎液。应当理解的是如 果认为需要失活补体级联组分，血清可以在约55-65℃下被热失活。

还可以方便地利用附加的添加物来向细胞提供微量元素，以支持 细胞达到最优生长和扩增。这类添加物包括胰岛素、转铁蛋白、硒化 钠和其组合物。这些组分可以被包含于盐溶液中，例如但不局限于 Hanks’平衡盐溶液(HBSS)、Earle’s盐溶液抗氧化剂添加物、 MCDB-201添加物、磷酸盐缓冲液(PBS)、抗坏血酸和抗坏血酸-2- 磷酸，以及附加的氨基酸。许多细胞培养基已经包含氨基酸，但是一 些需要在培养细胞前添加。这类氨基酸包括但不限于L-丙氨酸、L-精 氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、 L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨 酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L- 色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。本领域技术人员能够很好地确定这些 添加物的适合浓度。

抗生素也通常被用于细胞培养中以减轻细菌、支原体和真菌污染。 通常，所用的抗生素或抗真菌化合物为青霉素/链霉素的混合物，但是 也可以包括但不限于两性霉素(Fungizone)、氨苄西林、艮他霉素、 博来霉素、潮霉素、卡那霉素、丝裂霉素、麦考酚酸、萘啶酸、新霉 素、制霉菌素、巴龙霉素、多粘菌素、嘌呤霉素、利福平、大观霉素、 四环素、泰乐菌素和博来霉素(zeocin)。抗生素和抗真菌添加剂与所 要进行的工作类型有一定的关系。一种可能出现的情况是一种含有抗 生素的培养基，其中细菌仍旧存在于培养基中，但是抗生素的作用是 作为抑菌剂而不是杀菌机制。而且，抗生素能够干扰某些细胞类型的 代谢。

激素也可以被方便地用于细胞培养中，包括但不限于D-醛固酮、 己烯雌酚(DES)、地塞米松、β-雌二醇、氢化可的松、胰岛素、促乳 素、孕酮、促生长素抑制素/人生长激素(HGH)、促甲状腺激素、甲 状腺素和L-甲腺原氨酸。

根据细胞类型和分化细胞的命运，脂质和脂质载体也可以被用于 添加细胞培养基。这类脂质和载体可以包括但不限于环糊精(α、β、γ)、 胆固醇、与白蛋白缀合的亚油酸、与白蛋白缀合的亚油酸和油酸、未 缀合的亚油酸、与白蛋白缀合的亚油-油-花生四烯酸、未与白蛋白缀 合和与白蛋白缀合的油酸，以及其它脂类。

还考虑到使用饲养细胞层。饲养细胞被用于支持需要复杂营养来 培养的细胞的生长，包括干细胞。饲养细胞是用γ-射线失活的正常细 胞。培养过程中，所述饲养层充当其他细胞的基底层和提供细胞因子， 其本身不会进一步生长或分裂(Lim，J.W.and Bodnar，A.，2002)。饲 养层细胞的实例通常为人二倍体肺细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、瑞士 小鼠胚胎成纤维细胞，但也可以是任何有丝分裂期后的能够提供细胞 组分和因子的细胞，所述细胞组分和因子有助于实现干细胞的最优生 长、存活和扩增。在许多情况下，饲养细胞饲养细胞层不是使ES处 于未分化的增殖态所必需的，因为白血病抑制因子(LIF)具有抗分 化的性质。因此，可以使用含有LIF的添加物来维持一些物种MPAC 的未分化态。

培养中的细胞可以被维持于悬浮液中或附着到固体支持物上，如 细胞外基质组分和合成的或生物聚合物。干细胞通常需要能促使它们 附着到固体支撑物上的附加因子，如I型、II型和IV型胶原、刀豆素 A、硫酸软骨素、纤连蛋白、“超纤连蛋白”和纤连蛋白样聚合物、明 胶、层粘连蛋白、聚D和聚L-赖氨酸、凝血酶敏感素和玻璃粘连蛋白。

干细胞的维持条件也可以包括使得干细胞(如MAPC)维持于未 分化形式的细胞因子。细胞必需处于自我更新的未分化态的条件有利 地为培养基含有表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、 白血病抑制因子(LIF；在选定的物种中)和其组合物。对本领域技术 人员来说显而易见的是，在分化前要从培养基中移除使细胞自我更新 但不分化的添加物。

干细胞系和其他细胞可以从与另一种细胞类型的共同培养中获 益。这类共同培养的方法源于一种现象，即某些细胞可以提供尚未识 别的细胞因子，所述尚未识别的细胞因子可以使得所述干细胞分化成 为特定的谱系或细胞类型。这些细胞因子也能够诱导细胞表面受体的 表达，其中某些可以很容易地被单克隆抗体识别。一般而言，选择用 于共同培养的细胞应基于本领域技术人员希望诱导的细胞系类型，而 且技术人员能够选择适合的用于共同培养的细胞。

MAPC和分化自MAPC的淋巴造血细胞可用作特定淋巴造血谱系 的细胞源。可以通过将MAPC与适合的因子或基质细胞或其他细胞一 起培养来影响MAPC的成熟、增殖和分化，所述因子包括但不限于红 细胞生成素(EPO)、集落刺激因子(如GM-CSF、G-CSF或M-CSF、 SCF)、白介素(如IL-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-13等)，所述 其他细胞能够分泌负责干细胞再生、定型和分化的因子。

在一个实施方案中，如本文下述实施例2中所述，人和小鼠MAPC 在体外能够分化成为造血细胞，如造血干细胞或祖细胞。MAPC(包 括人MAPC)体外造血分化的方法如U.S.10/048,757 (PCT/US00/21386，2000年8月4日提交)和U.S.10/467,963 (PCT/US02/04652，2002年2月14日提交)中所述，这些方法通过 引用的方式纳入本文。

识别和随后将分化细胞从未分化对应细胞中分离的方法可以用为 本领域已知的方法实施。已经被诱导分化的细胞可以通过在一定条件 下选择性地培养细胞来识别，所述条件使得分化的细胞数目超过未分 化的细胞。类似地，分化的细胞可以通过形态改变和不存于其未分化 对应细胞中的特征来识别，所述特征如细胞大小、细胞突起的数目(即 树突和分支的形成)和胞内细胞器分布的复杂度。还考虑了通过细胞 表达的特异性细胞表面标记(如细胞受体和跨膜蛋白)来识别分化细 胞的方法。针对这些细胞表面标记的单克隆抗体可以被用于识别分化 细胞。可以通过荧光活化的细胞分选(FACS)和酶联免疫吸附测定 (ELISA)来进行这些细胞的检测。从特定基因转录上调的观点来看， 分化细胞通常表现出与未分化细胞不同的基因表达水平。反转录聚合 酶链式反应(RT-PCR)也可以用于监测分化造成的基因表达的变化。 此外，使用微点阵技术的全基因组分析也可以用于识别分化细胞。

因此，一旦分化细胞被识别出来，如果需要的话，就可以将它们 从其未分化的对应细胞中分离出来。上面详述的识别方法也提供了分 离的方法，如FACS、偏向性细胞培养方法、ELISA、磁珠和其组合。 本发明一个优选的实施方案预计了基于细胞表面抗原表达时，FACS 在识别和分离细胞中的应用。

其他培养方法

在其他实验中，发现MAPC的培养密度可以从约100细胞/cm²或150细胞/cm²变化到约10,000细胞/cm²，包括从约200细胞/cm²到约1500细胞/cm²到约2000细胞/cm²。所述密度在物种之间也是可 变的，此外，最优密度也可以根据培养条件和细胞来源而变化。普通 的技术人员能够决定对于给定的一组培养条件和细胞的最优密度。

少于约10％(包括约3-5％)的有效空气氧浓度也可被用于培养 的MAPC分离、生长和分化过程中的任意时刻。

MAPC和其子细胞在淋巴造血系统中的用途

MPAC可以是HSC的一个替代源，以用于治疗先天性或获得性淋 巴造血障碍，或者在使用相同细胞或其分化子细胞治疗适用于MAPC 衍生疗法的障碍前确立嵌合状态。MAPC在体内和体外都具有淋巴造 血分化能力。如下述实施例中所述，当在存在细胞因子的情况下，将 鼠MAPC与E11.5胚胎肝饲养细胞、EL08-1D2共同培养约2周，然 后用集落形成细胞(CFC)测定法培养时，检测到了红细胞爆式集落 形成单位(BFC-E)和混合的集落形成单位(CFU-Mix)克隆。当鼠 GFP转基因MAPC被移植到NOD-SCID鼠体内时，在约20周后在骨 髓(BM)中检测到了最高达约90％的GFP⁺CD45⁺细胞，以及髓细胞、 B-和T-淋巴细胞的分化，所述NOD-SCID鼠是用约275cGy辐射并用 抗NK抗体处理过的。类似地，当人MAPC被移植到NOD-SCID鼠 体内时，观察到了淋巴造血移植物。因此，HSC可以由鼠和人MAPC 在体内和体外生成。这一方法可以被用于辐射防护以及长期提供淋巴 造血系统群。

因此，MAPC是用于治疗淋巴造血障碍的干细胞的极有价值的来 源，所述淋巴造血障碍包括但不限于先天性和获得性恶性和良性淋巴 造血障碍。本发明的方法和组合物涉及MAPC和其子细胞的形成和用 于给各种淋巴造血组织提供淋巴造血细胞。在一个实施方案中，MAPC 或其子细胞可用于治疗淋巴造血障碍。“淋巴造血障碍”指淋巴造血系 统的任何疾病或障碍。这一系统包括脾、胸腺、淋巴结、血液(例如 外周血；PB)和骨髓(BM)。

在一个实施方案中，淋巴造血障碍包括但不限于：

-白血病(白血病是一种免疫系统的癌症，其细胞被称为白血球或 白细胞)，包括但不限于急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、 急性成髓细胞性白血病(AML)、急性双表型白血病、急性未分化白 血病、慢性白血病、慢性成髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴性白 血病(CLL)、青少年慢性髓细胞性白血病(JCML)、青少年骨髓单 核细胞性白血病(JMML)；

-骨髓增生异常综合征(骨髓增生异常有时也称白血病前期)，包 括但不局限于顽固性贫血(RA)、环形铁粒幼红细胞性顽固性贫血 (RARS)、未成熟细胞过多的顽固性贫血(RAEB)、转化型原始细胞 过多性顽固性贫血(RAEB-T)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)；

-淋巴瘤(淋巴瘤是一种在血液和淋巴管中循环的白血球癌症)， 包括但不局限于何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin′s Lymphoma)、非何杰金 氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′s Lymphoma)；

-遗传性红细胞(红血球)异常(红细胞含有血红蛋白并将氧运载 到身体)，包括但不限于重度β地中海贫血(又称库利氏贫血)、布- 戴二氏贫血综合征(Blackfan-Diamond Anemia)、纯红细胞再生障碍、 镰状细胞病；

-其它的血细胞增殖障碍，包括但不限于贫血(贫血是红细胞缺陷 或畸形)包括但不限于重度再生障碍性贫血、先天性红细胞生成不良 性贫血和范可尼贫血、从由意外射线照射导致的或由肿瘤治疗中用于 骨髓移植的辐射或化学处理预导致的贫血中康复、阵发性夜间血红蛋 白尿(PNH)。

-遗传性血小板异常(血小板是凝血所需的小血细胞)，包括但不 限于巨核细胞缺乏/先天性血小板过少、血小板无血症(Glanzmann thrombasthenia)、骨髓增生障碍、急性骨髓纤维化、特发性髓细胞外 化生(骨髓纤维化)、真性红细胞增多症、特发性血小板增多症；

-遗传性免疫系统障碍，包括但不限于重度联合免疫缺陷病(SCID) 包括但不限于腺苷脱氨酶缺陷性SCID(ADA-SCID)、X-连锁SCID、 T&B细胞缺乏性SCID、B细胞正常但T细胞缺乏性SCID、Omenn 综合征、嗜中性粒细胞减少症包括但不限于Kostmann综合征、先天 性骨髓粒细胞缺乏症、共济失调性毛细血管扩张症、裸淋巴细胞综合 征、常见的可变型免疫缺乏、迪格奥尔格综合征(DiGeorge Syndrome)、 白细胞粘附缺陷；

-淋巴增生性障碍(LPD)，包括但不限于淋巴增生性障碍、X-连 锁(也称爱泼斯坦-巴尔病毒易感性(Epstein-Barr Virus Susceptibility))、威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich Syndrome)；

-吞噬细胞障碍(吞噬细胞是可吞食和杀死外来有机体的免疫系统 细胞)，包括但不限于切-东二氏综合征(Chediak-Higashi Syndrome)、 慢性肉芽肿病、中性粒细胞肌动蛋白缺陷、网状细胞发育不全；和

-骨髓中的癌症(浆细胞障碍)，包括但不限于多发性骨髓瘤、浆 细胞性白血病、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s Macroglobulinemia)。

其它的可以用MAPC或其衍生子细胞治疗的淋巴造血疾病的实例 包括但不限于移植物抗宿主病(GVHD)、自身免疫性疾病、凝血功能 障碍/凝血因子缺乏症如血友病、地中海贫血(thalassemia)、慢性肉 芽肿病和溶酶体贮积症/酶缺陷如戈谢病(Gaucher disease)。MAPC 也可用于嵌合免疫系统的产生，使得宿主接受供体器官或组织移植物 (耐受性)，例如胰岛移植、心脏或肾移植。MAPC也可用于供体或 嵌合免疫系统的产生，使得可以修复遗传性基因缺陷，如镰状细胞贫 血。此外，MAPC可用于替代宿主免疫系统以治疗自身免疫性疾病， 如狼疮、重症肌无力、多发性硬化、类风湿性关节炎或糖尿病。

例如，通过使用MAPC疗法，受试者可以在HSC态前就部分地 或全部地恢复淋巴造血功能。因此使用MAPC可以提供比现在用于自 身免疫障碍的CD34⁺移植更好的治疗效果，因为新训练出来的T细胞 不会有自身免疫。因此，可以在CD34⁺细胞态形成前使用MAPC，从 而产生新形成的T细胞。

MAPC或其分化子细胞可用于基因疗法。可在自体、同种异体或 异种MAPC或其分化子细胞中引入和表达表达载体，或者用本领域已 知的方法通过同源或非同源重组来修饰所述细胞的基因组。通过这种 方式可以修正个体的基因缺陷。例如，可以修正的疾病包括但不限于 β-地中海贫血、镰状细胞贫血、腺苷脱氨酶缺陷或重组酶缺陷。

此外，可以在MAPC或其分化子细胞中表达核酶、反义RNA或 蛋白质以抑制特定基因产物的表达或活性。药物抗性基因包括但不限 于可以引入MAPC或其分化子细胞以使得他们能够经受住药物疗法 的多药抗性(MDR)基因。对于淋巴造血病原体如HIV或HTLV-I 和HTLV-II，MAPC或其分化子细胞可通过基因修饰来产生反义RNA、 核酶或蛋白质，所述反义RNA、核酶或蛋白质可以预防病原体在 MAPC或其分化子细胞中增殖。也可以用本领域技术人员已知的方法 来使特定的基因序列不能表达或调节其表达，所述方法包括但不局限 于直接地取代、通过非同源或同源重组来缺失或加入DNA，或间接地 通过反义序列。

MAPC或其分化子细胞可以作为骨髓移植的移植物来治疗恶性骨 髓衰竭状态和先天性代谢、免疫或淋巴造血障碍。例如，从受试者身 上获取骨髓样品并分离MAPC。然后可以在体外对MAPC进行扩增并 将它用作自体骨髓移植的移植物。或者，在移植前，可以在活体外将 MAPC分化为淋巴造血细胞。可以在移植前对MAPC或其分化子细胞 进行基因操作。通常在受试者接受治疗性放化疗后，将细胞注入。

扩增的细胞也可用于妊娠的前三个月中的子宫内移植。患有代谢 或淋巴造血障碍的胎儿可以在出生前就被诊断出来。骨髓可以获自正 常个体，MAPC可以获得并在体外扩增。然后将MAPC通过例如子宫 内注射来给予胎儿。或者，可以在移植前将MAPC分化成为淋巴造血 细胞。可以在移植前对MAPC或其分化子细胞进行基因操作。因此， 将会形成嵌合体，所述嵌合体会导致临床异常的全部或部分缓解。

淋巴造血功能可以通过本领域技术人员可实现的任何方法来检 测。存在许多本领域技术人员能够实现的测定/测验血液功能的测试。 例如，CBC(全血细胞计数)是一种常用的提供血液中三种细胞(红 血球、白血球和血小板)详细信息的血液测试。此外，可以使用荧光 活化的细胞分选(FACS)。FACS分析可以用于检测任何的造血细胞 群(例如T细胞、B细胞、粒细胞、巨噬细胞、T或B细胞的未成熟 群、红血球)。也可以使用CFU-S测定法。也可以测定红血球或其参 数，如测定血红蛋白浓度、红血球计数或红血球半衰期的测试。被治 疗的受试者体内的淋巴造血功能可以与淋巴造血功能的对照值进行比 较。在一个实施方案中，对照值是从正常受试者身上获得的(不需要 治疗的受试者)。在另一个实施方案中，对照值是从治疗前或治疗后某 个时间间隔时的受试者身上获得的。

MAPC也可用于在动物(例如免疫缺陷小鼠)体内建立人免疫系 统，所述动物用于但不局限于：1)筛选调节人淋巴造血功能的试剂(例 如生物制剂或小分子)；2)筛选测试用于人疫苗生产的潜在抗原；3) 生产用于体液免疫或传染性疾病治疗的人抗体(通过抗原刺激动物)； 或4)生产具有细胞毒性、辅助细胞或调控性质的抗原特异性T细胞。

MAPC给药

将MAPC或其分化子细胞通过各种本领域可实现的方法来给予受 试者，包括但不限于局部注射、导管给药、全身注射、腹膜内注射、 非消化道给药、口服给药、颅内注射、动脉内注射、静脉注射、心室 内融合、胎盘内注射、子宫内注射、外科的心肌内注射、经心内膜注 射、经血管注射、冠状动脉内注射、经血管注射、肌内注射、外科注 射到研究的组织中或通过直接施加到组织表面(例如在外科手术过程 中或在伤口上)。

通过循环系统，MPAC可以外周或局部给药。干细胞的“归巢”会 将移植的细胞集中到对它们的生长和功能有利的环境中。对患者进行 的用细胞因子促进归巢的预治疗是本发明方法的另一种可预期的替代 方法。某些细胞因子(例如诱导或增强细胞运动的细胞因子，所述细 胞运动如MAPC或其它干细胞、祖细胞或分化细胞的归巢)能够增强 MAPC的迁移。细胞因子包括但不限于基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、 干细胞因子(SCF)、血管生成素-1、胎盘衍生生长因子(PIGF)和粒 细胞-集落刺激因子(G-CSF)。细胞因子也包括任何能促进内皮黏附 分子表达的因子，如ICAM、VACM和其它能促进归巢过程的因子。

当使用分化因子(例如促进淋巴造血细胞形成的因子)时，MAPC 分化成为所需组织表型特征的能力会增强。

可以通过血管生成作用来增强新形成组织的存活能力。促进血管 生成的因子包括但不限于VEGF、aFGF、血管生成素、血管紧张素-1 和-2、β细胞素、bFGF、因子X和Xa、HB-EGF、PDGF、血管调节 素、促血管素、血管生成素-1、前列腺素E1和E2、类固醇、肝素、 1-丁酰-丙三醇和烟酰胺。

能够降低凋亡的因子也能促进新组织的形成，如淋巴造血组织。 能够降低凋亡的因子包括但不限于β-阻滞剂、血管紧张素-转化酶抑制 因子(ACE抑制因子)、AKT、HIF、卡维地洛(carvedilol)、血管紧 张素II 1型受体拮抗剂、半胱天冬酶(caspase)抑制因子、卡立泊来 德(cariporide)和依尼泊胺(eniporide)。

在一个实施方案中，一种或多种促进淋巴造血功能的因子(如生 物制剂，包括EPO，或者小分子)可以在MAPC或其分化子细胞给 药之前、之后给药或者与之一起给药。

外源因子(例如细胞因子、分化因子(例如细胞因子，如能诱导 细胞系定型的生长因子或血管生成因子)、血管生成因子和抗凋亡因 子)可以在MAPC或其分化子细胞给药之前、之后给药或者与之一起 给药。例如，一种共同给药的形式包括在给药前将所研究的因子与 MAPC悬浮培养基组合。给药形式是可变的，可以包括首次给药及之 后的后续给药。

一种潜在地增加细胞存活率的方法是将MAPC或子细胞掺入到生 物聚合物或合成聚合物中。根据患者的情况，由于瘢痕形成或其它的 障碍物，注射的位置可能不适于细胞接种和生长。生物聚合物的实例 包括但不限于纤连蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、胶原和蛋 白聚糖。其构成可以包括或不包括细胞因子、分化因子、血管生成因 子或抗凋亡因子。此外，这些都可以是悬浮形式。另一种替代品是三 维凝胶，细胞包埋于细胞生物聚合物混合物的间隙中。细胞因子、分 化因子、血管生成因子、抗凋亡因子或其组合可以包含于凝胶中。这 些都可以经由本文所述的各种途径通过注射的方式来使用。

在目前的自体单核骨髓细胞的人体研究中，已经使用了范围从约 1至4×10⁷细胞的实验剂量。然而，不同方案可能需要优化给予的细 胞量。因此，所给予的细胞量会随所要治疗的受试者而变化。在一个 优选的实施方案中，可以给予人受试者约10⁴至10⁸之间，更优选地约 10⁵至10⁷之间，最优选地约3×10⁷个干细胞且任选地约每天50至 500μg/kg的细胞因子。然而，关于多少可以被认为是有效剂量的精确 测定应该基于每个患者的个体因素，包括他们的体型、年龄、疾病或 损伤、损坏的量、从损伤发生开始至今的时间和与给药模式相关的因 素(直接注射-较低剂量，静脉内-较高剂量)。本领域技术人员根据本 公开内容和本领域的知识可以很容易地确定剂量。

干细胞应用的一个问题是分离出的干细胞群的纯度。例如骨髓细 胞包括混合的细胞群，它可以被纯化到足够产生所需效果的程度。本 领域技术人员利用各种公知的方法能够很容易地确定MAPC占一个 群中的百分比，如荧光活化的细胞分选(FACS)。含MAPC或其分化 子细胞群的优选纯度范围为约50-55％、约55-60％和约65-70％。更优 选的纯度范围为约70-75％、约75-80％、约80-85％；最优选的纯度为 约85-90％、约90-95％和约95-100％。然而，也可用较低纯度的群， 如约25-30％、约30-35％、约35-40％、约40-45％和约45-50％。MAPC 的纯度可以根据一个群中的基因表达情况来确定。本领域的技术人员 能够很容易地调整剂量(例如纯度的下降可能会需要剂量的增加)。

技术人员可以很容易地确定本发明方法中要给予的组合物中细胞 和任选添加剂、赋形剂或载体的量。通常，添加剂(除活性干细胞或 细胞因子)为溶于磷酸盐缓冲液的0.001至50wt％的溶液，活性成分 以微克至毫克的数量级存在，如约0.0001至约5wt％、优选地约0.0001 至约1wt％、最优选地约0.0001至约0.05wt％或约0.001至约20wt％、 优选地约0.01至约10wt％和最优选地约0.05至约5wt％，当然，对 于要给予动物或人的任何组合物，以及对于任何特定的给药方法，优 选地应确定：毒性，如通过在适合的动物模型(例如啮齿目动物，如 小鼠)中测定致死量(LD)和LD₅₀；和组合物的剂量、其中组分的浓 度和给予组合物周期，这些会引发适当的应答。根据技术人员的知识、 本公开内容和本文所引用的文献，这些测定不会需要过多实验。而且 顺序给药时间的确定也不需要过多实验。

当给予本发明的治疗组合物时，通常配制为可注射的单位剂量形 式(溶液、悬浮液、乳剂)。适合注射的药物制剂包括无菌水性溶液和 分散系。所述载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、盐水、磷酸 盐缓冲液、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、液体聚乙二醇等等)和它 们适合的混合物。

此外，可以加入各种增强组合物的稳定性、无菌度和等渗性的添 加剂，包括抗菌性防腐剂、抗氧剂、螯合剂和缓冲液。通过抗细菌和 抗真菌试剂来确保可以预防微生物的作用，所述抗细菌和抗真菌试剂 如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等等。在许多情况下， 需要包括等渗剂，如糖、氯化钠等等。可注射药物形式的延长吸收可 以通过使用延缓吸收的试剂来实现，例如单硬脂酸铝和明胶。根据本 发明，所用的任何赋形剂、稀释剂或添加剂都必须是与细胞相容的。

无菌注射溶液可以通过将本发明所用的细胞按所需的适合溶剂量 与各种量的其它所需成份混合来制备。

在一个实施方案中，可以首次给予MAPC或其分化子细胞，此后 通过进一步给予MAPC或其分化子细胞来维持。例如，MAPC可以通 过注射的方法来给予，此后通过不同或相同类型的方法来进一步给予。

应当注意到的是人受试者的治疗时间要比犬类或其他实验动物 长，所以疗法具有正比于疾病过程和功效持续时间的治疗时间。所述 剂量可以是几天时间的单剂量或多剂量。因此，本领域的技术人员利 用本公开内容和本文引用的文献中的技术及本领域的公知常识，不需 要过多实验就可以从动物(例如大鼠、小鼠、犬类等等)实验按比例 增大到人。本疗法通常具有正比于疾病过程和药物功效持续时间以及 正在被治疗的受试者的治疗时间。

包含MAPC或其分化子细胞的组合物的实例包括用于给药的液体 制剂(包括悬浮液)和用于直接或静脉内给药的制剂(例如可注射的 给药)，如无菌悬浮液或乳剂。这些组合物可以与适合载体、稀释剂或 赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)的混合物。所述 组合物也可低压冻干。根据给药途径和所需制剂，所述组合物可以包 含辅助物质如湿润剂、乳化剂、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、 防腐剂、芳香剂、颜料等等。标准文本(如“REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE”第17版，1985，通过引用的方式纳 入本文)可被用于查阅制备适合的制剂而不需要过多实验。

本发明的组合物可以方便地以液体制剂的形式提供，如等渗水性 溶液、悬浮液、乳剂或粘稠组合物，所述液体制剂可以被缓冲到选定 的pH。液体制剂通常比凝胶、其它粘稠组合物和固体组合物容易制备。 此外，液体组合物更容易给药，特别是通过注射。另一方面，粘稠组 合物可以适合的粘度范围配制，以提供与特定组织的更长的接触期。

适合载体和其他添加剂的选择将依赖给药的准确途径和具体剂型 的性质，例如液态剂型(例如组合物是否被配制成为溶液、悬浮液、 凝胶或其他液体形式，如时间释放形式或液体填充形式)。

除细胞外，溶液、悬浮液和凝胶通常主要包含水(优选纯化的无 菌水)。也可存在少量的其他成分如pH调节剂(例如，如NaOH的碱)、 乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、湿润剂和胶凝剂(例如甲基纤维 素)。所述组合物可以是等渗的，即它们具有与血液和泪液相同的渗透 压。

本发明组合物所需的等渗度可以使用氯化钠或其它可药用试剂来 实现，所述可药用试剂如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其他无 机或有机溶质。对于含钠离子的缓冲液来说，氯化钠为特别优选的。

如果需要的话，可以使用可药用的增稠剂来将组合物粘度维持在 选定的水平。优选甲基纤维素，因为它容易购得、价格便宜且容易使 用。其它适合的增稠剂包括，例如，黄单胞菌胶、羧甲基纤维素、羟 丙基纤维素、卡波姆(carbomer)等等。优选的增稠剂浓度取决于选 定的试剂和所需的粘度。粘稠组合物通常通过在溶液中加入这类增稠 剂来制备。

可以使用可药用的防腐剂或细胞稳定剂来延长组合物的寿命。优 选地，如果需要防腐剂的话，技术人员能够选择不会影响本发明所述 的MAPC或子细胞的活力或功效的组合物。

本领域技术人员会认识到组合物的组分应当选择化学惰性的。对 于化学和药物原理领域的技术人员来说这不会存在问题，或者通过参 考标准课本或简单实验(不包括过多实验)、本公开内容和本文引用的 文献就能很容易地解决问题。

考虑到特定患者的年龄、性别、体重和身体状况和用于给药的组 合物形式(例如固体与液体)这类因素，组合物可以按照剂量并通过 医药和兽医领域技术人员可实现的技术来给药。技术人员根据本公开 内容、本文所引用的文献和本领域的常识，不需要过多实验就可以确 定人或其他动物的药量。

用于首次给药和进一步给药或用于顺序给药的适合方案也是可变 的，可以包括首次给药，然后顺序给药；但是，技术人员根据本公开 内容、本文所引用的文献和本领域的常识可以确定给药方案。

预防免疫排斥的移植方法

在一些实施方案中，移植或给药前可能需要对MAPC(或分化子 细胞)进行处理或其他调整以降低激发宿主对移植细胞产生免疫应答 的风险。可以采用本领域已知的降低激发宿主产生免疫应答风险的任 何方法。下面提供了一些这类实例：

1.通用供体细胞：MAPC被处理成为通用供体细胞。尽管未分化 的MAPC不能表达MHC-I或-II抗原，一些分化的子细胞可以表达这 些抗原的一种或两种。通过消除MHC-I或MHC-II抗原并潜在地引入 来自预期受体的MHC抗原可以将MAPC修饰成为通用供体细胞，所 述引入来自预期受体的MHC-抗原可使得细胞不会轻易变成NK介导 杀伤目标或变得对不受限的病毒复制或恶性转化易感。可以通过同源 重组或通过在启动子区域引入点突变或通过在抗原的起始外显子中引 入点突变以引入终止子(如用嵌合体(chimeroplast))来实现MHC- 抗原的消除。可以通过反转录病毒、慢病毒、腺伴随病毒或其它病毒 转导或通过用MHC-抗原cDNA转染靶细胞来实现宿主MHC抗原的 传递。

2.子宫内移植以防止发生免疫识别：MAPC可用于子宫内移植， 所述子宫内移植是用于修正基因异常或在免疫系统发育前引入可被宿 主耐受的细胞。这是一种使人细胞大量存在于动物中的方法，或者它 也可以被用作一种通过移植可产生正确蛋白或酶的细胞来修正人胚胎 基因缺陷的方法。

3.免疫识别和耐受：

A.免疫识别

免疫应答是受T细胞上受体(T细胞受体或TCR)与体细胞组织 (I类和II类MHC)之间的分子识别事件控制的。所述TCR/MHC 相互作用是免疫应答的抗原特异性成分，使得能够识别自身和外来抗 原。由于免疫反应仅在T细胞识别了外来或非自身抗原后才会进行， 所以需要额外的信号传导事件来起到预防意外或自体应答的功能 (Buckley，2003)。

免疫识别能够被划分为两个阶段，致敏和二次应答。致敏通过T 细胞的一个亚类即T辅助细胞与特化的免疫细胞(称为树突细胞)群 之间的相互作用来实现。这些树突细胞或抗原呈递细胞(APC)上的 MHC II类复合体所呈递的抗原的T辅助细胞识别对于启动抗体或溶 细胞性T细胞应答起到关键性作用。只有有限数量的细胞会表达MHC II类受体，且这些“专业的”APC特征为不但会用非自身抗原致敏T细 胞，而且会表达细胞因子级联，所述细胞因子级联会调控T细胞扩增 并控制体液和溶细胞性免疫应答。B细胞、巨噬细胞、朗格汉斯细胞 (Langherhans cells)和其它种类的树突细胞会组成APC区室。因此， 只有特化的细胞类型能够发送免疫应答信号，包括同种异体反应活性。

两类MHC受体(I类和II类)的结构基序可使其与细胞中表达 的所有基因产生的短肽区段在细胞内结合。与细胞表面MHC受体结 合的肽复合体是能被TCR识别的分子复合体，并因此提供了T细胞 抗原性识别的特异性(类似于锁钥机制)。一旦所述免疫系统被致敏并 触发，免疫系统细胞会扩增直至抗原被消除，然后处于静息状态或记 忆状态，以待再次遇到该抗原时产生应答。

免疫反应活性的控制是通过级联方式实现的。除T辅助细胞与 APC之间非自身肽的首次识别外，第二阶段是用病原体相关刺激物对 APC进行所需的刺激，例如细菌细胞壁组分如LPS、在B细胞上与表 面Ig交联的病毒粒子；病毒传染相关的双链RNA；或者由物理创伤 或脉管系统受损产生的炎性细胞因子，所有这些都提供了免疫应答所 需的非抗原特异性证据。通过刺激不同细胞因子级联，这些起始信号 的性质也会触发APC来调控体液与细胞应答。

B.耐受

通过消除自体反应T细胞，调控免疫系统的第二级联限制了自体 抗原应答。对于B和T细胞免疫力来说，这是通过调控T辅助细胞群 所有组成成分来实现的，因为这一细胞群决定着致敏反应中反应活性。 T细胞是在骨髓中产生的，并循环到胸腺中以接受“训练”来区分自体 和非自体抗原。在胸腺的个体发育过程中，能够识别自身组织的T细 胞会被去除，以确保带有能与自身抗原反应的T细胞受体复合物 (TCR)的T细胞不会存在于循环系统中。这被称为中心耐受，并且 当中心耐受遭到破坏时会导致自身免疫疾病。

可以引入另一种类型的耐受，它称为外周耐受。当通过胸腺的T 细胞遇到非自身抗原时会完成外周耐受，但是外周耐受不接受来自 APC的第二或共刺激信号，所述信号用于触发辅助或溶细胞性功能。 当APC通过MHC II类受体表达抗原时会发生外周耐受，但是外周耐 受不接受感染或病原体威胁造成的附属信号，因此APC不表达应答所 需的细胞因子级联。以这种方式部分刺激的T细胞是无活性的或凋亡 的。这会导致体液或溶细胞性应答所需的T辅助细胞群的缺失。

另一种形式的外周耐受是当溶细胞性T细胞遇到在MHC I类复合 体中表达非自身抗原的细胞时产生的，所述MHC I类复合体位于大多 数体细胞上。当这些T细胞的TCR在缺少共刺激受体衔接(例如 CD28/CD86相互作用)的情况下与MHC I类衔接时，所述T细胞是 无活性的或凋亡的。存在提供所述第二信号所必需的并且能够提供所 述第二信号的一组第二共刺激受体相互作用，因此细胞的表面表型能 够明显预测免疫刺激或无反应性。

许多肿瘤细胞已经进化出了针对溶细胞性识别的逃逸机制，即通 过下调MHC I类的表达，因此变成免疫系统T细胞武器无法识别的 细胞。许多病毒已经进化出了干扰MHC受体细胞表面表达的特殊机 制，目的是逃脱免疫应答。免疫系统的另一种武器已经进化出来，用 于清除具有这种降低MHC表达性质的肿瘤细胞或病毒感染细胞。一 群被称为天然杀伤或NK细胞的细胞具有能够溶解MHC I类阴性细胞 的活性。这种活性是负调控的。NK细胞通过与所谓的杀伤抑制受体 (KIR)相互作用来结合靶细胞，并且将会开始杀伤，除非通过与MHC I类相互作用来将它关掉。

C.造血嵌合性和耐受诱导

骨髓移植物是癌症疗法所必需的，此时化学疗法试剂和/或放射疗 法会导致宿主免疫系统的骨髓细胞清除(myeloablation)。然后患者会 利用存在于骨髓移植物中的造血干细胞来重建免疫功能，从而从骨髓 供体获得免疫系统的细胞和分子组分。供体免疫系统的重建伴随着个 体发育中见过的自体与非自体抗原训练的重演，借此将供体的免疫系 统耐受到宿主组织中。供体免疫系统重建的另一方面是宿主现在能够 接受来自于原供体的器官或组织移植物而不排斥。

当将较不严格的骨髓细胞清除预处理应用于骨髓移植时，宿主的 免疫系统可能不会被完全清除，而且通过使用适合的免疫抑制处理， 可能会重建起同时包含供体和宿主免疫细胞的嵌合免疫系统。在这一 环境中，宿主耐受供体和宿主二者的细胞和分子组分，并且能够接受 骨髓供体的器官和组织移植物而不排斥。宿主对供体骨髓的排斥以及 供体骨髓导致的移植物抗宿主应答这两者的临床治疗是本治疗方法成 功的关键。移植物抗宿主应答的临床风险是将本方法标准化为标准移 植方法的过程中一个重要且尚未完全解决的风险。这些临床方案最近 受到了显著关注(Waldmann，2004)。

通过干细胞的使用将会带来显著的益处，所述干细胞更够重建不 会带有移植物抗宿主应答风险的免疫系统。所述移植物抗宿主反应是 由骨髓移植物中固有的污染T细胞导致的。尽管从骨髓中纯化造血干 细胞是常规手段，但它们在患者体内的成功移植需要T辅佐细胞作为 伴随物。因此，要在T细胞的有益移植量与移植物抗宿主应答的有害 效应之间达到重要的平衡。

MAPC和ES细胞代表没有移植物抗宿主反应风险的可给药的干 细胞群，因为它们可以扩增，而没有包括T细胞在内的造血细胞类型。 这极大地降低了临床风险。在细胞给药的急性期中NK细胞活性的暂 时消除增加了原始干细胞移植的频率和到达临床可用阈值的造血功能 重建，且没有长期的免疫抑制风险。

当MAPC或ES移植并帮助造血时，新形成的T细胞经历了与上 述宿主T细胞一样的胸腺和外周的自体与非自体训练。新形成的新生 供体T细胞与宿主源T细胞的共同暴露会导致反应活性细胞的相互消 除，因此可以实现对来自MAPC或ES供体的同种异体抗原T细胞表 达的耐受。因此，患者会具有对MAPC或ES供体免疫系统的细胞和 分子组分的耐受性，并且可以接受细胞、组织或器官移植而不排斥。

D.MAPC和其它干细胞类型

上述这种耐受性诱导的机制对于能够实现造血功能重建的细胞类 型来说是独特的。尽管间充质干细胞(也来自骨髓)表现出低免疫原 性并能够存在于同种异体移植治疗中，但是没有实现对供体免疫组分 的耐受。其它的定向干细胞系也没有表现出造血功能重建的潜力。这 些定向干细胞包括神经元干细胞、脂肪源干细胞、肝干细胞等。

Fandrich(2002)已经说明了使用ES细胞能够诱导随后的移植物 接受耐受性。在这一疗法中，伴随着鼠ES细胞类型给药的非去髓性 预处理使得动物能够接受心脏同种异体移植物而不排斥。因此，ES细 胞和MAPC所共有的谱系再生性质可以实现移植耐受，所述再生性质 包括造血功能重建。MAPC代表了临床用于移植耐受的ES细胞的替 代品。

因此，MAPC或ES的给药以及它们成为各种血液细胞类型的分 化能够处理或使受体准备好二次器官或组织移植，所述器官或组织的 组织相容性与所述的MAPC或ES细胞匹配。例如，糖尿病受试者可 以用从例如干细胞库得到的细胞治疗。之后会产生耐受性，然后可以 给所述糖尿病受试者提供获自或源自与所述干细胞相同来源的同种异 体胰岛细胞，这样所述成熟的胰岛就不会被该受体所排斥。本方法适 用于任何二次移植(例如器官、组织和/或细胞移植)，包括但不限于 心脏、肝、肺、肾和/或胰腺。

4.天然杀伤(NK)细胞的功能：

还可以使用任何手段来预防免疫排斥、增加移植物移植或增加免 疫耐受，如能够抑制NK细胞功能的试剂，包括将NK细胞从细胞群 中排除。这种试剂包括抗NK细胞抗体、辐射或任何其他能抑制NK 细胞功能的方法。NK功能抑制在2005年5月5日提交的PCT申请号 为PCT/US2005/015740的专利申请中有进一步描述，该申请中关于在 体内抑制NK细胞以促进干细胞存活的方法的教导通过引用的方式纳 入本文。

因此，本文也提供了增加受试者对MAPC免疫耐受性的方法，包 括给予受试者一群MAPC和有效量的一种能抑制天然杀伤细胞功能 的试剂，使得与没有给予所述抑制试剂的方法相比，对MAPC的免疫 耐受性增加了。

5.基因疗法：

MAPC可以从体内提取并分离，培养时以未分化状态生长或培养 时被诱导分化，并且用各种技术(特别是病毒转导)对MAPC进行基 因改造。基因物质的吸收和表达是可证明的，且发育过程中外源DNA 的表达是稳定的。逆转录病毒和其它用于在干细胞中插入外源DNA的 载体是本领域技术人员可以得到的(Mochizuki，H.et al.1998；Robbins， P.et al.1997；Bierhuizen，M.et al.1997；Douglas，J.et al.1999；Zhang， G.et al.1996)。一旦用逆转录病毒载体转导，增强型绿色荧光蛋白 (eGFP)表达会存在于由分离的MAPC衍生的终末分化的肌肉细胞、 内皮和c-Kit阳性细胞中，这表明引入MAPC的逆转录病毒载体的表 达存在于整个分化过程中。从最初由大约10个eGFP⁺细胞获得的培 养物诱导终末分化，所述eGFP⁺细胞预先由逆转录载体转导并分选几 周进入初始MAPC培养期。

MAPC给药后监测受试者

移植之后，可以监测所给予的MAPC的生长或分化或者MAPC 或子细胞的治疗效果。

给药之后，受试者的对所述MAPC或子细胞的免疫耐受性可用本 领域已知的各种方法来测试，以评估受试者对MAPC的免疫耐受性。 对于受试者的MAPC耐受性是最适度以下的情况(例如受试者的免疫 系统排斥外源MAPC)，可以对受试者进行本领域已知的治疗性辅助 免疫抑制疗法。

MAPC的基因修饰

MAPC或其分化子细胞可以在活体外被基因改造，消除基因疗法 的一个最显著的障碍。例如，可以获得受试者的骨髓穿刺物，并从穿 刺物中分离MAPC。然后对MAPC进行基因改造以表达一种或多种需 要的基因产物。然后对MAPC进行体外筛选或选择以识别那些已经被 成功改造的细胞，并且可以将这些细胞引入受试者或者将这些细胞分 化后再引入受试者，引入位置可为局部或全身。或者，MAPC可以被 分化，然后在给药前对分化的细胞进行基因改造。每种情况下，所述 细胞提供了稳定转染的能够表达所需基因产物的细胞源。特别是当患 者自身的组织(如骨髓)为MAPC源时，本方法提供了一种生产移植 细胞的免疫安全方法。

MAPC基因改造的方法

用本文所述的方法分离的细胞或他们的分化子细胞，可以用各种 本领域技术人员可实现的方法通过在细胞内引入DNA或RNA来对所 述细胞进行基因修饰。这些方法一般分为四大类：(1)病毒转移，包 括DNA或RNA病毒载体的使用，如逆转录病毒，包括慢病毒 (Mochizuki，H.，et al.，1998；Martin，F.，et al.1999；Robbins，et al. 1997；Salmons，B.and Gunzburg，W.H.，1993；Sutton，R.，et al.，1998； Kafri，T.，et al.，1999；Dull，T.，et al.，1998)、猿猴病毒40(SV40)、腺 病毒(参见例如Davidson，B.L.，et al.，1993；Wagner，E.，et al.，1992； Wold，W.，Adenovirus Methods and Protocols，Humana Methods in Molecular Medicine(1998)，Blackwell Science，Ltd.；Molin，M.，et al.， 1998；Douglas，J.，et  al.，1999；Hofmann，C，et  al.，1999； Schwarzenberger，P.，et al.，1997)、α病毒包括辛德比斯病毒(Sindbis virus)(U.S.Patent No.5,843,723；Xiong，C，et al.，1989；Bredenbeek， P.J.，et al.，1993；Frolov，I，et al.，1996)、疱疹病毒(Laquerre，S.，et al.， 1998)和例如牛乳头瘤病毒；(2)化学转移，包括磷酸钙转染和DEAE 葡聚糖转染法；(3)膜融合转移，使用加载DNA的膜载体如脂质体 (Loeffler，J.and Behr，J.，1993)、红细胞影和原生质体；(4)物理转 移技术，如微注射、微粒J.Wolff的“基因疗法(Gene Therapeutics)” (1994)中第195页(参见J.Wolff的“基因疗法”(1994)中第195 页；Johnston，S.A.，et al.，1993；Williams，R.S.，et al.，1991；Yang，N.S.， et al.，1990)、电穿孔、核转染或直接“裸露”的DNA转移。

可以通过预选的分离DNA的插入，通过用预选的分离DNA取代 细胞基因组的一个区段或通过至少一部分所述细胞的基因组的缺失或 失活来对细胞进行基因改造。至少一部分所述细胞的基因组的缺失或 失活可以通过各种方法来完成，包括但不限于例如基因重组，通过反 义技术(可以包括使用肽核酸或PNA)或通过核酶技术。预选的一种 或多种DNA序列的插入可以通过同源重组或通过将病毒整合到所述 宿主细胞基因组中来完成。非同源重组的方法如美国专利6,623,958、 6,602,686、6,541,221、6,524,824、6,524,818、6,410,266、6,361,972中 所述，它们关于非同源重组的全部公开内容特别地通过引用的方式纳 入本文。

可以使用质粒表达载体和核定位序列来将所需的基因序列引入细 胞中，特别是细胞核中。用于将聚核苷酸引导到细胞核的方法是本领 域已知的。例如，如Sebestyen，et al.(1998)中所述，信号肽可以与质 粒DNA连接，从而将所述DNA引导到细胞核中以实现更有效的表达。

可以使用启动子来引入所述基因物质，所述启动子将会使得所研 究的基因被某些化学试剂/药物正向或负向诱导，在给予一种给定的药 物/化学试剂后被消除，或者被标记使得它可以在特定的细胞区室(包 括但不限于细胞膜)被化学试剂(包括但不限于tamoxifan敏感的突 变型雌激素受体)诱导。

靶细胞的成功的转染或转导可以用本领域技术人员已知的技术利 用基因标记来证明。例如，维多利亚水母(Aequorea victoria)绿色荧 光蛋白已经被用作一种识别和追踪基因修饰过的造血细胞的有效标记 (Persons，D.，et al.，1998)。其他选择标记包括β-Gal基因、截短的神 经生长因子受体、药物选择标记(包括但不限于NEO、MTX、潮霉素)。

任何的转染或转导技术都可以被用于在MAPC或子细胞中引入转 录调控序列以激活所需的内源基因。这可以通过同源(例如U.S. 5,641,670)或非同源(例如U.S.6,602,686)重组来完成。这些专利关 于内源基因激活方法的教导通过引用的方式纳入本文。

实施例

下面提供的实施例目的在于证明和进一步说明本发明的某些实施 方案和某些方面，且不应被解释为限制了本发明的范围。

实施例1MAPC产生能重建淋巴造血系统的HSC

2002年，公开了当鼠LaxZ⁺MAPC被移植到遭受未致死量辐射的 NOD-SCID小鼠体内时，这些干细胞有助于造血系统；但是，处于低 造血移植水平(2-8％的髓细胞和B-淋巴细胞，不含T-淋巴细胞) (Jiang Y et al.2002)。如本文所证明的，当存在于NOD-SCID小鼠体 内的内源NK细胞被消除时，MAPC能够产生最高达95％的GFP⁺血 细胞。此外，在低O₂条件下分离和培养的MAPC会导致MAPC具有 较高的ES-转录因子(Oct 4)的mRNA和蛋白水平和较高的分化潜力。 因此，研究了NOD-SCID小鼠体内的低O₂MAPC移植物，所述 NOD-SCID小鼠是用275cGy辐射并且在第1、11和22天用抗去唾液 酸GM1抗体处理过以降低NK活性的。

鼠MAPC细胞系是在如Jiang Y et al.2002中所述的eGFP转基因 C57B1/6 Thy1.1小鼠的骨髓细胞中建立的。将MAPC在60％ DMEM-LG(Gibco BRL)、含有1x SITE的40％MCDB-201、0.2x LA-BSA、0.2g/l BSA、0.1mM抗坏血酸-2-磷酸、0.1mM β-巯基乙 醇(Sigma)、100U青霉素、1000U链霉素(Gibco)、1000U/ml LIF (Chemicon)、10ng/ml mEGF(Sigma)、10ng/ml hPDGF-BB(R&D systems)、2％胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories)中培养，在约5％ CO₂和约5％O₂的空气浓度下置于用10ng/cm²的人纤连蛋白(Sigma) 包被的培养皿(Nunc)上。放置的细胞密度为约100细胞/cm²且细胞每 两天被分装一次。

通过尾静脉注射，约0.3-1x10⁶个5％O₂培养的eGFP C57B1/6 MAPC被移植到6-8周龄的用275cGy辐射后的NOD-SCID小鼠体内 (n＝11)。在-1、+10和+20天时腹膜内注射抗去唾液酸GM1抗体 (Wako)(20μl储液稀释于380μl 1xPBS中)以降低NK活性(表2)。

表2：mMAPC的淋巴造血移植

*动物仍旧存活

移植到动物1-3体内的MAPC具有低水平的Oct 4(＜0.1％的 mESC)，而所有其它的MAPC都具有＞30％mESC的Oct 4mRNA水 平。

移植后(4-10周)在外周血(PB)中定时评估淋巴造血功能的重 建。动物4和5在移植后5和7周被处死，因为它们似乎生病了。动 物1-2、6和10-11在12至30周之间被处死。动物7-9仍旧存活并且 只检查外周的GFP阳性细胞。在所有被处死的动物中，血液、BM和 脾都被用于评估eGFP淋巴造血细胞的存在。此外，收集组织以确定 MAPC衍生细胞在非淋巴造血细胞系的分布。

如表2中所述，3/11的动物(动物1-3具有低水平的Oct 4)没有 MAPC-衍生的淋巴造血功能的迹象。在另外8个动物中，存在eGFP 阳性淋巴造血功能水平增加的证据(数据未出示)，20周后接近约 95％。当在10周前对动物进行评估时，移植物水平很低，表明与HSC 的移植相比，MAPC到HSC(之后HSC会产生更加成熟的造血细胞) 的转化会被延长。与这种可能性一致的是，如果将MAPC移植到遭受 致死量辐射(9Gy)的FANC-C小鼠体内却不共同注射低抵抗力 (compromised)BM细胞(BM负型干细胞；支持早期的造血功能恢 复，但不是长期移植物)，受体动物会在14-21天后死于再生障碍(如 下文所述)。然而，当缺乏免疫力的BM细胞也被给予时，动物会存活 下来，最后会发育出GFP⁺MAPC衍生的淋巴造血功能。基于这些现 象，MAPC的这一剂量可能不能在急诊中将动物从致死辐射中拯救出 来，但是它可以产生LTR(长期再生)-HSC。这类LTR-HSC可以表 达cKit和Sca 1，并且在第二受体中产生功能性淋巴造血功能。此外， MAPC衍生的HSC也能产生功能性T-和B-细胞，这些细胞可以占据 次级淋巴器官包括胸腺、脾和淋巴结，并能够建立对钥孔血兰素 (KLH)的免疫应答。

对6号小鼠体内的淋巴造血组织的分析证明了多向移植(图2A)。 首先，在移植MAPC的NOD-SOID小鼠体内观察到了正常大小的脾、 胸腺和淋巴结。此外，图2显示了这些器官由eGFP⁺细胞占据。

FACS分析是对PB、BM、脾和胸腺的单细胞悬浮液进行的。6号 鼠的结果在图2B-C中给出。在BM、PB、脾和胸腺中存在着可明显 辨别的eGFP⁺CD45.2⁺细胞(BD Biosciences Pharmingen)(在移植后 13周的PB、BM和脾中存在最高达70％的GFP/CD45.2细胞)。在 PB中，eGFP⁺细胞共同表达B220、CD19、CD3、CD4、CD8、NK1.1、 Mac 1和GR1(BD Biosciences Pharmingen)。对BM的分析显示60％ 的eGFP⁺细胞共同表达成熟的造血标记，包括CD34PE、CD45.2APC、 Thy1.1PE、Sca-1PE、c-Kit APC(BD Biosciences Pharmingen)。T细 胞的频率是低的。这是意料之中的，因为鉴于MAPC的缓慢免疫重 建，可以预期到在发育不全小鼠的胸腺和胸腺复原过程中T细胞的产 生随时间的进行性增加，所述在发育不全小鼠的胸腺和胸腺复原是在 T细胞外周化前观察到的。此外，约1％的所述GFP⁺细胞共同表达了 Scal⁺/cKit或Thyl⁺/cKit(BD Biosciences Pharmingen)。这表明了从 MAPC产生了HSC，与存在GFP⁺CFU-Mix、BFU-E和粒细胞-单核细 胞-集落-生成单位(CFU-GM)的结论一致。

对来自脾、BM和外周血的细胞的FACS分析显示存在具有分化 为髓细胞(Mac-1/Gr-1)、B-(B220/CD19/IgM)和T-(CD4/CD8/TCRαβ) 淋巴样细胞能力的多向移植物。例如，在脾中(图2C)，检测到了具 有B-淋巴样(CD 19PE，B220APC，IgMAPC(BD Biosciences Pharmingen)和T-淋巴样(CD4APC和CD8APC(BD Biosciences Pharmingen)细胞表型的细胞分化。在混合的淋巴细胞反应培养物中， eGFP分选的脾T细胞能够与Balb/C衍生细胞反应，并由抗CD3⁺抗 CD28mAB(抗体由Dr.Carl June提供；Brice et al.1998)激发。胸 腺中检测到了表达CD4、CD8和TCRβ(BD Biosciences Pharmingen) 的eGFP⁺细胞。对肠道的粗略检查也识别出了含有eGFP的淋巴集结 (Peyer’s patch)。

实施例2MAPC能够在体外分化成为HSC/HPC

使用饲养细胞如OP935或通过允许所述ES形成胚胎体(embroid body，EB)(Choi K et all.1998)，造血细胞能够由鼠ESC生成，然后 用已知能作用于中胚层-血管生成细胞界间的细胞因子诱导造血细胞， 随后再用迟缓作用的造血细胞因子诱导(Faloon P et al.2000；Schuh AC et al.1999)。随后ESC会表达血管生成细胞标记(包括Flkl，SCL 和LMO2)和随后的造血标记。观察到了原始造血和之后的永久造血 的顺序活化。在发育过程中，产生自AGM区的永久HSC为c-Kit和 AA4.1阳性。值得注意的是，在发育过程中全造血系标记(CD45)是 在获得CD41之后表达的，且CD41而非CD45的表达指示了LTR-HSC 命运的定向(Mikkola HK et al.2003；Bertrand JY et al.2005)。

当在体外由mESC生成的造血细胞被移植到出生后的动物体内 时，没有或只有非常小的移植物可以被观察到(Potocnik AJ et al. 1997)。Kyba et al.(2002；2003)最近已经公开了当在mESC衍生的造 血细胞中短期表达HoxB4或Stat5A时，体内移植是可行的，尽管淋 巴重建不是非常的健全。类似的，已经实现了体外hESC分化 (Kaufman DS et al.2001；Tian X et al.2004；Vodyanik MA et al.2005； Wang L et al.2004；Cerdan C et al.2004)。几项研究已经证实了hESC 衍生的造血细胞可植入辐射免疫缺陷动物体内，尽管移植水平很低。

为了支持在体外指导细胞特化和定向到血管生成细胞和HSC的 步骤，在血原性微环境中产生了许多基质细胞系，包括成体BM、胎 儿肝和AGM，其中一些支持原始祖细胞。这些细胞系中的两种， EL08-1D2和UG26-1B6(Oostendorp RA et al.2002；Buckley S et al. 2004)支持长期培养(LTC)的人和小鼠造血祖细胞(HPC)，两种饲 养细胞都支持小鼠再生性HSC(Kusadasi N et al.2002；Oostendorp RA et al.2002；Harvey K et al.2004；Oostendorp RA et al.2002)，如下 文所述，EL08-1D2细胞系能够在体外将MAPC特化到淋巴造血命运。 此外，已经识别了许多负责早期造血特化和定向的细胞因子或因子。 这些包括作用于中胚层-HSC界间的因子，以及在HSC水平具有已知 活性的因子，如TGFβ/BMP家族(Leung AYH et al.2004)或Wnt(Reya T.2003)家族的成员、IHH(Dyer MA et al.2001)、VEGF(Choi K 1998) 或bFGF(Faloon P et al.2000)，以及早期作用造血细胞因子，包括 SCF、Flt3L和Tpo。

A.mMAPC在与EL08-1D2细胞共同培养后分化成为淋巴造血细胞

鼠MAPC细胞系是在约5％O₂浓度下，在如Jiang Y et al.(2002) 中所述的eGFP转基因小鼠的骨髓细胞中建立的。将10⁴个eGFP⁺mMAPC在含10％FCS的培养基(Myelocult M5300(Stem Cell Technologies))中培养14天，其间与E11.5鼠胚胎肝饲养(EFL) EL08-1D2细胞(生长至汇合并用2500cGy的铯照射；获取自Dr.E. Dzierzak，Rotterdam；Oostendorp RA et al.2000)接触，所述培养基含 有20ng/ml mSCF(R&D Systems)，10ng/ml mTpo(R&D Systems)，10 ng/ml mIL3(R&D Systems)，10ng/ml mIL6(R&D Systems)。之后利用 Methocult培养基(MethoCult^TM甲基纤维素基培养基(Stem Cell Technologies))用CFC培养法培养14-16天，所述Methocult培养基含 有20ng/ml mSCF(R&D Systems)、10ng/ml mIL-3(R&D Systems)、 10ng/ml mIL6(R&D Systems)和3U/ml hEpo。细胞在37℃并且存在 1xβ-巯基乙醇(Gibco)的情况下，用5％的CO₂培养。

用Q-RT-PCR检测未分化MAPC和d14MAPC的造血、内皮和 内胚层标记；记录d14-16 Methocult培养物中存在的CFC。未分化 MAPC的Q-RT-PCR分析没有检测到LMO2、SCL、GATA1或PU.1 mRNA，以及非常低水平的GATA2 mRNA；且FACS分析表明未分化 mMAPC是cKitPos，但是ScalNeg，CD34Neg，CD41Neg，CD45Neg， ThylNeg和LinNeg(抗体购自BD Pharmingen)。Lineage Cocktail含有 Gr-1，Mac-1，Terr-119，CD4，CD8和生物素化的B220。

到第14天造血转录因子(GATA2，GATA1，LMO2，SCL，PU.1)的 转录物得以表达，并且到第28天得以进一步增加(图3A)。然而，在 第14天，更加成熟的造血细胞的标记(CD45、MPO、Hbγ和Hbβ) 没有被表达，不过到第28天这些标记却被高度表达。值得注意的是， Hbγ和Hbβ的识别，代表了永久造血而不是胚胎造血。还发现到第 14天内皮细胞转录物(Flkl、VE-钙粘蛋白、vWF)的表达明显较高； 然而，到第28天水平却下降了，表明分化的第一阶段可能是通过血管 生成细胞的中间产物来发生的，这一点与mESC类似(Choi K.1998； Choi K et al.1998)。也生成了CFU-Mix集落(图3B)。

B.人(h)MAPC也分化成为淋巴造血细胞

按本文所述的方法建立人MAPC细胞系并加以培养。将eGFP转 导的MAPC(GIyA、CD45和CD34阴性(n＝20))与所述小鼠卵黄囊 中胚层细胞系(YSM5)共同培养，在添加了10ng/mL bFGF和VEGF 的无血清培养基中以悬浮的细胞聚集物的形式培养6天。6天后，仅 eGFP⁺细胞(即MAPC子细胞)剩余，YSM5细胞已经死亡。

将剩余的细胞移至含10％胎牛血清(FCS)甲基纤维素培养基中 培养两周，所述培养基添加了10ng/mL骨形成蛋白(BMP)4、VEGF、 bFGF、干细胞因子(SCF)、Flt3L、hyper IL6、血小板生成素(TPO)和 红细胞生成素(EPO)。在这些培养物中，粘附eGFp⁺细胞和小的圆形 非粘附细胞都会被检测到，所述非粘附细胞形成了许多与所述粘附细 胞相连的集落。所述非粘附和粘附组分被分别收集并在含10％FCS的 培养基中培养7天，所述培养基含有10ng/mL VEGF和bFGF。当将 粘附细胞置于ECM上时，vWF染色阳性的粘附细胞会形成血管并能 够吸收a-LDL，表明了它们的内皮特性。用流式细胞仪可以看出5-50％ 的所述非粘附细胞为人特异性GlyA和HLA-I类染色阳性。用FACS 选择Gly-A⁺和HLA-class-I⁺细胞。进行赖特-吉姆萨染色 (Wright-Giemsa)时，这些细胞表现出了前成红细胞的特征性形态和 染色模式。使用免疫过氧化物酶可以发现细胞是联苯胺阳性和人Hb⁺的。通过RT-PCR发现，这些细胞表达了人特异性Hb-e而不是Hb-a。

当将这些细胞重新置于含20％FCS和EPO的甲基纤维素实验中 时，10天后可以观察到小的红系细胞集落，且这些集落全部为人特异 性GlyA和Hb染色阳性。由于MAPC的选择依赖于BM中CD45⁺和 GlyA⁺细胞的清除，且FACS和cDNA矩阵分析时所培养的MAPC一 直为CD45^-和GlyA^-，所以MAPC中不可能存在造血细胞污染。

实施例3.MAPC在FANCC-/-小鼠血液的分布：FANCC-/-MAPC的基因修复

范可尼贫血(FA)是一种由常染色体隐性遗传传递的严重的骨髓 (BM)衰竭综合征。存在至少11种FA基因(A、B、C、D1(BRCA2)、 D2、E、F、G、I、J和L)。这11种导致了几乎全部的范可尼贫血病 例。FA-A、FA-C和FA-G的突变是最常见的并占全世界FA患者的大 约85％。FA-D1、FA-D2、FA-E、FA-F和FA-L占了10％。FA-B、FA-I 和FA-J代表了不到5％的FA患者。大多数的范可尼贫血基因已经被 克隆了。

FA同等地存在于在男性和女性中。它存在于所有的人种中。FA 的临床表现被定义为进行性骨髓衰竭，以及在大多数病例中，许多先 天畸形(Liu JM.2000)。此外，FA患者具有在晚年发展层脊髓发育不 良、急性骨髓性细胞白血病(AML)和实体瘤的高风险(Alter BP. 1992)。例如，FA患者也可能发展成头部和颈部、妇科和肠胃鳞状细 胞癌。

所述疾病血液学表现的长期根治疗法的主要模式是利用同种异体 供体的骨髓(BM)或外周血干细胞(PBSC)移植(Gluckman E.1993； Kohli-Kumar M.et al.1994；Guardiola P et al.2000)。然而，这些工 作仅仅致力于血液缺陷而没有关注伴随的上皮缺陷。此外，由于所述 移植包括了同种异体供体的细胞，因此存在受体排斥所述供体细胞的 风险。由于各种问题，使用经活体外基因修正的自体骨髓的工作基本 上仍没有成功，所述问题如低效率的基因传递和体外培养骨髓干细胞 的水平较低。

多能成体祖细胞(MAPC)是成体骨髓内的一群干细胞，它们不 但能在体内分化成为淋巴造血细胞，而且可以在例如肝、肠胃、肺上 皮和内皮中植入。此外，MAPC能够被长时间扩增或培养而不失去分 化潜力，且它们可以通过基因操作来修正(例如，用于基因疗法)。因 此，MAPC是理想的FA疗法来源。

材料与方法

从FANCC+/+小鼠骨髓中分离并富集MAPC

携带FANCC鼠同源基因的断裂外显子9的FANCC-/-小鼠及其同 基因正常对照FANCC+/+小鼠均由Dr Markus Grompe提供。从小鼠 的股骨收集骨髓。按照稍微调整的Jiang et al.(2003)方法培养MAPC。 简言之，通过Ficoll-Plaque密度梯度离心(Sigma Chemicals Co.，St Louis，MO)来获取骨髓单核细胞。放置单核细胞于板上并用微磁珠 (Miltenyi Biotec，Sunnyvale，CA)消除。将5,000个CD45^- GlyA^-细 胞置于96孔板孔中的1ml MAPC扩增培养基中，所述培养基由 DMEM-LG(58％；Gibco-BRL，Grand Island，NY)、MCDB-201(40％； Sigma Chemical Co，St Louis，MO)、2％FCS(Hyclone Laboratories， Logan，UT)组成，添加了1x胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)、1x亚油酸- 牛血清白蛋白(LA-BSA)、10^-8M地塞米松，10^-4M抗坏血酸-2-磷酸(AA)， 100U青霉素和1,000U链霉素，所述96孔板使用10mg/ml纤连蛋白 (FN)包被。培养基中添加了10ng/ml EGF和10ng/ml PDGF-BB(R&D Systems，Minneapolis，MN)和10ng/ml白血病抑制因子。一旦50％的 细胞汇合，用胰蛋白酶/EDTA(Sigma)分离细胞并以1/2的稀释度重 新置于较大的培养皿中以使细胞浓度保持在0.8至2x10³细胞/cm²。 所述细胞也在存在1xβ-巯基乙醇(Gibco)情况下，在5％O₂中培养。

MAPC的分析

形态：所建立的FANCC+/+MAPC表现出MAPC的小的梭形细胞 特征(Jiang et al.2002)。基于表面标志的表达用FACS来分析所分离 细胞的表型，并且用Q-RT-PCR检测干细胞标志(如Oct 4和多潜能 性维持因子(nanog))的存在(Jiang et al.2002)。

MAPC的分化

通过测试MAPC分化成为如上所述的内皮、神经外胚层和血细胞 样细胞的能力来评估所分离的MAPC的多向潜能(Jiang et al.2002)。

正常同源(FANCC+/+)MAPC向FANCC-/-小鼠移植

FANCC+/+MAPC的慢病毒标记：在移植前，用lenti-GFP转导 MAPC。然而，也可以使用转基因GFP MAPC。根据Jiang et al.2002， 通过尾静脉注射将GFP⁺MAPC注入FANCC-/-小鼠体内。简言之，通 过尾静脉注射将1x10⁶个未分化的MAPC，以及200,000个低抵抗力骨 髓细胞(Sca-1清除细胞)注射到经约7.5Gy至约9.0Gy辐射的6-9周 龄的FANCC-/-小鼠体内。只移植了低抵抗力骨髓细胞的FANCC-/-小 鼠作为对照。外周血的FACS分析通常在移植4-6周后进行。移植8 至10周后，所述动物被处死，并且用FACS分析MAPC在造血器官 (如外周血和骨髓)中的分布。例如在移植8-10周后，将移植鼠的外 周血和骨髓分离出来。将样品的红细胞清除并用血标记CD45标记， 然后用FACS分析。GFP和CD45阳性细胞代表衍生自所述 GFP⁺MAPC的血细胞。

用GFP免疫组织化学和GFP基因组DNA的Q-PCR分析评估 GFP⁺MAPC在非造血组织中的分布。

结论

慢病毒绿色荧光蛋白(GFP)转导，注射到遭受未致死量辐射 FANCC-/-小鼠(范可尼贫血组C敲除小鼠模型)体内的正常MAPC 分布于宿主的造血系统。移植8-10周后，这些小鼠骨髓中2-5％的 CD45⁺细胞是供体衍生的GFP⁺细胞。GFP阳性细胞也在从移植后动物 采集的外周血(PB)以及各种组织(如肝、肺和肌肉)中检测到。

如本文所述，在清除了NK细胞的NOD-SOID小体内使用高Oct 4 表达的MAPC会导致至少80％的造血功能再生。类似的条件被应用于 FANCC-/-小鼠中以达到更高的移植水平。为了进一步在FANCC-/-骨 髓中选择性再生移植细胞，将动物用环磷酰胺处理(环磷酰胺是一类 已知为烷化剂的药物；它会减缓或停止癌细胞的生长)，所用的剂量是 会对宿主骨髓细胞(例如，FANCC-/-细胞)造成毒性，而不会对正常 的MAPC衍生造血细胞造成毒性的剂量(约40mg/kg体重)。

因此，来自患有FA的受试者的宿主MAPC可以被分离、培养并 且经过体外基因缺陷修正的处理。然后，所述细胞可以被用作所述受 试者FA疗法的自体细胞源(例如在FA受试者中，经过体外基因修正 的FA MAPC的长期重建)。

实施例4使用自体MAPC治疗慢性髓细胞性白血病(CML)

慢性髓细胞性白血病(CML)是一种HSC的克隆性骨髓增生障 碍，特征在于费城染色体(Ph)和BCR/ABL融合基因(Rowley J 1990)。 在过去的20年里HSC移植和IFN-α疗法一直是治疗CML的主要方 法。最近，特异性p210BCR/ABL TK抑制剂，Imitinab(Gleevec^TM； Novartis Pharmaceuticals Corporation(East Hanover，NJ))，已经成为 CML患者的首选疗法。然而，一部分用Imitinab治疗的患者无法实 现细胞遗传学缓解(cytogenetic remission，CR)，且有证据表明达到 了分子缓解的患者可能会再次复发(Kantarjian HM et al.2003； Gambacorti-Passerini CB et al.2003)。对于这些患者来说，需要对其 它治疗方法进行评估。

一种可能性是使用在细胞遗传学缓解时收集的自体HSC。然而， 有证据表明即使当患者在进行Imatinib疗法后处于CR状态，恶性 HSC仍然存在(Bhatia R et al.2003)。已经证明了在CML中自体移 植会导致CR；然而，它们几乎都不是长期的(Barnett MJ et al.1994； Verfaillie C et al.1998；Carella AM et al.1997)。同卵双生移植会导致 至少5倍高的长期缓解(Thomas E et al.1986)，这些现象与大多数再 融合移植物会被恶性细胞感染的事实一致(Deisseroth AB et al.1994)。

然而，CML患者BM产生的MAPC也许不含有Ph染色体或 BCR/ABL基因排列，因为来自CML患者BM培养物(基质细胞)的 非造血细胞为Ph^-(Bhatia R et al.1995)。因此，MAPC可以构建起一 群用于CML患者自体移植的干细胞。

因此，CML患者体内的hMAPC可以是Ph^--BCR/ABL^-的并可以 在体内产生良性的长期再生(LTR)HSC和成熟造血子细胞。BM将 会从10个新诊断的CML患者身上获取(例如还没有暴露于化学疗法 或辐射的患者)且MAPC将会被分离。使用标准的方法来测试MAPC 群中Ph染色体和BCR/ABL基因的存在情况。追踪细胞遗传稳定性、 端粒酶活性和端粒长度随时间的变化。测试细胞分化成为间充质细胞 类型、内皮细胞、肝细胞和神经外胚层样细胞的能力，如文献所述 (Reyes M et al.2001；Schwartz RE et al.2002；Reyes M et al.2002)。 一旦MAPC细胞系被建立起来，它们在体外和体内产生淋巴造血细胞 的能力将会被测试，如本文针对非白血病(NL)BM衍生的MAPC的 叙述。

只有10个cKit⁺Lin^-Sca1⁺(KLS)鼠细胞能够产生移植后稳健的 造血作用，产生髓样细胞、B-淋巴样和T-淋巴样细胞(Spangrude G et al.1988)。当huUCB CD34⁺Lin^-CD38^-细胞被移植到NOD-SCID小鼠 体内时，最少需要500细胞来检测＞1％的人造血细胞，表明跨异种障 碍的移植是非常低效的。此外，在NOD-SCID小鼠中的人造血功能产 生了占据优势数量的B-细胞和一些髓样细胞(Hogan CJ et al.1997； Bhatia M et al.1998)，但没有T-细胞。然而，当人CD34⁺细胞被移植 到BNX(Dao MA and Nolta JA.1998)、NOD-SCID-IL2γc/R^-/-(Yahata T et al.2002)或IL2γc/Rag2^-/-(Traggiai E et al.2004)小鼠体内时， 也能够检测到T-淋巴细胞，所述T-淋巴细胞能产生功能性的人免疫应 答。像huCD34⁺细胞一样，huMAPC的移植水平也比muMAPC要低， 因此在遭受了接近去髓剂量辐射(700cGy)的动物体内，所用的细胞 剂量将会被调整至包括约10⁷细胞/小鼠。

人MAPC(约10⁵-10⁷细胞/动物)将会被移植到6-8周龄受过辐 射的IL2Rγc/Rag2^-/-小鼠体内。在4-16周时评估PB中人淋巴造血功能 的迹象。在16周时，动物被处死，通过FACS评估PB、BM、脾、胸 腺和淋巴结中的huCD45⁺。作为体内追踪细胞的附加标记，转导了一 种含eGFP的慢病毒载体的huMAPC将会被应用。为了评估体内HSC 的生成，将会用全骨髓进行二次移植，如果成功的话随后用选定的 huCD34⁺Lin^-细胞进行移植。

由hMAPC在体外向淋巴造血的特化和定向使用将mMAPC(如 上所述)定向至淋巴造血系的方法来进行，因为将hESC分化成造血 细胞的方法大体上类似于那些用于将mESC定向至造血细胞的方法 (Nakano T et al.1994；Vodyanik MA et al.2005)。如上文所述，在存 在VEGF、BMP4、bFGF和造血细胞因子的情况下，通过与OP9饲 养细胞共同培养，hMAPC能够被定向至所述淋巴造血系。

上述获得的hMAPC-子细胞将会被移植到受过辐射的 IL2Rγc/Rag2^-/-小鼠体内。在开始的研究中，大批培养的MAPC-子细 胞将会被移植。如果这些细胞植入，那么所述植入细胞的表型将会被 识别，识别过程中根据CD34、CD41a、CD43、CD45、Thy1、cKit 和/或CD133表达来选择细胞-首先测试它们在体外产生集落形成细胞 (CFC)能力，随后在体内移植。为了证明生成了长期再生细胞，将 会进行许多二次移植。

因此，良性非胚胎干细胞可以被用于恶性造血肿瘤的自体移植， 包括CML和潜在的其它淋巴造血障碍，如再生障碍性贫血或淋巴造 血系统的遗传性基因障碍。

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所有的出版物、专利和专利申请通过引用的方式纳入本文。在上 述说明书中已经描述了本发明及其某些优选的实施方案，并且陈述了 许多细节以用于说明本发明，但本发明的其他实施方案对本领域技术人 员来说是显而易见的，且本文所述的某些细节是可以相应地加以变化 而不会偏离本发明的基本主旨。