一种荧光标记探针的PCR－LDR基因多态性检测测序方法

摘要

本发明提供一种荧光标记探针的PCR－LDR基因多态性检测测序方法。本发明利用荧光标记探针进行PCR关联LDR和测序技术来进行基因多态性位点检测。本发明方法包括以下步骤：引物和探针设计、PCR检测、LDR检测、测序仪结果检测。本发明的方法由于测序结果的直接性，解决了结果的假阳性和假阴性；测序平台的样本高通量性，可同时进行上百例样本的检测；位点的高通量，利用测序仪的5色荧光检测系统，同时能利用4种荧光，使测序仪系统也可同时进行一百多个位点的检测，加速检测的速度，降低了实验成本。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一种荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性检测测序方法。

背景技术

随着人类药物基因组学的发展，越来越多的研究成果将运用于临床诊断中，这就要求有大规模的基因多态性位点检测方法。近年来，将连接反应用于检测基因多态性位点越来越引起人们的重视，学者们已经做了大量的研究(France Barany et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，88：189-93(1991)，The Ligase Chain Reaction(LCR)in a PCR World，PCR Methods and Applications，1：5-16(1991))。连接酶链式反应(ligasechain reaction，LCR)是指在反应中设计两对探针，使连接反应可以指数扩增模板。连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)是在反应中仅加入一对探针，模板被线性扩增。

目前，出现了将LDR技术和PCR技术关联使用，以及LDR技术、PCR技术和基因芯片技术、测序技术关联用于基因多态性位点检测(Norman P.Gerry 1 et al.，J.Mol.Biol.(1999)292，251-262，U.S.Pat.Pub.No.2003/0032016A1)，这些技术的出现大大方便了基因位点的检测，但在这些技术中，需要大量的荧光标记的探针，而这些标记的探针成本昂贵，为开发和应用造成不便，因而，限制了它们的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计简便的PCR-LDR基因多态性测序检测方法。

本发明提供了一种荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性测序检测方法。

由于基因多态性包括单位点基因突变、基因缺失、插入以及微卫星等多种情况，本发明所述的基因多态性位点检测主要是针对基因单位点突变，即单碱基突变、插入和缺失，并且在突变位点周围大约20个碱基内没有其他单位点突变。

利用本发明提供的一种荧光标记探针，在PCR和LDR关联利用测序仪进行基因多态性位点检测时，针对每一个突变位点，涉及到二种探针：第一种探针是标记探针，包含三个部分，其中一部分为和模板配对部分，另一部分为和连接模板配对部分，同时在两部分序列中引入随机探针来调整探针的长度；第二种探针为检测探针，包含两个部分，其中一部分为和模板配对部分，另一部分则引入随机序列来调整LDR产物的长度。其中第二种探针，可以是两根也可以是三根或者四根，探针中3’端为检测位点。每组针对核酸单碱基变化的检测探针，通过设定检测探针的长度，实现不同的核酸碱基对应不同的LDR产物长度。

本发明主要是针对第一种标记探针进行改造，首先引入一个通用荧光标记探针和一个通用模板，通用模板部分的5’序列和通用荧光标记探针序列互补，而在上述第一种标记探针中也有部分序列是和通用模板互补的序列，在LDR过程中，通过通用模板的互补配对，实现通用荧光标记探针和标记探针的连接，实现对标记探针的标记。

LDR反应结束后，将LDR产物放入测序仪，利用测序仪的genescan功能，通过结果中已知分子量的一系列内参来确认不同LDR产物的长度，从而判读位点的多态性。

本发明PCR-LDR关联的单位点多态性测序检测，经过适当调整，也可以用于HPLC和微流芯片等高分辨率的核酸分离检测系统。

具体的说，本发明方法包括以下步骤：

1.探针设计

(1)针对检测的位点，设计一系列LDR产物的分子量系列，LDR产物的差异可从一个碱基到几百个碱基；

(2)设计一个专有荧光标记探针，该探针具有极高的特异性，与已知生物的序列无同源性；

(3)设计一个专有模板，该模板具有极高的特异性，与已知生物的序列无同源性；

(4)在要检测的突变位点的前后各设计10-25碱基长度的检测探针和标记探针，检测探针的检测位点设计在3’端；

(5)在标记探针的3’端引入模板配对序列和随机序列，以及检测探针5’端引入随机序列(与PCR产物的序列没有同源性的任何序列)，一般标记探针和检测探针具有相近的分子量。

2.PCR

取待检测的DNA 1μl(5ng/μl)以上，PCR引物各10-30pmol，高温聚合酶，高温聚合酶的相应混合液，相互混合。PCR反应条件为：94℃30秒，40-68℃30秒-2分钟，60-72℃45秒-2分钟，循环25-40次。

3.LDR

取PCR产物1μl，探针各40fmol-10pmol，连接酶，相应的连接酶缓冲液，相互混合。LDR反应条件为：94℃30秒，40-70℃1-10分钟(以45-60℃为最好)，循环1-40次。

4.结果检测

取LDR产物1-5μl，混合测序系统的loading buffer，测序仪上样，进行LDR产物分离鉴定。

步骤(一)(3)在标记探针的3’端引入模板配对序列和随机序列以及检测探针5’端引入随机序列，所述随机序列为与PCR产物的序列没有同源性的任何序列。

步骤(一)(4)在要检测的突变位点的前后各设计10-25碱基长度的检测探针和标记探针，标记探针检测位点设计在3’端，检测探针的检测位点设计在5’端。标记探针和检测探针具有相近的分子量。

(一)(4)所述一般标记探针包含三个部分，第一部分为和目的模板配对部分，第二部分为和连接模板配对部分，第三部分为同时在第一和第二部分序列中引入的随机序列，用来调整探针的长度，长度为40-80bp；所述检测探针包含两个部分，第一部分为和目的模板配对部分，第二部分为引入的随机序列，用来调整LDR产物的长度，长度为40-80bp；检测探针可以是两根、三根或四根，探针中3’端为检测位点，每组针对核酸单碱基变化的检测探针，通过设定检测探针的长度，实现不同的核酸碱基对应不同的LDR产物长度。

本发明有以下效果：

1.由于测序结果的直接性，解决了结果的假阳性和假阴性问题。

2.测序平台的样本高通量性，可同时进行上百例样本的检测，而芯片技术则无法同时进行多样本的检测。

3.位点的高通量，利用测序仪的5色荧光检测系统，同时利用4种荧光，测序仪系统也可同时进行一百多个位点的检测。大大加速检测的速度。

4.与现有基因多态性位点检测及测序技术相比，大幅降低了应用成本，并且检测结果正确。

附图说明

图1-2是HBV1896突变检测结果图。

图1的结果表示只有82bp的连接产物，即只有HBV1896的野生型。

图2的结果表示有82bp和87bp的连接产物，既有HBV1896野生型也有HBV1896突变型。

图3-4表示HBV1896和HBV的YIDD/YVDD的联合检测结果。

图3有82bp和92bp两个连接产物，表示HBV1896检测结果是只有野生型产物，HBV的YIDD/YVDD检测结果是只有YIDD产物。

图4有82bp、92bp和97bp的连接产物，表示HBV1896检测结果只有野生型产物，HBV的YIDD/YVDD的检测结果是既有YIDD产物也有YVDD突变产物。

图5-7表示对5个SNP位点rs4652678、rs199930、rs7043268、rs6424820和rs4133072进行联合检测的结果。

图5的结果表示rs4652678有82bp和87bp两个连接产物，是杂合子C/T；rs199930有92bp的连接产物，是纯合子C；rs7043268有102bp和107bp两个连接产物，是杂合子G/A；rs6424820有112bp和117bp两个连接产物，是杂合子C/G；rs4133072有122bp的连接产物，是纯合子A。

图6的结果表示rs4652678有82bp连接产物，是纯合子C；rs199930有92bp的连接产物，是纯合子C；rs7043268有107bp连接产物，是纯合子A；rs6424820有117bp连接产物，是纯合子G；rs4133072有122bp的连接产物，是纯合子A。

图7的结果表示rs4652678有82bp和87bp两个连接产物，是杂合子C/T；rs199930有92bp的连接产物，是纯合子C；rs7043268有102bp连接产物，是纯合子G；rs6424820有112bp连接产物，是纯合子C；rs4133072有122bp的连接产物，是纯合子A。

图8-10表示6个SNP位点rs348475、rs499776、rs2161811、rs561712、rs4646580和rs4646642联合检测的结果。

图8的结果表示rs348475有82bp和85bp两个连接产物，是杂合子A/G；rs499776有91bp的连接产物，是纯合子G；rs2161811有94bp连接产物，是纯合子A；rs561712有100bp连接产物，是纯合子A；rs4646580有106bp和109bp两个连接产物，是杂合子C/T；rs4646642有112bp和115bp两个连接产物，是杂合子C/T。

图9的结果表示rs348475有82bp和85bp两个连接产物，是杂合子A/G；rs499776有88bp和91bp的连接产物，是杂合子A/G；rs2161811有94bp连接产物，是纯合子A；rs561712有100bp和103bp两个连接产物，是杂合子A/G；rs4646580有106bp和109bp两个连接产物，是杂合子C/T；rs4646642有112bp和115bp两个连接产物，是杂合子C/T。

图10的结果表示rs348475有85bp连接产物，是纯合子A/G；rs499776有91bp连接产物，是纯合子G；rs2161811有94bp连接产物，是纯合子A；rs561712有100bp连接产物，是纯合子A；rs4646580有109bp连接产物，是纯合子T；rs4646642有115bp的连接产物，是纯合子T。

具体实施方式

下面结合本专利实施例及其附图对本发明做进一步的说明。

实施例一：对单位点突变的DNA多态性进行检测

以乙型肝炎病毒(HBV)DNA 1896位点突变举例，突变位点间隔是5个碱基。

HBV1896位点附近序列为：

5’GCTGTGCCTTGGGTGGCTTTG/AGGGCATGGACATTGACCCG3’

1.引物和探针设计

(1)普通PCR引物设计

  引物序列(5’→3’)  长度(nt)  上游引物  CACCTCTGCCTAATCATCTCATGTTCATGT  30  下游引物  ACACAGAATAGCTTGCCTGAGTGCTGTATG  30

(2)荧光标记探针：GCATCACTCAGAGGG

模板：CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG

荧光标记探针要进行5’磷酸化和3’探针标记(本例用FAM)。

(3)标记探针

探针名称  探针序列(5’→3’)  长度(nt)和模板配对部分  AAAGCCACCCAAGGCACA  18和通用模板配对部分  CGCAAACCTGTACTC  15随机序列  ACCTACCT  8探针总序列^＊  AAAGCCACCCAAGGCACAACCTACCTCGCAAACCTGTACTC  41

注：*表示探针要进行5’磷酸化

(4)检测探针一

  探针名称  探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对  部分  GGTCAATGTCCATGCCCC  19  随机序列  ACCTACCTACCTACCTACCTA  22  探针总序列  GGTCAATGTCCATGCCCCACCTACCTACCTACCTACCTAC  41

(5)检测探针二

  探针名称  探针序列(5’→3’)长度(nt)  和模板配对  部分  GGTCAATGTCCATGCCCT  19  随机序列  ACCTACCTACCTACCTACCTACCTAC  27  探针总序列  GGTCAATGTCCATGCCCTACCTACCTACCTACCTACCTACCTAC  46

2.PCR反应

反应混合液为：200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，200μMdGTP，2mM MgCl₂，2U Taq DNA聚合酶，各1μM的上下游引物，1μl基因组模板(浓度大于5ng/μl)。反应条件为：94℃30秒，60℃30秒，72℃45秒，循环30次。

3.LDR反应

反应混合液为：20mM Tris-HCl，pH8.3(at 25℃)，50mM KCl，10mM MgCl₂，1mM EDTA，1mM NAD+，10mM DTT，0.1％(v/v)Triton X-100，探针各0.01μM，Taq连接酶15U，1μl PCR模板DNA。反应条件为：94℃30秒，60℃2分钟，循环30次。

4.上测序仪器进行检测

结果见图，图1显示只有1896G野生型病毒株，图2显示不仅有1896G野生型病毒株，还有1896A突变型病毒株。

实施例二：对两个点突变的DNA多态性进行检测

以HBV1896位点和YIDD/YMDD突变为例对单位点DNA多态性进行检测，每个突变位点间隔是5个碱基。

HBV1896突变：

5’GCTGTGCCTTGGGTGGCTTTG/AGGGCATGGACATTGACCCG3’

HBV的YIDD/YMDD突变：

5’CTGTCTGGCTTTCAGTTATATG/TGATGATGTGGTATTGGGGG 3’

1.引物和探针设计

(1)普通PCR引物设计

  HBV1896引物序列(5’→3’)  长度(nt)  上游引物  CACCTCTGCCTAATCATCTCATGTTCATGT  30

  下游引物  ACACAGAATAGCTTGCCTGAGTGCTGTATG  30  HBV YIDD/YMDD引物序列(5’→3’)  长度(nt)  上游引物  CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC  30  下游引物  GG(CT)A(AT)AAAGGGACTCA(AC)GATG  30

(2)荧光标记探针：GCATCACTCAGAGGG

模板：CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG

荧光标记探针要进行5’磷酸化和3’探针标记(本例用FAM)。

(3)标记探针

探针名称  HBV1896(G/A)标记探针序列(5’→3’)  长度(nt)和模板配对部分  AAAGCCACCCAAGGCACA  18和通用模板配对部分  CGCAAACCTGTACTC  15随机序列  ACCTACCT  8探针总序列^＊  AAAGCCACCCAAGGCACAACCTACCTCGCAAACCTGTACTC  41探针名称  HBV YIDD/YMDD(G/T)标记探针序列(5’→3’)  长度(nt)和模板配对部分  ATATAACTGAAAGCCAAACAG  22和通用模板配对部分  CGCAAACCTGTACTC  15随机序列  ACCTACCTA  9探针总序列^*  ATATAACTGAAAGCCAAACAGACCTACCTACGCAAACCTGTACTC  46

注：*表示探针要进行5’磷酸化

(4)检测探针一

  探针名称  HBV1896_G探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对  部分  GGTCAATGTCCATGCCCC  19  随机序列  ACCTACCTACCTACCTACCTA  22  探针总序列  GGTCAATGTCCATGCCCCACCTACCTACCTACCTACCTAC  41  探针名称  HBV YIDD/YMDD_G探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对  部分  GCCCCCAATACCACATCATCC  22  随机序列  ACCTACCTACCTACCTACCTACC  24  探针总序列  ACCTACCTACCTACCTACCTACCGCCCCCAATACCACATCATCC  46

(5)检测探针二

  探针名称  HBV1896_A探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对  部分  GGTCAATGTCCATGCCCT  19  随机序列  ACCTACCTACCTACCTACCTACCTAC  27  探针总序列  GGTCAATGTCCATGCCCTACCTACCTACCTACCTACCTACCTAC  46  探针名称  HBV YIDD/YMDD_T探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对  部分  GCCCCCAATACCACATCATCA  22  随机序列  ACCTACCTACCTACCTACCTACCTACCTAC  29  探针总序列  ACCTACCTACCTACCTACCTACCTACCTACGCCCCCAATACCACAT  CATCA  51

2.PCR反应

反应混合液为：200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，200μMdGTP，2mM MgCl₂，2U Taq DNA聚合酶，各1μM的上下游引物，1μl基因组模板(浓度大于5ng/μl)。反应条件为：94℃30秒，60℃30秒，72℃45秒，循环30次。

3.LDR反应

反应混合液为：20mM Tris-HCl，pH 8.3(at 25℃)，50mM KCl，10mM MgCl₂，1mM EDTA，1mM NAD+，10mM DTT，0.1％(v/v)Triton X-100，探针各0.01μM，Taq连接酶15U，1μl PCR模板DNA。反应条件为：94℃30秒，60℃2分钟，循环30次。

4.上测序仪器进行检测

结果见图3-4。

实施例三：对人基因组多个位点(SNP)同时进行多态性检测

同时对5个SNP位点(rs4652678、rs199930、rs7043268、rs6424820和rs4133072)进行SNP分型，每个SNP突变位点间隔是5个碱基。

1.引物和探针设计

(1)普通PCR引物设计

  rs4652678引物序列(5’→3’)  长度(nt)  上游引物  CTTCTGTAGAATGAGGTATAGTGAGGAGGC  30  下游引物  GTCAGCAGAGCCCAGATAATGTTGTCGTAG  30  rs199930引物序列(5’→3’)  长度(nt)  上游引物  GAGGGCTGGCAGGAGATTATGCTGTCATGC  30  下游引物  GGTAAAAGCACAATGTTGCTCACCAAGAAG  30  rs7043268引物序列(5’→3’)  长度(nt)  上游引物  CTCTGGATTTGACATTGCTTTTCAGGAGTG  30  下游引物  TTAGTGAGAGGGATCAGGAAACCAAGGAAG  30  rs6424820引物序列(5’→3’)  长度(nt)  上游引物  AGGACGGGACCTGATGTAGTGTGAACAGTC  30  下游引物  ACCTCCTCCCACACTGGCACCAACACACCA  30  rs4133072引物序列(5’→3’)  长度(nt)  上游引物  AAGAACTGTAACAACAAAGCAGCAATATGA  30  下游引物  CGATGGAAAATGTTTTACAAAATGGAAGAC  30

(2)荧光标记探针：GCATCACTCAGAGGG

模板：CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG

荧光标记探针要进行5’磷酸化和3’探针标记(本例用FAM)。

(3)标记探针

 探针名称  rs4652678(C/T)标记探针序列(5’→3’)  长度(nt) 和模板配对 部分  CTACATAGTTGCCTCTAAAAC  20 和通用模板 配对部分  CGCAAACCTGTACTC  15 随机序列  GTACGT  6 探针总序列^*  CTACATAGTTGCCTCTAAAACGTACGTCGCAAACCTGTACTC  41 探针名称  rs199930(C/T)标记探针序列(5’→3’)  长度(nt) 和模板配对 部分  TTCTCGTTCTGCCCTGATGGTGCGG  25 和通用模板 配对部分  CGCAAACCTGTACTC  15 随机序列  GTACGT  6 探针总序列^*  TTCTCGTTCTGCCCTGATGGTGCGGGTACGTCGCAAACCTGTAC  46

 TC 探针名称 rs7043268(G/A)标记探针序列(5’→3’)  长度(nt) 和模板配对 部分 GGGGTCCATACAAGCCAACTGGAA  25 和通用模板 配对部分 CGCAAACCTGTACTC  15 随机序列 GTACGTACGTA  11 探针总序列^* GGGGTCCATACAAGCCAACTGGAAGTACGTACGTACGCAAACC TGTACTC  51 探针名称 rs6424820(C/G)标记探针序列(5’→3’)  长度(nt) 和模板配对 部分 CTCCTATATTTGGATTTCATGATG  25 和通用模板 配对部分 CGCAAACCTGTACTC  15 随机序列 GTACGTACGTACGTAC  16 探针总序列^* CTCCTATATTTGGATTTCATGATGGTACGTACGTACGTACCGCAA ACCTGTACTC  56 探针名称 rs4133072(A/G)标记探针序列(5’→3’)  长度(nt) 和模板配对 部分 CATAACAAAAGCAAGCAATGCTA  23 和通用模板 配对部分 CGCAAACCTGTACTC  15 随机序列 GTACGTACGTACGTACGTACGTA  23 探针总序列^* CATAACAAAAGCAAGCAATGCTAGTACGTACGTACGTACGTACG TACGCAAACCTGTACTC  61

注：*表示探针要进行5’磷酸化

(4)检测探针一

  探针名称  rs4652678_C探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对  部分  CTTCACCTCCATCTTGTTTTTCTCG  25  随机序列  GTACGTACGTACGTAC  16  探针总序列  GTACGTACGTACGTACCTTCACCTCCATCTTGTTTTTCTCG  41  探针名称  rs199930_C探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对  部分  GGCCAGATCGGTGCCGCAGCGTTCG  25  随机序列  GTACGTACGTACGTACGTACG  21  探针总序列  GTACGTACGTACGTACGTACGGGCCAGATCGGTGCCGCAGCGTT  CG  46  探针名称  rs7043268_G探针序列(5’→3’)  长度(nt)

  和模板配对  部分GTTCTTGGAACTGTCCGTCATCGGC25  随机序列GTACGTACGTACGTACGTACGTACGT26  探针总序列GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTGTTCTTGGAACTGTCCGTCATCGGC51  探针名称rs6424820_C探针序列(5’→3’)长度(nt)  和模板配对  部分ACATTGTGCATCAATATGTACTTG25  随机序列GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTA31  探针总序列GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTAACATTGTGCATCAATATGTACTTG56  探针名称rs4133072_A探针序列(5’→3’)长度(nt)  和模板配对  部分CAACTACAGTATCTAGAACAGTGAT25  随机序列GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTAC36  探针总序列GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACCAACTACAGTATCTAGAACAGTGAT61

(5)检测探针二

  探针名称  rs4652678_T探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对部  分  CTTCACCTCCATCTTGTTTTTCTCA  25  随机序列  GTACGTACGTACGTACGTACG  21  探针总序列  GTACGTACGTACGTACGTACGCACCTCCATCTTGTTTTTCTCA  46  探针名称  rs199930_T探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对部  分  GGCCAGATCGGTGCCGCAGCGTTCA  25  随机序列  GTACGTACGTACGTACGTACGTACGT  26  探针总序列  GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTGGCCAGATCGGTGCCGCAG  CGTTCA  51  探针名称  rs7043268_A探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对部  分  GTTCTTGGAACTGTCCGTCATCGGTGGC  25  随机序列  GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTA  31  探针总序列  GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTAGTTCTTGGAACTGTC  CGTCATCGGTGGC  56  探针名称  rs6424820_G探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对部  分  ACATTGTGCATCAATATGTACTTC  25  随机序列  GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTAC  36  探针总序列  GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACACATTGTGCA  61

  TCAATATGTACTTC  探针名称  rs4133072_G探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对部  分  TCAACTACAGTATCTAGAACAGTGAC  25  随机序列  GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACG  41  探针总序列  GTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTCAAC  TACAGTATCTAGAACAGTGAC  66

2.PCR反应

反应混合液为：200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，200μMdGTP，2mM MgCl₂，2U Taq DNA聚合酶，各1μM的上下游引物，1μl基因组模板(浓度大于5ng/μl)。反应条件为：94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒，循环30次。

3.LDR反应

反应混合液为：20mM Tris-HCl，pH 8.3(at 25℃)，50mM KCl，10mM MgCl₂，1mM EDTA，1mM NAD+，10mM DTT，0.1％(v/v)Triton X-100，探针各0.01μM，Taq连接酶15U，1μl PCR模板DNA。反应条件为：94℃30秒，60℃2分钟，循环30次。

4.上测序仪器进行检测

结果如下表：

  rs4652678  (C/T)  rs199930  (C/T)  rs7043268  (G/A)  rs6424820  (C/G)  rs4133072  (A/G)  图5  C/T  C  G/A  C/G  A  图6  C  C  A  G  A  图7  C/T  C  G  C  A

实施例四：对人基因组多个位点(SNP)同时进行多态性检测同时对6个SNP位点(rs348475、rs499776、rs4646642、rs2161811、rs561712和rs4646580)进行SNP分型，每个SNP突变位点间隔调整为3个碱基。

1.引物和探针设计

(1)普通PCR引物设计

  rs348475引物序列(5’→3’)  长度(nt)  上游引物  ACATAAGTTTAATTGAACACAGCACATAGC  30  下游引物  ATACCAGATAAGACGTGGAAAAAAATCTTC  30  rs499776引物序列(5’→3’)  长度(nt)  上游引物  GGTTCAGTGGCACAAAAGCACAAAAGTGGC  30  下游引物  GAGGAATCTGAGGCTAATAGGCAGCAGAGG  30  rs4646642引物序列(5’→3’)  长度(nt)  上游引物  TCTCGTGTCTTCATTTTCCTCCTTCCAGGC  30  下游引物  GCTCGTGGCATTTTCATTCTGGTCTGACTC  30  rs2161811引物序列(5’→3’)  长度(nt)  上游引物  GTGGCGGGTACAAACCAACTTAATGTTTCA  30  下游引物  TTTACAGATGGCTCCTGTCCAGTGGGGGGA  30  rs561712引物序列(5’→3’)  长度(nt)  上游引物  TAACCTCCTCCCTTCTCTGCTGAATCCTCA  30  下游引物  TCGCCCACATCAAAACCACTTCTGCTTTTC  30  rs4646580引物序列(5’→3’)  长度(nt)  上游引物  ATACTACTTACTTTGAGGACAGTGCTGTGG  30  下游引物  CATCTTAGAATAACACTTTGGGGAAATAAG  30

(2)荧光标记探针：GCATCACTCAGAGGG

模板：CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG

荧光标记探针要进行5’磷酸化和3’探针标记(本例用FAM)。

(3)标记探针

 探针名称  rs348475(A/G)标记探针序列(5’→3’)  长度(nt) 和模板配对 部分  GAACAGCTAGCTTGCTACTTC  20 和通用模板 配对部分  CGCAAACCTGTACTC  15 随机序列  TTCGTT  6 探针总序列^*  GTAGAACAGCTAGCTTGCTACTTCGTTCGCAAACCTGTACTC  41

 探针名称  rs499776(A/G)标记探针序列(5’→3’)  长度(nt) 和模板配对 部分  ATTTACAGCAATGGGGCAGGTATG  23 和通用模板 配对部分  CGCAAACCTGTACTC  15 随机序列  TTCGTT  6 探针总序列^*  ATTTACAGCAATGGGGCAGGTATGTTCGTTCGCAAACCTGTACT  C  44 探针名称  rs2161811(A/G)标记探针序列(5’→3’)  长度(nt) 和模板配对 部分  TGGTGTCAAACAGTCAACTTGGGA  25 和通用模板 配对部分  CGCAAACCTGTACTC  15 随机序列  TTCGTTC  7 探针总序列^*  TGGTGTCAAACAGTCAACTTGGGA  TTCGTTCCGCAAACCTGTACTC  47 探针名称  rs561712(A/G)标记探针序列(5’→3’)  长度(nt) 和模板配对 部分  GGCTACCTACATGATCGTAAACAGA  25 和通用模板 配对部分  CGCAAACCTGTACTC  15 随机序列  TTCGTTCGTT  10 探针总序列^*  GGCTACCTACATGATCGTAAACAGATTCGTTCGTTCGCAAACCT  GTACTC  50 探针名称  rs4646580(C/T)标记探针序列(5’→3’)  长度(nt) 和模板配对 部分  TTTAAGAAGTGTAACAAAGAAGAAA  25 和通用模板 配对部分  CGCAAACCTGTACTC  15 随机序列  TTCGTTCGTTCGT  13 探针总序列^*  TTTAAGAAGTGTAACAAAGAAGAAATTCGTTCGTTCGTCGCAA  ACCTGTACTC  53 探针名称  rs4646642(C/T)标记探针序列(5’→3’)  长度(nt) 和模板配对 部分  AAAATTGTTCCCGGCCCAAACATC  25 和通用模板 配对部分  CGCAAACCTGTACTC  15 随机序列  TTCGTTCGTTCGTTCG  16 探针总序列^*  AAAATTGTTCCCGGCCCAAACATCTTCGTTCGTTCGTTCGCGCA  AACCTGTACTC  56

注：*表示探针要进行5’磷酸化。

(4)检测探针一

  探针名称 rs348475_A探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对部  分 GTGTTCCTATAATATATTAATATAT  25  随机序列 TTCGTTCGTTCGTTCG  16  探针总序列 TTCGTTCGTTCGTTCGGTGTTCCTATAATATATTAATATAT  41  探针名称 rs499776_A探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对部  分 CATGCCTTTGACCCCCACACAGT  25  随机序列 TTCGTTCGTTCGTTCGTTC  19  探针总序列 TTCGTTCGTTCGTTCGTTCCATGCCTTTGACCCCCACACAGT  44  探针名称 rs216181_A探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对部  分 CAGACAGGAAGCCAAACACAAAGGT  25  随机序列 TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT  22  探针总序列 TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCAGACAGGAAGCCAAACACAAAG GT  47  探针名称 rs561712_A探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对部  分 GATTACAGGCATTTCCCAAGTCAAT  25  随机序列 TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGT  25  探针总序列 TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTGATTACAGGCATTTCCCAAGT CAAT  50  探针名称 rs4646580_C探针序列(5’→3’)  和模板配对部  分 CTCAGAAGATTATCTGATACCCCGG  25  随机序列 TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCG  28  探针总序列 TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGCTCAGAAGATTATCTGATA CCCCGG  53  探针名称 rs4646642C探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对部  分 GATAATTTGGCTTTACAACCTTGG  25  随机序列 TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTC  31  探针总序列 TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGATAATTTGGCTTTAC AACCTTGG  56

(5)检测探针二

  探针名称  rs348475_G探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对  部分  GTGTTCCTATAATATATTAATATAC  25  随机序列  TTCGTTCGTTCGTTCGTTC  19  探针总序列  TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTGTTCCTATAATATATTAATATAC  44  探针名称  rs499776_G探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对  部分  CATGCCTTTGACCCCCACACAGC  25  随机序列  TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT  22  探针总序列  TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT CATGCCTTTGACCCCCACACAGC  47  探针名称  rs2161811_G探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对  部分  CAGACAGGAAGCCAAACACAAAGGC  25  随机序列  TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGT  25  探针总序列  TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTCAGACAGGAAGCCAAACACAA  AGGC  50  探针名称  rs561712_G探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对  部分  GATTACAGGCATTTCCCAAGTCAAC  25  随机序列  TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCG  28  探针总序列  TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGGATTACAGGCATTTCCCAA  GTCAAC  53  探针名称  rs4646580_T探针序列(5’→3’)  和模板配对  部分  CTCAGAAGATTATCTGATACCCCGA  25  随机序列  TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTC  31  探针总序列  TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCCTCAGAAGATTATCTGA  TACCCCGA  56  探针名称  rs4646642_T探针序列(5’→3’)  长度(nt)  和模板配对  部分  GATAATTTGGCTTTACAACCTTGA  25  随机序列  TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT  34  探针总序列  TTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTCGTTGATAATTTGGCTTT  ACAACCTTGA  59

2.PCR反应

反应混合液为：200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，200μMdGTP，2mM MgCl₂，2U Taq DNA聚合酶，各1μM的上下游引物，1μl基因组模板(浓度大于5ng/μl)。反应条件为：94℃30秒，62℃30秒，72℃45秒，循环30次。

3.LDR反应

反应混合液为：20mM Tris-HCl，pH 8.3(at 25℃)，50mM KCl，10mM MgCl₂，1mM EDTA，1mM NAD+，10mM DTT，0.1％(v/v)Triton X-100，探针各0.01μM，Taq连接酶15U，1μl PCR模板DNA。反应条件为：94℃30秒，60℃2分钟，循环30次。

4.上测序仪器进行检测

结果如下表：

  rs348475  (A/G)  rs499776  (A/G)  rs2161811  (A/G)  rs561712  (A/G)  rs4646580  (C/T) rs4646642 (C/T)  图8  A/G  G  A  A  C/T  C/T  图9  A/G  A/G  A  A/G  C/T  C/T  图10  G  G  A  A  T  T