在植物中用于提高对非生物性应激的应激抵御的活性成分以及发现该活性成分的方法

摘要

本发明涉及一种通过提高植物内源性蛋白的表达来发现提高植物对作用于该植物上的非生物性应激因子耐受性的化合物的方法，例如温度(例如寒冷、霜冻或热)，水(例如干燥、干旱或缺氧)，或化学性负荷(例如缺乏或过量的矿物盐类、重金属类、有毒气体物质)，并且涉及将该化合物用于提高植物对非生物性应激因子的耐受性的用途。

说明书

本发明涉及一种通过提高植物内源性蛋白的表达来发现提高植物 针对作用于该植物的非生物性应激因子的耐受性的化合物的方法，例 如温度(例如寒冷、霜冻或热)，水(例如干燥、干旱或缺氧)，或 化学性负担(例如缺乏或过量的矿物盐类、重金属类、有毒气体物质)， 并且涉及将该化合物用于提高对非生物性应激因子的植物耐受性的用 途。

已知的是，植物针对自然应激条件，例如寒冷、热、干旱、创伤、 病原物侵袭(病毒、细菌、真菌、昆虫)等，而且还有除草剂，以特 异性或非特异性的抵御机制应答[Pflanzenbiochemie，第393-462页， Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Berlin，Oxford，Hans W.Heldt，1996.；Biochemistry and Molecular Biology of Plants， 第1102-1203页，American Society of Plant Physiologists， Rockville，Maryland，eds.Buchanan，Gruissem，Jones，2000]。

在植物中，已知大量参与对抗非生物性应激(例如寒冷、热、干旱、 盐)的抵御应答的蛋白和编码它们的基因。它们部分属于信号转导链(例 如转录因子、激酶、磷酸酯酶)，或者引发植物细胞的生理应答(例如 离子迁移、活性氧类的解毒)。非生物性应激应答的信号链基因尤其包 括DREB和CBF类的转录因子(Jaglo-Ottosen等，1998，Science 280： 104-106)。ATPK和MP2C类的磷酸酯酶参与对盐应激的反应。此外，盐 应激通常激活渗透剂(Osmolyten)例如脯氨酸或蔗糖的生物合成。其 中参与的是蔗糖合酶和脯氨酸转运子(Hasegawa等，2000，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 51：463-499)。植物对寒冷和干旱应 激的抵御，部分利用相同的分子机制。已知的是所谓胚胎发生后期丰富 蛋白(LEA蛋白)的蓄积，脱水蛋白属于其中重要的一类(Ingram and Bartels，1996，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47：277-403， Close，1997，Physiol Plant 100：291-296)。其中涉及在承受应激 的植物中稳定泡囊、蛋白和膜结构的伴侣蛋白(Bray，1993，Plant Physiol 103：1035-1040)。此外，经常导致醛脱氢酶的诱导，其解毒 在氧化活性应激的情形下产生的活性氧类(ROSs)(Kirch等，2005， Plant Mol Biol 57：315-332)。热冲击因子(HSFs)和热冲击蛋白(HSPs) 在热应激条件下被激活，并且在寒冷和干旱应激情形下，其作为伴侣蛋 白扮演与脱水蛋白类似的角色(Yu等，2005，Mol Cells 19：328-333)。

所描述的分子机制的大多数是通过诱导基因表达激活的。由此提 供了借助转录组序列分析(例如通过基因表达模型(GEP))用DNA 微阵列或用相当的技术来表征特异性应激应答的可能性(Rensink等， 2005，Genome 48：598-605，Cheong等，2002，Plant Physiology 129： 661-677)。以这种方式，可以记录特异性应激应答基因表达模式并且 进行相互对比。

此外已知的是化学物质可以提高植物对非生物性应激的耐受性。 这类物质在此是通过拌种、通过叶片喷洒或通过土壤处理施用的。因 此，已经公开了通过用系统性获得抗性(SAR)的诱导子(Elicitoren) 或用脱落酸衍生物处理来提高作物的非生物性应激耐受性(Schading and Wei，WO-200028055，Abrams and Gusta，US-5201931，Churchill 等，1998，Plant Growth Regul 25：35-45)。

当施用杀真菌剂，尤其是来自嗜球果伞素类的杀真菌剂时，可以 观察到相似的作用，其通常还伴随着产量的提高(Draber等， DE-3534948，Bartlett等，2002，Pest Manag Sci 60：309)。

此外，还描述了生长调节剂对作物的应激耐受性的作用(Morrison 和Andrews，1992，J Plant Growth Regul 11：113-117，RD-259027)。 在渗透应激的情形下，已经观察到施用渗透剂的保护效果，所述渗透 剂例如甘氨酸或其生化前体，例如胆碱衍生物(Chen等，2000，Plant Cell Environ 23：609-618，Bergmann等，DE-4103253)。也已经描 述了抗氧化剂例如萘酚和叶黄素用于提高植物中非生物性应激耐受性 的作用(Bergmann等，DD-277832，Bergmann等，DD-277835)。然 而，这些物质的抗应激作用的分子原因远远是未知的。

因此已知，植物具有多种内源性应答机制，可以针对不同的有害 生物体和/或自然非生物性应激产生有效抵御。然而至今仍不能预测， 通过施用活性物质能激发或调节哪一种针对性的抵御应答。

因此，需要一种能针对性发现植物内源性抵御非生物性应激(例 如热、寒冷、干旱、盐，以及酸负荷和碱负荷)机制的分子活化因子 的方法，从而可以发现新型的活性物质，鉴定特性已知但作用方式不 同的活性物质，或者对已知分子或先导结构进行优化，从而可以用作 植物内源性抵御非生物性应激因子机制的诱导物。

下面将定义所使用的术语

本文所用术语“BLAST分析”(Blast＝基本的局部比对检索工具) 是指利用适宜的计算机程序来分类和发现潜在的同源序列(Altschul 等，J.Mol.Biol.1990，215：403-410)，其中在序列(查询序列) 与一个或多个数据库中的所有序列之间的比对在以“显著标准”(评 分功能)形式的所希望的相符性的前提下进行(R.Rauhut， Bioinformatik，38-107页，Verlag Wiley-VCH Verlag GmbH， Weinheim，2001)。

本文所用术语“cDNA”(互补DNA)是指，互补于RNA且在体外通 过酶反转录而合成的DNA单链。该cDNA可以与RNA全长相对应或仅构 成作为模板用的RNA的部分序列。

本文所用术语“簇分析”是指通过为此开发的计算机程序将所获 得的各数据汇总，其中将编码具有相似功能的蛋白的基因，或者具有 相似表达模式的基因的组，总结性地显示。由此使复杂的数据模式进 行最简化的分级，从而可以以树状图形式显示。簇分析能对所得数据 组进行分类评估，所述数据组明显区别于无关数据的简单堆积。

在本文中同义的术语“DNA芯片”和“DNA微阵列”描述一种载体， 其基础材料由例如玻璃或尼龙构成，在其基础材料上固定有DNA片段， 其中DNA的涂覆例如采用(a)照相平版印刷法(DNA直接在阵列载体上 合成)，(b)微点触法(外源合成的寡核苷酸或PCR产物应用到载体上 并共价结合)，或(c)采用微喷墨法(利用喷墨装置将外源合成的寡核 苷酸或PCR产物不进行接触地喷射到载体上)来实现(R.Rauhut， Bioinformatik，197-199页，Verlag Wiley-VCH Verlag GmbH， Weinheim，2001)。代表生物体基因组序列的DNA芯片编号为“基因 组DNA芯片”。用这些“DNA芯片获得的数据评价”编号为“DNA芯片 分析”。

本文所用术语“DNA芯片杂交”意思是两个单链、互补性核酸分 子配对，其中一个碱基配对分子伴侣蛋白以优选的共价结合形式位于 DNA芯片上做DNA(脱氧核糖核酸)，而另一个是以RNA(核糖核酸) 或相应的cDNA(互补DNA)形式预置于溶液中。结合和未结合的核酸 杂交在含水缓冲液中于DNA芯片上进行，任选地在附加的变性条件下， 例如在存在二甲基亚砜的条件下，于30-60℃，优选40-50℃，特别优 选45℃持续运转20小时，优选14-18小时，特别优选16小时。所述 杂交条件可以是恒定地例如在杂交炉实现。根据标准，在这样的杂交 炉中以60rpm(每分钟转数)运转。

在本文中使用的，用术语“EST序列”(表达序列标记)描述的核 酸序列是指200-500个碱基或碱基对的短序列。

在本文中同义使用的术语“表达模式”，“诱导模式”和“表达 模式”是指植物mRNA随时间的差异性表达和/或组织特异性表达，借 助于DNA芯片技术，直接通过获自植物的RNA或其相应cDNA的杂交信 号所产生的强度而获得所述模式。通过用相应的信号直接计算给出所 测定的“诱导值”，所述相应的信号是通过施用同义芯片在与未经处 理/经施压的对照植物杂交获得的。

在本文中，通过预定的“基因表达模式”获得的术语“表达状态”， 是指借助DNA芯片的帮助而测量的全部记录的细胞基因转录活性。

本文所用术语“总RNA”是指基于所使用的溶解法在植物细胞中 可能存在的不同植物内源性RNA组的可能的代表，例如细胞质rRNA(核 糖体RNA)，细胞质tRNA(转运RNA)，细胞质mRNA(信使RNA)以及各自 的细胞核前体，ctRNA(叶绿体RNA)和mtRNA(线粒体RNA)，但还包括 来自外源生物体如病毒或寄生菌和真菌的RNA分子。

在本文中，术语“有用植物”指用作获得食物、饲料或用于工业 目的的植物的作物。

本文所使用的术语“安全剂”指非植物内源性来源的化学化合物， 其抵消或降低农药对有用植物的植物毒性性能，而不实质性降低对有 害生物体例如杂草、细菌、病毒和真菌的农药活性。

除了其本来就已知的功能外，还有助于提高对非生物性应激因子 的耐受性的安全剂优选选自下组，其中根据非生物性应激因子可以选 择不同的安全剂，可以仅使用单一的安全剂或选自相同组或不同组的 多种安全剂使用：

a)式(I)至(III)化合物，

其中各符号和标示具有如下定义：

n′为0至5的自然数，优选0至3；

T为(C₁或C₂)-烷二基链，其是未经取代或经一个或两个(C₁-C₄)烷 基取代的，或经[(C₁-C₃)烷氧基]羰基取代的；

W为未经取代或经取代的二价杂环基团，所述基团是选自部分不 饱和或具有1至3个N或O类的杂环原子的芳族5元杂环，其中该环 中包含至少一个氮原子和不超过一个氧原子，优选选自组(W1)至(W4) 的基团，

m′为0或1；

R¹⁷、R¹⁹相同或不同地为卤素、(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基、硝基 或(C₁-C₄)卤烷基；

R¹⁸、R²⁰相同或不同地为OR²⁴、SR²⁴或NR²⁴R²⁵，或饱和或不饱和的 3-至7元杂环，该杂环具有至少一个氮原子和至多3个优选选自O和 S的杂原子，该杂环通过氮原子与(II)或(III)中的羰基相连，并且其 是未经取代的或经选自下组基团取代的：(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基 或任选经取代的苯基，优选式OR²⁴，NHR²⁵或N(CH₃)₂的基团，尤其是式 OR²⁴；

R²⁴为氢或未经取代或经取代的脂族烃基，优选具有总计1至18 个碳原子；

R²⁵为卤素、(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)烷氧基或经取代或未经取代的苯 基；

R^X为H、(C₁-C₈)烷基、C₁-C₈(卤烷基)、(C₁-C₄)烷氧基(C₁-C₈)烷基、 氰基或COOR²⁶，其中R²⁶为氢、(C₁-C₈)烷基、(C₁-C₈)卤烷基、(C₁-C₄)烷 氧基-(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₆)羟烷基、(C₃-C₁₂)环烷基或三(C₁-C₄)烷基甲 硅烷基；

R²⁷、R²⁸、R²⁹相同或不同地为氢、(C₁-C₈)烷基、(C₁-C₈)卤烷基、(C₃-C₁₂) 环烷基或经取代或未经取代的苯基；

R²¹为(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)卤烷基、(C₂-C₄)烯基、(C₂-C₄)卤烯基、 (C₃-C₇)环烷基，优选为二氯甲基；

R²²、R²³相同或不同地为氢、(C₁-C₄)烷基、(C₂-C₄)烯基、(C₂-C₄)炔 基、(C₁-C₄)卤烷基、(C₂-C₄)卤烯基、(C₁-C₄)烷基氨基甲酰基-(C₁-C₄) 烷基、(C₂-C₄)烯基氨基甲酰基-(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基-(C₁-C₄)烷 基、二氧戊环-(C₁-C₄)烷基、噻唑基、呋喃基、呋喃基烷基、噻吩基、 哌啶基、经取代或未经取代的苯基，或R²²和R²³一起形成经取代或未 经取代的杂环，优选恶唑烷环，噻唑烷环、哌啶环、吗啉环、六氢嘧 啶环或苯并恶嗪环；

b)一种或多种选自下组的化合物：

1，8-萘二甲酸酐，

二苯基甲氧基乙酸甲酯，

1-(2-氯苄基)-3-(1-甲基-1-苯乙基)脲(苄草隆)，

S-2-乙基硫代乙基二硫代磷酸O，O-二乙酯(乙拌磷)，

4-氯苯基-甲基氨基甲酸酯(Mephenate)，

O-苯基硫代磷酸O，O-二乙酯(Dietholate)，

4-羧基-3，4-二氢-2H-1-苯并吡喃-4-乙酸(CL-304415，CAS-Regno： 31541-57-8)，

氰基甲氧基亚氨基(苯基)乙腈(解草胺腈)，

1，3-二氧杂环戊-2-基甲氧亚氨基(苯基)乙腈(解草腈)，

4′-氯-2，2，2-三氟苯乙酮O-1，3-二氧杂环戊-2-基甲基肟(肟草 安)，

4，6-二氯-2-苯基嘧啶(解草啶)，

2-氯-4-三氟甲基-1，3-噻唑-5-羧酸苄酯(解草安)，

2-二氯甲基-2-甲基-1，3-二氧杂环戊烷(MG-191)，

N-(4-甲基苯基)-N′-(1-甲基-1-苯乙基)脲(香草隆)，

(2，4-二氯苯氧基)乙酸(2，4-D)，

(4-氯苯氧基)乙酸，

(R，S)-2-(4-氯-邻-甲苯氧基)丙酸(2甲4氯丙酸)，

4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸(2，4-DB)，

(4-氯-邻-甲苯氧基)乙酸(MCPA)，

4-(4-氯-邻-甲苯氧基)丁酸，

4-(4-氯苯氧基)丁酸，

3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸(麦草畏)，

3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸1-(乙氧羰基)乙酯(Lactidichlor) 及其盐和酯，优选(C₁-C₈)酯；

c)式(IV)的N-酰基磺酰胺及其盐

其中

R³⁰为氢、烃基、烃氧基、烃硫基或杂环基(其优选经碳原子键合)， 其中最后4个所述基团是未经取代或经一个或多个相同或不同的选自 下组基团取代的：卤素、氰基、硝基、氨基、羟基、羧基、甲酰基、 羧酰胺、磺酰胺和式-Z^aR^a的基团，

其中各烃基部分优选具有1至20个碳原子，并且包含取代基的含 碳基团R³⁰优选具有1至30个碳原子；

R³¹为氢或(C₁-C₄)-烷基，优选氢，或

R³⁰和R³¹与式-CO-N-的基团一起为3-至8-元饱和或不饱和环的基 团；

R³²相同或不同地为卤素、氰基、硝基、氨基、羟基、羧基、甲酰 基、CONH₂、SO₂NH₂或式-Z^b-R^b的基团；

R³³为氢或(C₁-C₄)-烷基，优选氢；

R³⁴相同或不同地为卤素、氰基、硝基、氨基、羟基、羧基、CHO、 CONH₂、SO₂NH₂或式-Z^c-R^c的基团；

R^a为烃基或杂环基，其中最后两个所述基团是未经取代的或经一 个或多个相同或不同的选自下组基团取代的：卤素、氰基、硝基、氨 基、羟基、单-和二-[(C₁-C₄)-烷基]氨基，或由烷基取代，其中多个、 优选2或3个非相邻的CH₂基团各自被一个氧原子所代替；

R^b、R^c为相同或不同的烃基或杂环基，其中最后两个所述基团是 未经取代的或经一个或多个相同或不同的选自下组基团取代的：卤素、 氰基、硝基、氨基、羟基、磷酰基、卤代-(C₁-C₄)-烷氧基、单-和二 -[(C₁-C₄)-烷基]氨基，或烷基，其中多个、优选2或3个非相邻的CH₂基团各自被一个氧原子所代替；

Z^a为下式的二价基团：-O-、-S-、-CO-、-CS-、-CO-O-、-CO-S-、 -O-CO-、-S-CO-、-SO-、-SO₂-、-NR^*-、-CO-NR^*-、-NR^*-CO-、-SO₂-NR^*- 或-NR^*-SO₂-，其中在所述二价基团右边的键是键接于基团R^a的，并 且在最后5个所述基团中的R^*各自独立地为H、(C₁-C₄)-烷基或卤代 -(C₁-C₄)-烷基；

Z^b、Z^c各自独立地为直键或下式的二价基团：-O-、-S-、-CO-、 -CS-、-CO-O-、-CO-S-、-O-CO-、-S-CO-、-SO-、-SO₂-、-NR^*-、-SO₂-NR^*-、 -NR^*-SO₂-、-CO-NR^*-或-NR^*-CO-，其中在所述二价基团右边的键是键 接于基团R^b或R^c的，并且在最后5个所述基团中的R^*各自独立地为H、 (C₁-C₄)-烷基或卤代-(C₁-C₄)-烷基；

n为0至4的整数，优选0、1或2，尤其是0或1，和

m为0至5的整数，优选0、1、2或3，尤其是0、1或2；

d)式(V)的酰基氨磺酰基苯甲酰胺类，任选地还以其盐形式，

其中

X³为CH或N；

R³⁵为氢、杂环基或烃基，其中最后两个所述基团是任选经一个或 多个相同或不同的选自下组基团取代的：卤素、氰基、硝基、氨基、 羟基、羧基、CHO、CHO、CONH₂、SO₂NH₂和Z^a-R^a；

R³⁶为氢、羟基、(C₁-C₆)-烷基、(C₂-C₆)-烯基、(C₂-C₆)-炔基、(C₁-C₆)- 烷氧基、(C₂-C₆)-烯氧基，其中最后5个所述基团是任选经一个或多个 相同或不同的选自下组基团取代的：卤素、羟基、羟基、(C₁-C₄)-烷基、 (C₁-C₄)-烷氧基和(C₁-C₄)-烷硫基，或

R³⁵和R³⁶与其携带的氮原子一起为3-至8-元饱和或不饱和环；

R³⁷为卤素、氰基、硝基、氨基、羟基、羧基、CHO、CONH₂、SO₂NH₂或Z^b-R^b；

R³⁸为氢、(C₁-C₄)-烷基、(C₂-C₄)-烯基或(C₂-C₄)-炔基；

R³⁹为卤素、氰基、硝基、氨基、羟基、羧基、磷酰基、CHO、CONH₂、 SO₂NH₂或Z^c-R^c；

R^a为碳链被氧原子间断一次或多次的(C₂-C₂₀)-烷基，或为杂环基 或烃基，其中最后两个所述基团是任选经一个或多个相同或不同的选 自下组基团取代的：卤素、氰基、硝基、氨基、羟基、单-和二-[(C₁-C₄)- 烷基]氨基；

R^b、R^c为碳链被氧原子间断一次或多次的(C₂-C₂₀)-烷基，或为杂环 基或烃基，其中最后两个所述基团是任选经一个或多个相同或不同的 选自下组基团取代的：卤素、氰基、硝基、氨基、羟基、磷酰基、(C₁-_C4)- 卤烷氧基、单-和二-[(C₁-C₄)-烷基]氨基；

Z^a为选自下组的二价单元：O、S、CO、CS、C(O)O、C(O)S、SO、 SO₂、NR^d、C(O)NR^d或SO₂NR^d；

Z^b、Z^c相同或不同地为直键或选自下组的二价单元：O、S、CO、 CS、C(O)O、C(O)S、SO、SO₂、NR^d、SO₂NR^d或C(O)NR^d；

R^d为氢、(C₁-C₄)-烷基或(C₁-C₄)-卤烷基；

n为0至4的整数，和

若X为CH，则m为0至5的整数，若X为N，则m为0至4的整 数；

e)酰基氨磺酰基苯甲酰胺类的化合物，例如下式(VI)，其中例 如已知于WO 99/16744，

例如其中为如下定义的化合物：

R²¹＝环丙基并且R²²＝H(S3-1＝4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基 苯甲酰基)苯磺酰胺)，

R²¹＝环丙基并且R²²＝5-Cl(S3-2)，

R²¹＝乙基并且R²²＝H(S3-3)，

R²¹＝异丙基并且R²²-5-Cl(S3-4)，和

R²¹＝异丙基并且R²²＝H(S3-5)；

f)式(VII)的N-酰基氨磺酰基苯基脲类化合物，其中例如已知于 EP-A-365484，

其中

A为选自下组的基团：

R^α和R^β各自独立地为氢、C₁-C₈-烷基、C₃-C₈-环烷基、C₃-C₆-烯基、 C₃-C₆-炔基，

或经C₁-C₄-烷氧基或经如下基团取代的C₁-C₄-烷 氧基，或

R^α和R^β一起为C₄-C₆-亚烷基桥或经氧、硫、SO、SO₂、NH或-N(C₁-C₄- 烷基)-间断的C₄-C₆-亚烷基桥，

R^γ为氢或C₁-C₄-烷基，

R^a和R^b各自独立地为氢、卤素、氰基、硝基、三氟甲基、C₁-C₄- 烷基、C₁-C₄-烷氧基、C₁-C₄-烷硫基、C₁-C₄-烷基亚磺酰基、C₁-C₄-烷基 磺酰基、-COOR^j、-CONR^kR^m、-CORⁿ、-SO₂NR^kR^m或-OSO₂-C₁-C₄-烷基，或 R^a和R^b一起为可以经卤素或C₁-C₄-烷基取代的C₃-C₄-亚烷基桥，或为 可以经卤素或C₁-C₄-烷基取代的C₃-C₄-亚烯基桥，或为可以经卤素或 C₁-C₄-烷基取代的C₄-亚二烯基桥，并且

R^g和R^h各自独立地为氢、卤素、C₁-C₄-烷基、三氟甲基、甲氧基、 甲硫基或-COOR^j，其中

R^c为氢、卤素、C₁-C₄-烷基或甲氧基，

R^d为氢、卤素、硝基、C₁-C₄-烷基、C₁-C₄-烷氧基、C₁-C₄-烷硫基、 C₁-C₄-烷基亚磺酰基、C₁-C₄-烷基磺酰基、-COOR^j或-CONR^kR^m，

R^e为氢、卤素、C₁-C₄-烷基、-COOR^j、三氟甲基或甲氧基，或R^d和R^e一起为C₃-C₄-亚烷基桥，

R^f为氢、卤素或C₁-C₄-烷基，

R^X和R^Y各自独立地为氢、卤素、C₁-C₄-烷基、C₁-C₄-烷氧基，C₁-C₄- 烷硫基、-COOR^j、三氟甲基、硝基或氰基，

R^j、R^k和R^m各自独立地为氢或C₁-C₄-烷基，

R^k和R^m一起为C₄-C₆-亚烷基桥或由氧、NH或-N(C₁-C₄-烷基)-间断 的C₄-C₆-亚烷基桥，和

Rⁿ为C₁-C₄-烷基、苯基或由卤素、C₁-C₄-烷基、甲氧基、硝基或三 氟甲基取代的苯基，

优选地

1-[4-(N-2-甲氧基苯甲酰基氨磺酰基)苯基]-3-甲脲，

1-[4-(N-2-甲氧基苯甲酰基氨磺酰基)苯基]-3，3-二甲脲，

1-[4-(N-4，5-二甲基苯甲酰基氨磺酰基)苯基]-3-甲脲，

1-[4-(N-萘甲酰基氨磺酰基)苯基]-3，3-二甲脲，

g)描述于EP-A-1019368中的式(VIII)的酰基氨磺酰基苯甲酰胺 类化合物，视需要也以其盐形式，

其中

R¹为甲基、甲氧基或三氟甲氧基；

R²为氢、氯或甲基；

R³为氢、乙基或炔丙基；

R⁴为乙基、环丙基、异丙基或炔丙基，或

R³和R⁴一起形成基团(CH₂)₄，

包括其立体异构体并且包括其农业上常用的盐。

式(I)化合物描述于例如EP-A-0 333 131(ZA-89/1960)、EP-A-0 269 806(US-A-4,891,057)、EP-A-0 346 620(AU-A-89/34951)、EP-A-0 174562、EP-A-0 346 620(WO-A-91/08 202)、WO-A-91/07 874或 WO-A 95/07 897(ZA 94/7120)以及其中所引用的文献中，或可以通 过或类似于其中所述的方法来加以制备。

式(II)化合物描述于例如EP-A-0 086 750，EP-A-0 94349 (US-A-4,902,340)、EP-A-0 191736(US-A-4,881,966)和EP-A-0 492 366以及其中所引用的文献中，或可以通过或类似于其中所述的方法 来加以制备。此外，部分化合物描述于EP-A-0 582 198和WO 2002/34048中。

式(III)化合物已知于多篇专利申请，例如US-A-4,021,224和 US-A-4,021,229。

组(b)化合物已知于CN-A-87/102789、EP-A-365484，并且已 知于″The Pesticide Manual″(农药手册)，The British Crop Protection Council and the Royal Society of Chemistry，第11 版，Farnham 1997。

组(c)化合物描述于WO-A-97/45016中，组(d)化合物描述于 WO-A-99/16744中，并且组B(e)化合物描述于EP-A-365484中以及 组(g)化合物描述于EP-A-1019368中。

所引用的文献含有关于制备方法和初始物质以及列举优选化合物 的详细说明。明确引用这些文献；通过引用其形成本说明书的一部分。

优选已知作为安全剂的式(I)和/或(II)化合物，其中符号和 标示具有如下定义：

R²⁴为氢、(C₁-C₁₈)-烷基、(C₃-C₁₂)-环烷基、(C₂-C₈)-烯基和(C₂-C₁₈)- 炔基，其中含碳基团可以是经一个或多个，优选高达3个R⁵⁰基团取代 的；

R⁵⁰相同或不同地为卤素、羟基、(C₁-C₈)-烷氧基、(C₁-C₈)-烷硫基、 (C₂-C₈)-烯硫基、(C₂-C₈)-炔硫基、(C₂-C₈)-烯氧基、(C₂-C₈)-炔氧基、 (C₃-C₇)-环烷基、(C₃-C₇)-环烷氧基、氰基、单-和二(C₁-C₄)-烷基氨基、 羧基、(C₁-C₈)-烷氧羰基、(C₂-C₈)-烯氧基羰基、(C₁-C₈)-烷硫基羰基、 (C₂-C₈)-炔氧基羰基、(C₁-C₈)-烷基羰基、(C₂-C₈)-烯基羰基、(C₂-C₈)- 炔基羰基、1-(肟基)-(C₁-C₆)-烷基、1-[(C₁-C₄)-烷基亚氨基]-(C₁-C₄)- 烷基、1-[(C₁-C₄)-烷氧基亚氨基]-(C₁-C₆)-烷基、(C₁-C₈)-烷基羰基 氨基、(C₂-C₈)-烯基羰基氨基、(C₂-C₈)-炔基羰基氨基、氨基羰基、 (C₁-C₈)-烷基氨基羰基、二-(C₁-C₆)-烷基氨基羰基、(C₂-C₆)-烯基氨基 羰基、(C₂-C₆)-炔基氨基羰基、(C₁-C₈)-烷氧羰基氨基、(C₁-C₈)-烷基 氨基羰基氨基、未经取代或经R⁵¹取代的(C₁-C₆)-烷基羰基氧基、 (C₂-C₆)-烯基羰基氧基、(C₂-C₆)-炔基羰基氧基、(C₁-C₈)-烷基磺酰基、 苯基、苯基-(C₁-C₆)-烷氧基、苯基-(C₁-C₆)-烷氧羰基、苯氧基、苯氧 基-(C₁-C₆)-烷氧基、苯氧基-(C₁-C₆)-烷氧羰基、苯基羰基氧基、苯基 羰基氨基、苯基-(C₁-C₆)-烷基羰基氨基，其中最后9个所述基团的苯 环是未经取代或经R⁵²基团单-或多取代的，优选高达三取代的；SiR′₃、 -O-SiR′₃、R′₃Si-(C₁-C₈)-烷氧基、-CO-O-NR′₂、-O-N＝CR′₂、-N＝CR′₂、 -O-NR′₂、-NR′₂、CH(OR′)₂、-O-(CH₂)_m-CH(OR′)₂、-CR′″(OR′)₂、 -O-(CH₂)_mCR′″(OR″)₂或R″O-CHR′″CHCOR″-(C₁-C₆)-烷氧基，

R⁵¹相同或不同地为卤素、硝基、(C₁-C₄)-烷氧基和未经取代或经 一个或多个，优选高达三个R⁵²基团取代的苯基；

R⁵²相同或不同地为卤素、(C₁-C₄)-烷基、(C₁-C₄)-烷氧基、(C₁-C₄)- 卤烷基、(C₁-C₄)-卤烷氧基或硝基；

R′相同或不同地为氢、(C₁-C₄)-烷基、未经取代或经一个或多个， 优选高达三个R⁵²基团取代的苯基，或两个R′基团一起形成(C₂-C₆)-烷 二基链；

R″相同或不同地为(C₁-C₄)-烷基，或两个R″基团一起形成 (C₂-C₆)-烷二基链；

R′″为氢或(C₁-C₄)-烷基；

m为0、1、2、3、4、5或6。

特别优选已知作为安全剂的式(I)和/或(II)化合物，其中符 号和标示具有如下定义：

R²⁴为氢、(C₁-C₈)-烷基或(C₃-C₇)-环烷基，其中上述含碳基团是未 经取代或经卤素单-或多取代的，或经R⁵⁰基团单-或二取代的，优选单 取代，

R⁵⁰相同或不同地为羟基、(C₁-C₄)-烷氧基、羧基、(C₁-C₄)-烷氧羰 基、(C₂-C₆)-烯氧基羰基、(C₂-C₆)-炔氧基羰基、1-(肟基)-(C₁-C₄)-烷 基、1-[(C₁-C₄)-烷基亚氨基]-(C₁-C₄)-烷基和1-[(C₁-C₄)-烷氧基亚氨 基]-(C₁-C₄)-烷基；-SiR′₃、-O-N＝CR′₂、-N＝CR′₂、-NR′₂和-O-NR′₂，其 中R′相同或不同并且为氢、(C₁-C₄)-烷基，或为成对基团(C₄-C₅)-烷二 基链，

R²⁷、R²⁸、R²⁹相同或不同地为氢、(C₁-C₈)-烷基、(C₁-C₆)-卤烷基、 (C₃-C₇)-环烷基或未经取代或经一个或多个选自下组基团取代的苯基： 卤素、氰基、硝基、氨基、单-和二-[(C₁-C₄)-烷基]氨基、(C₁-C₄)-烷 基、(C₁-C₄)-卤烷基、(C₁-C₄)-烷氧基、(C₁-C₄)-卤烷氧基、(C₁-C₄)-烷 硫基和(C₁-C₄)-烷基磺酰基；

R^X为氢或COOR²⁶，其中R²⁶为氢、(C₁-C₈)-烷基、(C₁-C₈)-卤烷基、 (C₁-C₄)-烷氧基-(C₁-C₄)-烷基、(C₁-C₆)-羟基烷基、(C₃-C₇)-环烷基或 三-(C₁-C₄)-烷基甲硅烷基，

R¹⁷、R¹⁹相同或不同地为卤素、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、(C₁或C₂)-卤烷基，优选氢、卤素或(C₁或C₂)-卤烷基。

完全特别优选已知作为安全剂的其中式(I)中的符号和标示具有 如下定义的化合物：

R¹⁷为卤素、硝基或(C₁-C₄)-卤烷基；

n′为0、1、2或3；

R¹⁸为式OR²⁴的基团，

R²⁴为氢、(C₁-C₈)-烷基或(C₃-C₇)-环烷基，其中上述含碳基团是未 经取代或经相同或不同的卤素基团单或多取代的，优选高至三取代的， 或经相同或不同的选自下组的基团高至二取代的，优选单取代的：羟 基、(C₁-C₄)-烷氧基、(C₁-C₄)-烷氧羰基、(C₂-C₆)-烯氧基羰基、(C₂-C₆)- 炔氧基羰基、1-(肟基)-(C₁-C₄)-烷基、1-[(C₁-C₄)-烷基亚氨 基]-(C₁-C₄)-烷基、1-[(C₁-C₄)-烷氧基亚氨基]-(C₁-C₄)-烷基，以及式 -SiR′₃、-O-N＝R′₂、-N＝CR′₂、-NR′₂和-O-NR′₂的基团，其中上述式中 的R′相同或不同地为氢、(C₁-C₄)-烷基，或为成对基团(C₄或C₅)-烷二 基链；

R²⁷、R²⁸、R²⁹相同或不同地为氢、(C₁-C₈)-烷基、(C₁-C₆)-卤烷基、 (C₃-C₇)-环烷基或未经取代或经一个或多个选自下组基团取代的苯基： 卤素、(C₁-C₄)-烷基、(C₁-C₄)-烷氧基、硝基、(C₁-C₄)-卤烷基和(C₁-C₄)- 卤烷氧基，和

R^X为氢或COOR²⁶，其中R²⁶为氢、(C₁-C₈)-烷基、(C₁-C₈)-卤烷基、 (C₁-C₄)-烷氧基-(C₁-C₄)-烷基、(C₁-C₆)-羟基烷基、(C₃-C₇)-环烷基或 三-(C₁-C₄)-烷基甲硅烷基，

还完全特别优选已知作为安全剂的式(II)化合物，其中符号和 标示具有如下定义：

R¹⁹为卤素或(C₁-C₄)-卤烷基；

n′为0、1、2或3，其中(R¹⁹)_n′优选为5-Cl；

R²⁰为式OR²⁴的基团；

T为CH₂或CH(COO-(C₁-C₃)-烷基)，和

R²⁴为氢、(C₁-C₈)-烷基、(C₁-C₈)-卤烷基或(C₁-C₄)-烷氧基-(C₁-C₄)- 烷基，优选氢或(C₁-C₈)-烷基。

在此特别优选已知作为安全剂的式(I)化合物，其中符号和标示 具有如下定义：

W为(W1)；

R¹⁷为卤素或(C₁-C₂)-卤烷基；

n′为0、1、2或3，其中(R¹⁷)_n′优选为2，4-Cl₂；

R¹⁸为式OR²⁴的基团；

R²⁴为氢、(C₁-C₈)-烷基、(C₁-C₄)-卤烷基、(C₁-C₄)-羟烷基、(C₃-C₇)- 环烷基、(C₁-C₄)-烷氧基-(C₁-C₄)-烷基或三-(C₁-C₂)-烷基甲硅烷基， 优选(C₁-C₄)-烷基；

R²⁷为氢、(C₁-C₈)-烷基、(C₁-C₄)-卤烷基或(C₃-C₇)-环烷基，优选 氢或(C₁-C₄)-烷基，和

R^X为COOR²⁶，其中R²⁶为氢、(C₁-C₈)-烷基、(C₁-C₄)-卤烷基、(C₁-C₄)- 羟烷基、(C₃-C₇)-环烷基、(C₁-C₄)-烷氧基-(C₁-C₄)-烷基或三-(C₁-C₂)- 烷基甲硅烷基，优选氢或(C₁-C₄)-烷基。

还特别优选已知作为安全剂的式(I)化合物，其中符号和标示具 有如下定义：

W为(W2)；

R¹⁷为卤素或(C₁-C₂)-卤烷基；

n′为0、1、2或3，其中(R¹⁷)_n′优选为2，4-Cl₂；

R¹⁸为式OR²⁴的基团；

R²⁴为氢、(C₁-C₈)-烷基、(C₁-C₄)-卤烷基、(C₁-C₄)-羟烷基、(C₃-C₇)- 环烷基、(C₁-C₄-烷氧基)-C₁-C₄-烷基或三-(C₁-C₂)-烷基甲硅烷基，优 选(C₁-C₄)-烷基，和

R²⁷为氢、(C₁-C₈)-烷基、(C₁-C₄)-卤烷基、(C₃-C₇)-环烷基或未经 取代或经取代的苯基，优选氢、(C₁-C₄)-烷基或未经取代或经一个或多 个选自下组基团取代的苯基：卤素、(C₁-C₄)-烷基、(C₁-C₄)-卤烷基、 硝基、氰基和(C₁-C₄)-烷氧基。

还特别优选已知作为安全剂的式(I)化合物，其中符号和标示具 有如下定义：

W为(W3)；

R¹⁷为卤素或(C₁-C₂)-卤烷基；

n′为0、1、2或3，其中(R¹⁷)_n′优选为2，4-Cl₂；

R¹⁸为式OR²⁴的基团；

R²⁴为氢、(C₁-C₈)-烷基、(C₁-C₄)-卤烷基、(C₁-C₄)-羟烷基、(C₃-C₇)- 环烷基、(C₁-C₄)-烷氧基-(C₁-C₄)-烷基或三-(C₁-C₂)-烷基甲硅烷基， 优选(C₁-C₄)-烷基，和

R²⁸为(C₁-C₈)-烷基或(C₁-C₄)-卤烷基，优选C₁-卤烷基。

还特别优选已知作为安全剂的式(I)化合物，其中符号和标示具 有如下定义：

W为(W4)；

R¹⁷为卤素、硝基、(C₁-C₄)-烷基、(C₁-C₂)-卤烷基，优选CF₃或 (C₁-C₄)-烷氧基；

n′为0、1、2或3；

m′为0或1；

R¹⁸为式OR²⁴的基团；

R²⁴为氢、(C₁-C₄)-烷基、羧基-(C₁-C₄)-烷基、(C₁-C₄)-烷氧羰基 -(C₁-C₄)-烷基，优选(C₁-C₄)-烷氧基-CO-CH₂-、(C₁-C₄)-烷氧基 -CO-C(CH₃)H-、HO-CO-CH₂-或HO-CO-C(CH₃)H-，和

R²⁹为氢、(C₁-C₄)-烷基、(C₁-C₄)-卤烷基、(C₃-C₇)-环烷基或未经 取代或经一个或多个选自下组基团取代的苯基：卤素、(C₁-C₄)-烷基、 (C₁-C₄)-卤烷基、硝基、氰基和(C₁-C₄)-烷氧基。

已知作为安全剂的如下化合物类是尤其适合作为提高植物对非生 物性应激因子耐受性的活性物质：

a)二氯苯基吡唑啉-3-羧酸类化合物(即其中W＝(W1)并且(R¹⁷)_n′＝2，4-Cl₂的式(I)化合物)，优选化合物例如描述于WO-A 91/07874 中的1-(2，4-二氯苯基)-5-(乙氧基羰基)-5-甲基-2-吡唑啉-3-羧酸 乙酯(I-1，吡唑解草酯)，吡咯二酸二甲酯和吡咯二酸(I-0)，以及 相关化合物；

b)二氯苯基吡唑羧酸衍生物(即其中W＝(W2)并且(R¹⁷)_n′＝2，4-Cl₂的式(I)化合物)，优选化合物例如EP-A-0333 131和EP-A-0269 806 中所描述的1-(2，4-二氯苯基)-5-甲基-吡唑-3-羧酸乙酯(I-2)、 1-(2，4-二氯苯基)-5-异丙基-吡唑-3-羧酸乙酯(I-3)、1-(2，4- 二氯苯基)-5-(1，1-二甲基乙基)吡唑-3-羧酸乙酯(I-4)、1-(2，4- 二氯苯基)-5-苯基-吡唑-3-羧酸乙酯(I-5)，以及相关化合物；

c)三唑羧酸类化合物(即其中W＝(W3)并且(R¹⁷)_n′＝2，4-Cl₂的式 (I)化合物)，优选化合物例如解草唑乙酯，即1-(2，4-二氯苯基) -5-三氯甲基-(1H)-1，2，4-三唑-3-羧酸乙酯(I-6)以及相关化合物(参 见EP-A-0174 562和EP-A-0346 620)；

d)5-苄基-或5-苯基-2-异恶唑啉-3-羧酸类或5，5-二苯基-2-异 恶唑啉-3-羧酸化合物，例如双苯恶唑酸(I-12)(其中W＝(W4))， 优选化合物例如描述于WO-A-91/08202中的5-(2，4-二氯苄基)-2-异 恶唑啉-3-羧酸乙酯(I-7)或5-苯基-2-异恶唑啉-3-羧酸乙酯(I-8) 以及相关化合物，或描述于WO-A-95/07897中的5，5-二苯基-2-异恶 唑啉羧酸乙酯(I-9，双苯恶唑酸乙酯)或5，5-二苯基-2-异恶唑啉羧酸 正丙酯(I-10)，或5-(4-氟苯基)-5-苯基-2-异恶唑啉-3-羧酸乙酯 (I-11)。

e)8-喹啉氧基乙酸类化合物，例如其中(R¹⁹)_n′＝5-Cl、R²⁰＝OR²⁴和T＝CH₂的式(II)化合物，优选化合物

(5-氯-8-喹啉氧基)乙酸-(1-甲基己基)-酯(II-1，解毒喹)，

(5-氯-8-喹啉氧基)乙酸-(1，3-二甲基丁-1-基)-酯(II-2)，

(5-氯-8-喹啉氧基)乙酸-4-烯丙基-氧基丁基酯(II-3)，

(5-氯-8-喹啉氧基)乙酸-1-烯丙氧基丙-2-基酯(II-4)，

(5-氯-8-喹啉氧基)乙酸乙酯(II-5)，

(5-氯-8-喹啉氧基)乙酸甲酯(II-6)，

(5-氯-8-喹啉氧基)乙酸烯丙酯(II-7)，

(5-氯-8-喹啉氧基)乙酸-2-(2-亚丙基-亚氨基氧基)-1-乙基酯 (II-8)，

(5-氯-8-喹啉氧基)乙酸-2-氧代-丙-1-基酯(II-9)，

(5-氯-8-喹啉氧基)乙酸(II-10)及其盐，如其描述于例如 WO-A-2002/34048中，

以及相关化合物，如描述于EP-A-0860 750、EP-A-0 094 349和 EP-A-0191 736或EP-A-0 492 366中。

f)(5-氯-8-喹啉氧)-丙二酸类化合物，即其中(R¹⁹)_n′＝5-Cl、 R²⁰＝OR²⁴、T＝-CH(COO-烷基)-的式(II)化合物，优选化合物(5-氯 -8-喹啉氧基)丙二酸二乙酯(II-11)、(5-氯-8-喹啉氧基)丙二酸二 烯丙酯、(5-氯-8-喹啉氧基)丙二酸甲基乙基酯以及相关化合物，如描 述于EP-A-0 582 198中。

g)二氯乙酰胺类活性物质，即式(III)化合物，优选：N，N-二烯 丙基-2，2-二氯乙酰胺(烯丙酰草胺(III-1)，来自US-A 4,137,070)，

4-二氯乙酰基-3，4-二氢-3-甲基-2H-1，4-苯并恶嗪(IV-2，解草 酮，来自EP 0 149 974)，

N1，N2-二烯丙基-N2-二氯乙酰基甘氨酰胺(DKA-24(III-3)，来自 HU 2143821)，

4-二氯乙酰基-1-氧杂-4-氮杂螺[4，5]癸烷(AD-67)，

2，2-二氯-N-(1，3-二氧杂环戊-2-基甲基)-N-(2-丙烯基)乙酰胺 (PPG-1292)，

3-二氯乙酰基-2，2，5-三甲基恶唑烷(R-29148，III-4)，

3-二氯乙酰基-2，2-二甲基-5-苯基恶唑烷，

3-二氯乙酰基-2，2-二甲基-5-(2-噻吩基)恶唑烷，

3-二氯乙酰基-5-(2-呋喃基)-2，2-二甲基恶唑烷(呋喃解草唑 (III-5)，MON 13900)，

1-二氯乙酰基六氢-3，3，8a-三甲基吡咯[1，2-a]嘧啶-6(2H)-酮 (dicyclonon，BAS 145138)，

h)组(b)的化合物，优选

1，8-萘二甲酸酐(b-1)，

二苯基甲氧基乙酸甲酯(b-2)，

氰基甲氧基亚氨基(苯基)乙腈(解草胺腈)(b-3)，

1-(2-氯苄基)-3-(1-甲基-1-苯乙基)脲(苄草隆)(b-4)，

S-2-乙基硫代乙基二硫代磷酸O，O-二乙酯(乙拌磷)(b-5)，

4-氯苯基甲基氨基甲酸酯(Mephenate)(b-6)，

O-苯基硫代磷酸O，O-二乙酯(Dietholate)(b-7)，

4-羧基-3，4-二氢-2H-1-苯并吡喃-4-乙酸(CL-304415， CAS-Regno：31541-57-8)(b-8)，

1，3-二氧杂环戊-2-基甲氧亚氨基(苯基)乙腈(解草腈)(b-9)，

4′-氯-2，2，2-三氟苯乙酮O-1，3-二氧杂环戊-2-基甲基肟(氟草 肟)(b-10)，

4，6-二氯-2-苯基嘧啶(解草啶)(b-11)，

2-氯-4-三氟甲基-1，3-噻唑-5-羧酸苄酯(解草胺)(b-12)，

2-二氯甲基-2-甲基-1，3-二氧杂环戊烷(MG-191)(b-13)，

N-(4-甲基苯基)-N′-(1-甲基-1-苯乙基)脲(香草隆)(b-14)，

(2，4-二氯苯氧基)乙酸(2，4-D)，

(4-氯苯氧基)乙酸，

(R，S)-2-(4-氯-邻-甲苯氧基)丙酸(2甲4氯丙酸)，

4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸(2，4-DB)，

(4-氯-邻-甲苯氧基)乙酸(MCPA)，

4-(4-氯-邻-甲苯氧基)丁酸，

4-(4-氯苯氧基)丁酸，

3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸(麦草畏)，

3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸1-(乙氧羰基)乙酯(Lactidichlor)

及其盐和酯，优选(C₁-C₈)酯。

此外，优选已知作为安全剂的式(IV)化合物或其盐是如下化合 物，其中

R³⁰为氢、(C₁-C₆)-烷基、(C₃-C₆)-环烷基、呋喃基或噻吩基，其中 最后4个所述基团是未经取代的或经一个或多个选自下组的取代基取 代的：卤素、(C₁-C₄)-烷氧基、卤代-(C₁-C₆)-烷氧基和(C₁-C₄)-烷硫基， 并且在环状基团的情形下，也可以为(C₁-C₄)-烷基和(C₁-C₄)-卤烷基，

R³¹为氢，

R³²为卤素、卤代-(C₁-C₄)-烷基、卤代-(C₁-C₄)-烷氧基、(C₁-C₄)- 烷基、(C₁-C₄)-烷氧基、(C₁-C₄)-烷基磺酰基、(C₁-C₄)-烷氧羰基或 (C₁-C₄)-烷基羰基，

优选卤素、(C₁-C₄)-卤烷基，例如三氟甲基、(C₁-C₄)-烷氧基、卤 代-(C₁-C₄)-烷氧基、(C₁-C₄)-烷氧羰基或(C₁-C₄)-烷基磺酰基，

R³³为氢，

R³⁴为卤素、(C₁-C₄)-烷基、卤代-(C₁-C₄)-烷基、卤代-(C₁-C₄)-烷 氧基、(C₃-C₆)-环烷基、苯基、(C₁-C₄)-烷氧基、氰基、(C₁-C₄)-烷硫 基、(C₁-C₄)-烷基亚磺酰基、(C₁-C₄)-烷基磺酰基、(C₁-C₄)-烷氧羰基 或(C₁-C₄)-烷基羰基，

优选卤素、(C₁-C₄)-烷基、(C₁-C₄)-卤烷基，例如三氟甲基、卤代 -(C₁-C₄)-烷氧基、(C₁-C₄)-烷氧基或(C₁-C₄)-烷硫基，

n为0、1或2，和

m为1或2。

特别优选已知作为安全剂的式(IV)化合物，其中

R³⁰＝H₃C-O-CH₂-，R³¹＝R³³＝H，R³⁴＝2-OMe(IV-1)，

R³⁰＝H₃C-O-CH₂-，R³¹＝R³³＝H，R³⁴＝2-OMe-5-Cl(IV-2)，

R³⁰＝环丙基，R³¹＝R³³＝H，R³⁴＝2-OMe(IV-3)，

R³⁰＝环丙基，R³¹＝R³³＝H，R³⁴＝2-OMe-5-Cl(IV-4)，

R³⁰＝环丙基，R³¹＝R³³＝H，R³⁴＝2-Me(IV-5)，

R³⁰＝叔丁基，R³¹＝R³³＝H，R³⁴＝2-OMe(IV-6)。

进一步优选已知作为安全剂的式(V)化合物是如下化合物，其中 X³为CH；

R³⁵为氢、(C₁-C₆)-烷基、(C₃-C₆)-环烷基、(C₂-C₆)-烯基、(C₅-C₆)- 环烯基、苯基或具有高达3个选自氮、氧和硫的杂原子的3-至6-元杂 环基，其中最后6个所述基团是任选经一个或多个相同或不同的选自 下组基团取代的：卤素、(C₁-C₆)-烷氧基、(C₁-C₆)-卤烷氧基、(C₁-C₂)- 烷基亚磺酰基、(C₁-C₂)-烷基磺酰基、(C₃-C₆)-环烷基、(C₁-C₄)-烷氧 羰基、(C₁-C₄)-烷基羰基和苯基，并且在环状基团的情形下，也可以经 (C₁-C₄)-烷基和(C₁-C₄)-卤烷基取代的；

R³⁶为氢、(C₁-C₆)-烷基、(C₂-C₆)-烯基、(C₂-C₆)-炔基，其中最后3 个所述基团是任选经一个或多个相同或不同的选自下组基团取代的： 卤素、羟基、(C₁-C₄)-烷基、(C₁-C₄)-烷氧基和(C₁-C₄)-烷硫基；

R³⁷为卤素、(C₁-C₄)-卤烷基、(C₁-C₄)-卤烷氧基、硝基、(C₁-C₄)- 烷基、(C₁-C₄)-烷氧基、(C₁-C₄)-烷基磺酰基、(C₁-C₄)-烷氧羰基或 (C₁-C₄)-烷基羰基；

R³⁸为氢；

R³⁹为卤素、硝基、(C₁-C₄)-烷基、(C₁-C₄)-卤烷基、(C₁-C₄)-卤烷 氧基、(C₃-C₆)-环烷基、苯基、(C₁-C₄)-烷氧基、氰基、(C₁-C₄)-烷硫 基、(C₁-C₄)-烷基亚磺酰基、(C₁-C₄)-烷基磺酰基、(C₁-C₄)-烷氧羰基 或(C₁-C₄)-烷基羰基；

n为0、1或2，和

m为1或2。

优选已知作为安全剂的式(VI)化合物为(S3-1)、(S3-2)、(S3-3)、 (S3-4)和(S3-5)。

还优选的式(VII)化合物为

1-[4-(N-2-甲氧基苯甲酰基氨磺酰基)苯基]-3-甲脲(VII-1)，

1-[4-(N-2-甲氧基苯甲酰基氨磺酰基)苯基]-3，3-二甲脲 (VII-2)，

1-[4-(N-4，5-二甲基苯甲酰基氨磺酰基)苯基]-3-甲脲(VII-3)和

1-[4-(N-萘甲酰基氨磺酰基)苯基]-3，3-二甲脲(VII-4)。

同样优选的化合物为式VIII-1至VIII-4的化合物

VIII-3                  VIII-4

其中再度完全特别优选化合物VIII-3(4-环丙基氨基羰基-N-(2- 甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺)用作提高植物对非生物性应激因子的耐受 性的制剂。

特别优选用作提高植物对非生物性应激因子的耐受性的制剂是选 自下组的已知作为安全剂的化合物：式I-1(吡唑解草酯)、I-9(双苯 恶唑酸乙酯)、II-1(解毒喹)、b-11(解草啶)、b-14(杀草隆)和 VIII-3(4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺)，完全特 别优选的是化合物I-1和VIII-3。

前述确定/提及的可能已经已知为安全剂的化合物还可以在基因 改良植物中使用。

原则上，基因改良植物(也称转基因植物)表现出特别有利的性 质，例如对某些农药的抗性，尤其是某些除草剂，对植物病害或植物 病害病原体的抗性，例如某些昆虫或微生物如真菌、细菌或病毒。其 它的特殊性质涉及例如收成产物的数量、质量、储存性能、组成和特 定成分。因此，目前已知转基因植物具有提高的淀粉含量或经改良的 淀粉品质，或具有不同的脂肪酸组分的收成产物而著称。

优选使用前述确定/提及的已知作为安全剂的化合物或其盐应用 于经济重要性的有用植物和观赏植物的转基因作物中，例如谷物如小 麦、大麦、黑麦、燕麦、高梁和粟、水稻和玉米，或其它作物如甜菜、 棉花、大豆、油菜、马铃薯、西红柿、豌豆和其它植物品种，特别优 选用于玉米、小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻、油菜、甜菜和大豆作 物中，特别优选用于玉米、小麦、水稻、油菜、甜菜和大豆作物中。

此外，转基因植物也可以用借助DNA微阵列所鉴定的如已经作为安 全剂的已知分子的物质来进行处理，所述转基因植物已经通过基因技 术措施提高了针对非生物性应激因子的耐受性，从而观察到内源编码 耐受性的增效作用以及体外施用耐受性提高的作用。

培育比已知植物具有改良性质的新颖植物的传统途径是例如经典 的培育方法和突变种的制造。可选择的是，借助基因工程方法可产生 具有改变性质的新颖植物(参照例如EP-A-0221044、EP-A-0131624)。 例如，下列的几项描述：

-用基因工程技术改变作物用于改良植物中合成的淀粉(例如WO 92/11376、WO 92/14827、WO 91/19806)，

-对抗草铵膦型(参见例如EP-A-0242236、EP-A-242246)、或草 甘膦型(WO 92/00377)或磺酰脲型(EP-A-0257993、US-A-5013659) 的特定除草剂的转基因作物，

-具有产生苏云金芽孢杆菌毒素(Bt毒素)能力的转基因作物， 例如棉花，使该植物对抗特定害虫(EP-A-0142924，EP-A-0193259)，

-具有改良脂肪酸组成的转基因作物(WO 91/13972)。

大量可制备具有改良性质的新颖转基因植物的分子生物技术基本 上是已知的；参照例如，Sambrook等，1989，Molecular Cloning(分 子克隆)，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；或Winnacker“Gene und Klone”[基因和克隆]，VCH Weinheim，第二版1996或Christou， “Trends in Plant Science”1(1996)423-431。

为了进行此类基因工程改造，可以将核酸分子导入质粒中，其可 通过DNA序列的重组技术产生突变或使序列发生改变。使用上述的标 准方法，可以例如调换碱基、去除部份序列或加入天然序列或合成序 列。为了使DNA片段彼此连结，可以加入接合体或连接体。

具有降低活性的基因产物的植物细胞可以例如通过下列方式制 备：表达至少一种相应的反义RNA、有义RNA达到协同抑制效果，或 表现至少一种具有适宜的构筑的核糖酶，其特异性切割上述提到的基 因产物的转录本。

对此，既可以使用一种DNA分子，其含有基因产物的全部的编码 序列(包括可能存在的两侧翼序列)，也可以使用另一种DNA分子， 其只含有部分的编码序列，该序列部份必须足够长以引起在细胞中的 反义效果。也可以使用DNA序列，其具有与基因产物的编码序列高度 的同源性，但不是完全地相同。

当在植物中表达核酸分子时，经合成的蛋白可定位于植物细胞的 任意区室内。然而，要达到定位于某一特定区室，可以例如使编码区 与确保特定区室定位的DNA序列连结。此类序列是本领域技术人员所 熟悉的(参见例如，Braun等，EMBO J.11(1992)，3219-3227；Wolter 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，846-850；Sonnewald 等，Plant J.1(1991)，95-106)。

通过已知的技术可以使转基因植物细胞再生成整株植物。该转基 因植物基本上可以是任意所需植物种类的植物，既包括单子叶植物又 包括双子叶植物。

由此，通过同源的(＝天然的)基因或基因序列的过度表达、遏 抑或抑制，或通过异源的(＝外来的)基因或基因序列的表达可以获 得具有经改变的性质的转基因植物。

优选地，借助DNA微阵列鉴定或已知作为安全剂的分子可以用于 转基因作物中，所述作物对选自磺酰脲类，草铵膦或草甘膦-异丙铵盐 和类似的活性物质的除草剂有抗性，和/或作为基因工程改造的基础， 其具有对非生物性应激因子的内源耐受性。

当将本发明活性物质施用于转基因作物时，除可以观察到在其它 作物中的对抗有害植物的作用外，还常常观察到施用于所述转基因作 物中的特定作用；例如改进或特定地拓宽可以防治的杂草谱，改进可 以用于施用的施用量，优选与转基因作物对其有抗性的除草剂的良好 联用性，以及影响转基因作物的生长和产量。

因此，本发明还涉及将用DNA微阵列所鉴定的化合物或已知作为 安全剂的化合物用于提高转基因作物对非生物性应激因子的耐受性的 用途，优选以提高产量为目的。

本发明涉及一种发现能增强植物中非生物性应激因子耐受性的化 合物的方法，其中单个或多个植物内源性基因的转录或表达的增加被 评价为诱导的标示，例如，编码下组蛋白的基因：细胞色素氧化酶如 细胞色素氧化酶P450、糖基转移酶、尿酸氧化酶如尿酸氧化酶II (E.C.17.3.3)，肽酶、不同的膜蛋白、酰胺水解酶以及各种一般性应 激蛋白。

本发明特别涉及一种发现诱导编码植物内源性应激耐受酶的基因 转录的化合物的方法，其包括：

a)使待测植物暴露于一种或多种非生物性应激因子，

b)对照植物，除了另外使之与待测化合物接触，在与a)中的待测 植物相同的条件下，所述接触是以经拌种的种子材料形式或通过在特 定的发育阶段进行喷施或通过根摄取，

c)从检测植物和对照植物提取RNA，

d)直接放射性或非放射性标记RNA，或者RNA在酶促地转录成相 应cDNA的同时进行cDNA的放射性或非放射性标记，或者将所得的、 未标记的cDNA酶促地转录成相应的放射性或非放射性标记的cRNA，

e)使包含植物DNA序列的DNA微阵列与步骤d)所得物质杂交，

f)通过比较在a)和b)中进行检测的植物，而获得关于不同应激蛋 白的表达的基因表达模式，

g)定量地确定f)测量的表达差异，

h)通过集簇分析对根据g)归纳的表达模式进行最终系统分类。

在上述步骤d)中，必须将所得的cDNA酶促转录成cRNA看成是优 选的处理步骤，因为由此才能实现杂交样品的再一次扩增。同样优选 借助非放射性核苷酸进行标记，特别优选借助生物素化UTP和/或CTP 进行标记，其中紧随通过作为荧光团的链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白与 生物素化cRNA的结合的成功杂交反应之后进行检测。特异性藻红蛋白 荧光团的检测，其作为量化所测的表达差异性的基础，是借助激光- 扫描仪紧随杂交反应之后进行的。

优选地，本发明涉及遵循前述步骤a)-h)的方法，其中，在意图 提高热应激下的耐受性的情形下，对比经热应激和无热应激的植物的 细胞色素氧化酶如细胞色素氧化酶P450、糖基转移酶、尿酸氧化酶如 尿酸氧化酶II(E.C.17.3.3)、肽酶、不同的膜蛋白、酰胺水解酶的 基因表达，优选“N-氨甲酰基-L-氨基酸酰胺水解酶” (Zm.11840.1.A1_at)，“丝氨酸羧肽酶”(Zm.18994.2.A1_a_at)、尿 酸氧化酶II(E.C.1.7.3.3)和糖基转移酶(Zm.12587.1.S1_s_at)的基 因表达，非常特别优选“N-氨甲酰基-L-氨基酸酰胺水解酶” (Zm.11840.1.A1_at)和“丝氨酸羧肽酶”(Zm.18994.2.A1_a_at)(根 据Affymetrix公司(Affymetrix Inc.，3380 Central Expressway， Santa Clara，CA，USA)的玉米基因组阵列标识)的基因表达，

并且其中在处理下，对比经热应激的对照植物，基因表达例如增 加1.5倍或更多，优选1.5-30倍，优选1.5-20倍，特别优选1.5 -10倍，非常特别优选1.5-5倍，其中彼此独立地单个基因的改变 的表达模式的增加可以在上面提到的不同范围内。

优选地，本发明还涉及遵循前述步骤a)-h)的方法，其中，在意 图提高干旱应激下的耐受性的情形下，对比经干旱应激和无干旱应激 的植物的胚胎发育晚期丰富蛋白如脱水蛋白、通用应激蛋白 (Zm.818.1.A1_at)、非共生性血红蛋白(Zm.485.1.A1_at)、编号为 “Zm.818.2.A1_a_at”的蛋白(Affymetrix公司(Affymetrix Inc.， 3380 Central Expressway，Santa Clara，CA，USA)的玉米基因组 阵列)和编号为“Zm.18682.1.A1_s_at”的蛋白(Affymetrix公司 (Affymetrix Inc.，3380 Central Expressway，Santa Clara，CA， USA)的玉米基因组阵列)的基因表达，优选通用热应激蛋白 (Zm.818.1.A1_at)，非共生性血红蛋白(Zm.485.1.A1_at)，编号为 “Zm.818.2.A1_a_at”的蛋白(根据Affymetrix公司(Affymetrix Inc.，3380 Central Expressway，Santa Clara，CA，USA)的玉米 基因组阵列标识)和编号为“Zm.18682.1.A1_s_at”的蛋白 (Affymetrix公司(Affymetrix Inc.，3380 Central Expressway， Santa Clara，CA，USA)的玉米基因组阵列)的基因表达，

并且其中在处理下，对比经干旱应激性的对照植物，基因表达例 如增加1.5或更多，优选1.5-30，优选1.5-20，特别优选1.5-10， 非常特别优选1.5-8，其中彼此独立地单个基因的改变的表达模式的 增加可以在上面提到的不同范围内。

本发明进一步涉及将某些DNA微阵列用于发现改良基因表达模式 的用途，所述微阵列是基于来自植物的遗传信息，优选来自有用植物 的遗传信息，特别优选来自如下有用植物，例如玉米，谷物如小麦、 大麦、黑麦、燕麦、水稻和大豆，特别优选大麦、玉米、小麦、水稻 和大豆，完全特别优选玉米、小麦和大豆。在此，在其它应激条件都 相同的情形下，研究在经待测化合物处理的植物中的不同应激蛋白的 基因的基因模式对比未经处理的对照植物的相对变化。

本发明进一步涉及将所述的指示基因的启动子连同特定报道基因 (例如GUS、GFP、荧光素酶等)用于发现对作物的非生物性应激耐受 性具有积极作用的物质的用途。在此，培育转基因试验植物，其包含 所提及的启动子/报道基因结构。依据所描述的机制提高植物非生物性 应激耐受性的活性物质诱导报道基因的表达，并且可以借助比色测定、 荧光测定或其它适宜的测定来加以鉴定。

本发明进一步涉及将所述指示基因用于提高转基因作物的非生物 性应激耐受性的用途。在此，所述基因与适宜的启动子相融合，该启 动子具有所需的强度和特异性，并且将该结构转入单子叶或双子叶作 物中。最终的转基因植物是以提高对非生物性应激，例如寒冷、热、 干旱等的耐受性为特征的。

本发明还进一步涉及借助DNA微阵列在基因表达模式的研究下所 鉴定的化合物和/或已知作为安全剂的化合物作为活性物质用于提高 有用植物的应激耐受性的用途，所述已知作为安全剂的化合物被鉴定 为在非生物性应激条件的情形下，例如针对作用于所述植物的非生物 性应激因子，例如温度(冷、霜冻或热)，水(干燥或干旱)，或化 学性负荷(缺乏或过量的矿物盐类、重金属类、有毒气体物质)，具 有积极作用，即鉴于其作用于单个或多个植物内源性抵御机制的基因 的诱导性作用的表达增强性作用，例如在热应激情况下，作用于细胞 色素氧化酶如细胞色素氧化酶P450、糖基转移酶、尿素酶如尿素酶II (E.C.17.3.3)、肽酶、不同膜蛋白、酰胺水解酶和/或各种应激蛋白的 表达增强性作用，和/或例如在干旱应激情况下具有积极作用，即鉴于 其作用于单个或多个普遍应激蛋白、非共生性血红蛋白 (Zm.485.1.A1_at)、编号为“Zm.818.2.A1_a_at”的蛋白(Affymetrix 公司(Affymetrix Inc.，3380 Central Expressway，Santa Clara， CA，USA)的玉米基因组阵列)和编号为“Zm.18682.1.A1_s_at”的蛋 白(根据Affymetrix公司(Affymetrix Inc.，3380 Central Expressway，Santa Clara，CA，USA)的玉米基因组阵列标识)的基 因的表达增强性作用。

本发明还涉及将借助DNA微阵列所鉴定的物质和已知作为安全剂 的分子用于提高多种作物对非生物性应激因子的耐受性的用途，所述 作物例如玉米，谷物例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻和大豆，优选 玉米、小麦、大麦、黑麦、水稻和大豆，特别优选玉米、小麦、水稻 和大豆，完全特别优选玉米、小麦和大豆。

因此，本发明还涉及借助DNA微阵列在基因表达模式的研究下所 鉴定的化合物和/或已知作为安全剂的化合物用于提高产量、延长植物 生长周期、让更早的播种期成为可能、提高品质的用途，或用于利用 其它次要自交系的植物育种中的用途，所述已知作为安全剂的化合物 是在植物中，直接或间接，例如通过信号转导链促成提高对非生物性 应激因子的耐受性，例如温度(例如冷、霜冻或热)，水(例如干燥、 干旱或缺氧)，或化学性负荷(例如缺乏或过量的矿物盐类、重金属 类、有毒气体物质)。

因此，本发明还涉及提高有用植物的作物产量、延长植物生长周 期、让更早的播种期成为可能、提高品质或用于利用其它次要自交系 的植物育种的方法，该方法包括用一种或多种借助DNA微阵列所鉴定 的化合物和/或已知作为安全剂的化合物通过拌种、叶片喷雾或土壤施 用来处理有用植物。

在此，优选已知作为安全剂用于作物保护中的化合物，例如选自 下组的已知作为安全剂的化合物：式I-1(吡唑解草酯)、I-9(双苯 噁唑酸乙酯)、II-1(解毒喹)、b-11(解草啶)、b-14(杀草隆)、VIII-3 (4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺)，完全特别优选 化合物I-1和VIII-3(4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯 磺酰胺)。

通过分别或联合施用前述化合物，可以有效地保护有用植物对抗 非生物性应激因子的作用，这以例如自身更高的产量来显示。

因此，本发明还涉及通过分别或联合施用借助DNA微阵列在基因 表达模式的研究下所鉴定的化合物和/或已知作为安全剂的化合物来 提高有用作物中有用植物对非生物性应激因子的耐受性的方法。

如下实施例将详细描述本发明。

具体实施方式

实施例1

借助基因表达模式(GEP)，证明安全剂对已经暴露于特定干旱应 激条件下的植物的活性：

非生物性应激因子＝干旱应激

用化合物4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺 (＝VIII-3)将Lorenzo类的玉米种子进行拌种。对此，用20mg溶解于 2ml二氯甲烷中的活性物质在轻轻摇动下接种10g种子，直至溶剂蒸 发(大约30分钟)。对照组的种子仅仅用溶剂处理。随后，将经处理 的种子置于有土的罐(直径：10cm，每罐各10粒种子)中，并且在限 定光照、湿度和温度条件[白光，长日照(16小时光照，8小时黑暗)， 70％大气湿度，24℃]下，将玉米幼苗在环境箱中出苗10天。在各情 形下，将各2×10罐用于对照组并用于干旱应激试验。在培育期间， 将植物每两天在一个盆中通过底部的积水灌溉20分钟。待种子出苗 10天后，将玉米植物暴露于干燥应激下。对此，将对照组1的植物(未 经活性物质拌种)和试验组的植物(经活性物质拌种)如上述每7天 灌溉1次。在对照组2的植物(未经活性物质拌种)和试验组2的植 物(经活性物质拌种)的情形下，维持正常的灌溉方式。在3周后干 旱应激条件后，如下来评价该实验。切下土壤以上的植物部分，并且 在50℃下干燥过夜。在第二天，以[g](干物质)每罐来确定叶片的 生物量。

将10罐植物组中的测量数据进行平均。表1中所示的数值是相对 于对照组2(未经活性物质拌种，正常灌溉方式)所获得的数据的相 对值[％]。

  植物组   处理：   相对干物质[％]：   对照组1   -S/+T   50   对照组2   -S/-T   100   试验组1   +S/+T   80   试验组2   +S/-T   100

表1：未经和经活性物质拌种的玉米植物的干旱应激试验

S＝化合物VIII-3(＝4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯 甲酰基)苯磺酰胺)，

T＝干旱应激

无应激条件下，来源于未经拌种种子和经拌种的种子的植物的平 均干物质是相同的(对照组2，试验组2)。

相比对照组的植物而言，来源于用化合物VIII-3(4-环丙基氨基 羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺)拌种的组的植物平均显示了更 粗壮的形体特征，然而在干物质上无影响。然而在干旱应激下，经活 性物质拌种的植物的平均叶片生物量(干物质)显著高于未经拌种的 对照植物(对照组1，试验组1)。

实施例2

非生物性应激因子＝热应激

如实施例1中，将Lorenzo类玉米种子用化合物4-环丙基氨基羰 基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺(＝VIII-3)进行拌种，或仅用溶剂 而无活性物质进行处理。将幼苗于环境箱中在同样如实施例1所述经 定义的条件下培育10天。将2×10罐玉米植物用于热应激试验。对 照组由未经拌种的植物(溶剂)组成，试验组由经活性物质拌种的植 物组成。为了施加热应激条件，在45℃，白光，长日照(16小时光照， 8小时黑暗)和70％大气湿度下，将这两个植物组置于环境箱中2天。 为了避免高温所导致的脱水，每天将植物在一个盆中通过底部的积水 灌溉一次。待热应激后，观察到-尤其是在对照组中-大量植物的芽 已经萎蔫，并且叶片平趴在地表。

考虑到如下标准，定量地评价试验。

待热处理后，计数已经萎蔫的植物，并且评价每罐的结果：

＜20％的出苗植物萎蔫：少许损害    ○

20-50％的出苗植物萎蔫：中度损害   

＞50％的出苗植物萎蔫：严重损害    ●

随后，将所有的植物在标准条件下生长2周。然后，测定各植物 的长度增量，并且确定每罐植物的存活率：

＞50％存活率：少许损害            ○

20-50％存活率：中度损害           

＜20％存活率：严重损害            ●

试验评价结果示于表2中。

未经拌种的对照植物受到热应激的严重损害。引人注目的特别是 大多数植物的芽萎蔫和较低的存活率。经活性物质拌种的试验植物特 别地表现为实质性地更好的“挺立”。同时最终的统计表明虽然在该 植物中也明显受到严量热应激的损害，但其存活率显著高于对照组。

表2：用或未用活性物质拌种的玉米植物的干燥应激试验

S＝化合物VIII-3(＝4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基) 苯磺酰胺)，

H＝热应激

实施例3

非生物性应激因子＝冷应激(温室)。

以10粒种子/罐将Lorenzo类玉米种子播种在10厘米罐的土壤 中。所有的试验组各由4罐组成。将试验组1和2的播种种子分别用 50或100[g a.i./ha]的化合物4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲 酰基)苯磺酰胺(＝VIII-3)进行苗前喷雾处理。对照组的种子保持未 经处理的状态。将植物在受控制条件下培育于环境箱中[白光(长日照： 16小时光照，8小时黑暗)，22℃白天温度，14℃夜间温度，60％大 气湿度。

待发芽后，当植株达到约1cm长度时，将来自每组2罐植株置于 另一个环境箱中在-2℃的冷应激条件下培育6小时。随后，将该植物 送回到第一个环境箱中。

再于标准条件下24小时后，评价试验。

观察到冷应激导致在未经处理的对照组的幼苗的叶尖上出现缺绿 症(Chlorosen)。在经活性物质处理的植物上，该症状不存在或仅仅 非常弱。

所有仅保持在标准条件下而无冷应激的试验组植物和对照组植物 不显示任何的损害症状。

为了定量评价试验，计数叶尖具有缺绿症的植株。每试验组且经 冷应激处理的植株总数为20，分布于2个罐中。

试验评价结果示于表3。

  植物组：   经活性物质处理(苗前)   [g a.i./ha]：   损害的植株数   (缺绿症)：   对照组   0   9   试验组1   50   1   试验组2   100   0

表3：未经和经活性物质化合物VIII-3(＝4-环丙基氨基羰基 -N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺)苗前处理的玉米植物的冷应激试验 (温室)。所有的植株暴露于冷应激处理中。每组植株总数为20株。

结果证实用活性物质VIII-3(＝4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基 苯甲酰基)苯磺酰胺)拌种可以显著降低由冷应激所引起的损害症状， 或在更高的用量下，完全防止该症状的发生。

实施例4

非生物性应激因子＝冷应激(大田)

将玉米种子(臼齿形玉米)用0.003mg和0.03mg的化合物4-环 丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基(＝VIII-3)/g种子进行处理， 并将该种子播种于试验区中，各试验区大小为34m²。一个对照植物含 有未经处理的种子。待种子出苗约8天后，幼苗为1叶阶段，并且将 其暴露于如下温度条件下5天：

               最大：            最小：

第1天：        16.1℃            7.2℃

第2天：        17.8℃            2.7℃

第3天：        16.7℃            0.6℃

第4天：        16.7℃            1.1℃

第5天：        22.8℃            12.2℃

在该冷周期后，统计试验区。对此，分别评价所有的植株，将具 有基于总叶面积至少20％冷症状(烧伤和/或缺绿症)的植株看作是 受损害的。

结果示于表4中。在未经活性物质拌种的对照区中，所有植物(100 ％)显示出上述冷症状。在经活性物质拌种的试验区中，显著地减少 了冷损害。

在该试验中，仅仅观察到约12％的植株有受损害症状。

在下表所示的活性物拌种量的量级范围内，获得了最佳的霜冻保 护作用。

  植物组：   冷损害   [％]*：   未经处理   100   用0.003mg的(VIII-3＝4-环丙基氨基羰基-N-(2-   甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺)/种子进行拌种   12   用0.03mg VIII-3(＝4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧   基苯甲酰基)苯磺酰胺)/种子进行拌种   12

表4：未经和经活性物质化合物VIII-3(＝4-环丙基氨基羰基 -N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺)拌种的玉米植物的冷应激试验(大 田)

*：基于试验区中的总植株数，具有冷损害的植株比例＞20％

实施例5

在非生物性应激条件下由试验物质诱发的基因特征，其通过基因 表达模式(GEP)来测定：

将Lorenzo类玉米种子如实施例1所述用化合物VIII-3(＝4-环 丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺)或用溶剂进行拌种。 在环境箱中培育植株10天(条件：参见实施例1)。

随后，将植株置于如下应激条件中：

(1)热应激：于45℃下6小时

(2)干旱应激：7天未灌溉，24℃

将各试验组的对照植物置于如实施例1所述的标准条件下(温度， 灌溉)。

在应激处理后，收获经应激的植物和未经应激的对照植物的叶片， 液态氮中冲击冷冻(shockgefroren)，并且储存于-80℃下直至处理。 所有的试验各2罐重复进行。

用于DNA芯片杂交的标记性RNA探针按照Affymetrix公司 (Affymetrix Inc.，3380 Central Expressway，Santa Clara，CA，USA) 的实验规程(Expression Analysis，Technical Manual)来进行制备。 首先，总RNA分离自各种情形下的500mg采集叶。在各种情形下，10μg 的总RNA用于cDNA第一和第二链合成。cDNA用T7聚合酶扩增，并同 时用生物素-UTP进行标记。在各种情形下，将20μg的该生物素化cDNA 应用于Affymetrix公司的玉米基因组阵列的杂交。该DNA微阵列包括 总共代表13339个基因的DNA序列。然后，DNA微阵列在Affymetrix Fluidics Station中洗涤，用链霉抗生物素蛋白/藻红蛋白(Molecular Probes，P/N S-866)染色，并用配属的Agilent激光扫描仪(Agilent Gene Array Scanner)扫描。所得荧光数据利用Affymetrix′s Microarray Suite 5软件进行分析。在进行质量确认后，将所有的DNA 芯片分析储存在数据库内。为了确定相对表达值(诱导因素，抑制因 素)，在Affymetrix软件预测的得分函数的基础上，将来自各应激试 验的基因绝对表达值与各对照试验(即无非生物性应激而仅用溶剂拌 种)的值进行比较。将获得的每个基因的4个表达值通过计算平均值来 进行平均。这些平均值示于结果表格中作为诱导因素。各种试验和簇 分析表达模式的相似性比较利用来自Genedata(Genedata， Maulbeerstr.46，CH-4016 Basel，Switzerland)的“Genedata expressionist”软件来进行。

表达模式分析尤其可以搜索仅由与非生物性应激联合的检测物 质，而不单独由物质或单独由应激诱导的基因。所述基因可以作为超 出已知安全剂效应之外的物质的额外抗应激效应的指示剂。该分析所 得结果示于下表中。所描述的指示基因的诱导模式可以靶向性发现增 加作物内非生物性应激耐受性的活性物质。

a)在热应激条件下，即待出苗7天后，将试验玉米植株(用2mg 活性物质的4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺/g种 子进行拌种)暴露于45℃下6小时。

概述显示如下模式的诱导基因组，其如表5所示：

表5

  样本编号   条件A   条件B   条件C   Zm.11840.1.A1_at   1.74   1.75   4.10   Zm.4274.1.S1_at   1.32   1.22   1.93   Zm.3040.1.S1_at   1.52   1.33   2.48   Zml 2587.1.S1.s_at   1.30   1.45   2.33   Zml 8994.2.A1_a_at   1.16   1.46   2.66   Zm.13498.1.S1_at   2.56   1.73   4.45

各样本编号相当于：

Zm.11840.1.A1_at：假定的N-氨基甲酰基-L-氨基酸酰胺水解 酶

Zm.4274.1.S1_at：细胞色素P450

Zm.3040.1.S1_at：尿酸氧化酶II(E.C.1.7.3.3)；结瘤特异 性尿酸氧化酶(Nodule specific uricase)

Zml 2587.1.S1.s_at：糖基转移酶

Zml 8994.2.A1_a_at：假定的丝氨酸转移酶(Putative serine transferase)

Zm.13498.1.S1_at：膜蛋白

条件A：热应激(6小时，45℃)

条件B：经4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺 (VIII-3)拌种的种子/无热应激

条件C：经4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺 (VIII-3)拌种的种子+热应激(6小时，45℃)。

忽略所分析的基因活性的微小基本诱导，在所有情形下观察到基 因表达的显著增加，并且在本文所述的基因中，其增加范围为1.5至 2.35(在条件C下表达/在条件A下表达)。若仅测试试验化合物VIII-3 本身，即无热应激，所测定的表达水平的范围在由热应激诱导的范围 之内，或低于或稍高于由热应激所诱导的范围。

源自表5并且其直接由最终的表达值所示的诱导模式显示由化合 物4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺(VIII-3)作 用于假定的N-氨基甲酰基-L-氨基酸酰胺水解酶[Zm.11840.1.A1_at] 和假定的丝氨酸转移酶[Zml 8994.2.A1-at]的最明确的特性诱导。

b)在热应激条件下，即待出苗7天后，将试验玉米植株(用2mg 活性物质的4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺/g种 子进行处理)暴露于24℃下7小时。

概述显示如下模式的诱导基因组，其如表6所示：

表6

  样本编号   条件A   条件B   条件C   Zm.818.1.A1_at   1.06   1.12   8.47   Zm.3633.4.A1_at   1.12   0.74   3.03   Zm.18273.1.S1_at   1.66   0.95   2.91   Zm.13229.1.S1_at   1.55   1.02   3.39   Zm.12035.1.A1_at   1.86   0.90   3.66   Zm.485.1.A1_at   0.89   1.00   5.49   Zm.818.2.A1_at   0.93   1.10   5.40   Zm.10097.1.A1_at   1.23   1.27   3.29   Zm.18682.1.A1_at   1.25   1.12   4.19

各样本编号相当于：

Zm.818.1.A1_at      通用应激蛋白

Zm.3633.4.A1_at     诱导创伤蛋白(片段)

Zm.18273.1.S1_at    调节蛋白类

Zm.13229.1.S1_at    NBS-LRR类抗病蛋白O2(片段)

Zm.12035.1.A1_at    类似于AT3G10120

Zm.485.1.A1_at      非共生性血红蛋白(HBT)(ZEAMP GLB1)

Zm.818.2.A1_at      表达蛋白

Zm.10097.1.A1_at    表达蛋白

Zm.18682.1.A1_at    未知蛋白

条件A：干旱应激(7天，24℃)

条件B：经4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺 (VIII-3)拌种的种子/无干旱应激

条件C：经4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺 (VIII-3)拌种的种子+干旱应激(7天，24℃)。

忽略所分析的基因活性的微小基本诱导，在所有情形下观察到基 因表达的显著增加，并且在本文所述的基因中，其增加范围为1.75 至8.0(在条件C下表达/在条件A下表达)。若以其自身来测试试验 化合物VIII-3，即无热应激，所测定的表达水平的范围在由干燥应激 诱导的范围之内，并且在某些情形下甚至低于未应激植物的表达(平 均值＜1.0)。

源自表6并且其直接由最终的表达值所示的诱导模式显示化合物 4-环丙基氨基羰基-N-(2-甲氧基苯甲酰基)苯磺酰胺作用于通用应激 蛋白[Zm.818.1.A1_at]和非共生性血红蛋白(HBT)(ZEAMP GLB1) [Zm.485.1.A1_at]的最明确的特性诱导。