法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-07-22
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/11 授权公告日:20120926 终止日期:20140601 申请日:20060601
专利权的终止
2012-09-26
授权
授权
2009-01-07
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-11-12
公开
公开
相关申请的交互参考
本申请要求于2005年9月12日递交的PCT申请PCT/US2005/032768 的权利，该PCT申请根据美国法典第35卷第119条(35U.S.C.§119)要 求2004年9月10日递交的美国临时申请号60/608,574的优先权，这两者 都以其整体并入本文作为参考。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明在研究阶段部分地是在美国国立健康研究院(National Institutes of Health)的基金号为5R43AI056611的基金资助下完成的。美 国政府享有本发明的一定权利。
发明领域
本发明涉及用小干扰RNA(shRNA和siRNA)抑制病毒基因表达， 例如丙型肝炎IRES介导的基因表达。
发明背景
丙型肝炎病毒(HCV)感染的治疗和预防仍然是控制这个世界范围内 健康问题的主要挑战；现有的治疗仅部分有效并且目前还没有疫苗。丙型 肝炎(HCV)病毒在世界范围内感染了超过1亿7千万人，并且是造成肝 移植的主要原因。包括三氮唑核苷和聚乙二醇化干扰素α的现有治疗仅在 大约50％的患者中有效，并且伴有大量副作用。缺乏优良的小动物模型、 不能在组织培养细胞中稳定培养病毒和高病毒突变率制约着更有效的 HCV治疗的开发[1-3]。HCV复制子系统的可获得性使得对HCV复制、宿 主-细胞相互作用和抗病毒剂评估的研究成为可能，并且更近来开发了转基 因的嵌合人源化小鼠肝模型，其使得能进行完全HCV感染[4-7]。另外，通 过利用HCV IRES依赖性报道基因系统的体内成像，已经在小鼠中促进了 在多个时间点上对小鼠肝中抗HCV试剂的运送和抑制作用的有效评估[8]。
RNA干扰是导致基因表达下调的进化上保守的途径。合成的大约19 -29个碱基对的短干扰RNA(siRNA)能有效地抑制哺乳动物细胞和动物 中的基因表达而不激发免疫反应，这个发现引起将这些抑制剂开发成治疗 剂的热潮[9]。siRNA的化学稳定化导致血清半衰期增加[10]，说明如果能克 服运送问题的话，静脉内施用可能会获得积极的治疗效果。此外，小发夹 RNA(shRNA)也显示对于哺乳动物细胞内的靶基因的强抑制作用，并且 能易于由噬菌体(例如T7、T3或SP6)或哺乳动物(pol III例如U6或 H1或polII)启动子表达，这使得它们成为用于病毒运送的极好的候选者 [11]。
因为现有治疗不完全有效(在[4，12]中综述)，所以已经尝试发现抗 HCV的有效的基于核酸的抑制剂。这些努力包括传统的反义寡核苷酸、磷 酰二胺吗啉寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomer)[8]、核酶及较 近的siRNA。已经表明siRNA能有效地靶向人组织培养细胞[13-19]和动物系 统[20]中的HCV。
发明概述
本发明提供用于抑制病毒(例如丙型肝炎病毒(HCV))中IRES介 导的基因表达的方法、组合物和试剂盒。
就在图4A和10以及表1中所列的抑制性RNA序列(例如：SEQ ID NO：19-26)而言，如本领域技术人员将明了的，暗含着互补的序列以及 可能附加在每条链的一个或两个末端(如3′末端)的与靶无关的序列。可 以将如图4A、图10和表1中所示的抑制性(反义识别)序列整合入shRNA 或siRNA中。就shRNA而言，所示的序列另外通过环与其互补序列相连， 所述环包括通常与靶无关的核苷酸残基。这样的环的实例见于图1B和图 1C以及图16A-B中所示的shRNA序列。就siRNA和shRNA两者而言， 与靶序列互补的链通常是完全互补的，但在某些具体实施方案中，与靶互 补的链可以包含错配(参见，例如，SEQ ID NO：13、14和15)。可以 通过如下方式改变序列来靶向目的病毒的一种或多种遗传变体或表型，所 述方式是改变靶向序列使之与所述遗传变体或表型的序列相互补。与靶序 列同源的链可通过具有从大约1到大约5个核苷酸的错配、插入或缺失在 大约0到大约5个位点上不同，这与例如天然存在的小RNA是一样的。 在某些具体实施方案中，序列可靶向多种病毒株，例如HCV的病毒株， 但序列在靶向序列的至少一个核苷酸(例如：一个、两个或三个核苷酸) 上不同于病毒株的靶序列。
一方面，本发明提供了包含至少一种小干扰RNA的组合物，所述的小 干扰RNA与病毒的多核苷酸序列至少部分互补并能与之相互作用，以致 于由小干扰RNA与病毒靶序列的相互作用引起病毒基因表达的抑制。在 一个具体实施方案中，组合物包含至少一种shRNA，其中所述shRNA例 如包含以下序列、由以下序列组成或基本上由以下序列组成，所述序列选 自由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO： 18组成的组；或所述shRNA包含以下序列或基本上由以下序列组成，所 述序列选自由SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33组成 的组。在一个具体实施方案中，shRNA包含如SEQ ID NO：12所述的序 列，由如SEQ ID NO：12所述的序列组成或基本上由如SEQ ID NO：12 所述的序列组成。在另一个具体实施方案中，组合物包含至少一种siRNA。 在一个具体实施方案中，组合物包含至少一种siRNA或shRNA，其中所 述siRNA或shRNA例如包含以下序列或基本上由以下序列组成，所述序 列选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO： 22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO： 25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33组成的组。在 某些具体实施方案中，小干扰RNA，例如shRNA或siRNA与大约19到 大约30个核苷酸或大约19到大约25个核苷酸，例如大约19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的病毒序列相互作用。 在某些具体实施方案中，小干扰RNA与丙型肝炎病毒序列结合。在一个 具体实施方案中，小干扰RNA与丙型肝炎病毒的内部核糖体进入位点 (IRJES)序列内的序列结合，例如与如SEQ ID NO：26(SEQ ID NO： 11的残基344-374)所述的序列结合。在一个具体实施方案中，丙型肝炎 病毒是HCV基因型1a。
在某些具体实施方案中，本发明的组合物包括药学上可接受的赋形剂， 例如水或盐水，并任选地以治疗上的有效量提供，例如用于治疗人或非人 灵长类动物如黑猩猩或新大陆猴中的HCV感染。在一个具体实施方案中， 组合物是包含至少一种本文所述的shRNA或siRNA和药学上可接受的赋 形剂的药物组合物、或是由以上两者组成或基本上由以上两者组成的药物 组合物。
另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含如上所述的任何组合物，并且 任择地还包含有关在如本文所述的抑制病毒的基因表达或治疗个体的病毒 感染的方法中使用的说明书。在一个具体实施方案中，试剂盒在用于治疗 个体如人的HCV感染的方法中使用，并且包含shRNA，所述shRNA包 含以下序列、由以下序列组成或基本上由以下序列组成，所述序列选自由 SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18 组成的组；或所述shRNA包含以下序列或基本上由以下序列组成，所述 序列选自由SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33组成的 组；或所述试剂盒包含siRNA，所述siRNA包含以下序列或基本上由以下 序列组成，所述序列选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO： 21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO： 24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO： 33组成的组，并且所述试剂盒任选地还包含有关在抑制丙型肝炎病毒(如 HCV基因型1a)的基因表达的方法中使用的说明书，或有关在个体如人 或非人灵长类动物如黑猩猩中治疗丙型肝炎(如HCV基因型1a)病毒感 染的方法中使用的说明书。
另一个方面，本发明提供了用于治疗个体如哺乳动物，例如人或非人 灵长类动物中病毒感染的方法。该方法包括给予个体治疗上有效量的小干 扰RNA，如shRNA或siRNA(所述小干扰RNA与病毒的多核苷酸序列 至少部分地互补并能够与之结合)，以及药学上可接受的赋形剂，以便小 干扰RNA与病毒多核苷酸序列的结合抑制病毒中基因的表达，如减少个 体中病毒表达的量或减少在未接受小干扰RNA的个体中预期的病毒表达 量。在一个具体实施方案中，病毒感染包含丙型肝炎病毒，如HCV基因 型1a。在某些具体实施方案中，病毒选自由丙型肝炎病毒基因型1a、1b、 2a和2b组成的组。在某些具体实施方案中，小干扰RNA包含以下序列、 由以下序列组成或基本上由以下序列组成，所述序列是本文所述的任何 shRNA或siRNA序列以及位于本文所述的shRNA或siRNA序列之一的 五个核苷酸内的序列。在某些具体实施方案中，小干扰RNA互补于大约 19到大约30个核苷酸、或大约19到大约25个核苷酸，例如大约19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的病毒序列。在一 个具体实施方案中，病毒是丙型肝炎病毒，如HCV基因型1a。在一个具 体实施方案中，小干扰RNA结合于如SEQ ID NO：26所述的HCV 1a的 IRES区内的大约19到大约25个核苷酸的序列。治疗可包含治疗(如改善 或减少感染的至少一种症状)或治愈。在某些具体实施方案中，将shRNA 肠胃外施用，如通过静脉注射或输液。
另一方面，本发明提供了抑制病毒中基因表达的方法，包括将病毒 RNA或病毒mRNA与小干扰RNA接触，或将小干扰RNA引入包含病毒 的细胞中，其中所述小干扰RNA，如shRNA或siRNA包含与病毒的多核 苷酸序列至少部分互补并能够如通过诱导病毒多核苷酸序列的断裂来抑制 病毒基因表达的序列。在某些具体实施方案中，小干扰RNA包含任一本 文所述的shRNA或siRNA序列、由该序列组成或基本上由该序列组成。 在某些具体实施方案中，小干扰RNA结合于大约19到大约30个核苷酸、 或大约19到大约25个核苷酸，例如大约19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29或30个核苷酸的病毒序列。在一个具体实施方案中，病 毒是丙型肝炎病毒，如HCV基因型1a。在一个具体实施方案中，小干扰 RNA与如SEQ ID NO：26所述的HCV基因型1a的IRES区内的大约19 到大约30个核苷酸的序列以及位于本文所述的siRNA或shRNA序列之一 的五个核苷酸内的序列相互作用。在其它的具体实施方案中，将至少两种 小干扰RNA导入细胞。
本发明还涉及由以下组分组成的RNA序列：(a)第一RNA序列， 其中所述第一RNA序列是如图10或图16A-B所示的序列，例如SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、 SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、 SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56 或与前述序列有一个、两个或三个核苷酸不同的序列；(b)第二RNA序 列，其与第一序列互补；(c)位于第一和第二核酸序列之间的环序列，环 序列由4-10个核苷酸组成；以及(d)任选地，两个核苷酸的突出端。在 某些具体实施方案中，第一RNA序列是SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、 SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、 SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、 SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56。在某些情况下，所述 RNA序列可包括至少一个修饰的核苷酸。本发明的RNA序列的环序列可 为如四个核苷酸、五个核苷酸、六个核苷酸、七个核苷酸、八个核苷酸、 九个核苷酸、十个核苷酸或至少十个核苷酸。在一些具体实施方案中，RNA 序列为shRNA，并包括通过包含至少一个非核苷酸分子的环连接在一起的 本文所述的HCV靶序列和互补序列。在某些具体实施方案中，RNA序列 的环为3′端是shRNA的有义链而5′端是其互补反义链。在其它具体实施 方案中，RNA序列的环为3′端是shRNA的反义链而5′端是其互补有义链。 在有些情况下，RNA序列包括两个核苷酸的突出端，并且这两个核苷酸的 突出端为3′UU。在有些情况下，突出端为一个核苷酸、两个核苷酸、三个 核苷酸或更多。在有些情况下，第一RNA序列为SEQ ID NO：57-79、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、或SEQ ID NO：18中 的任何一个。在有些情况下，RNA序列为图16A-B中所列举的序列。
本发明还涉及包括编码如本文公开的RNA序列(例如，图10或图 16A-B列举的RNA序列)的序列的DNA序列。本发明还包括含有这种 DNA序列的表达载体。还包括含有这种DNA序列的逆转录病毒载体，如 通过用载体感染细胞后可生产能表达本发明的RNA序列的原病毒的逆转 录病毒载体，所述RNA序列为例如，但不限于，图16A-B中所列举的 shRNA序列。
在某些方面，本发明涉及包括如本文公开的RNA序列(例如，非限制 性的，图16A-B列举的shRNA)和药学上可接受的赋形剂的组合物。在一 些具体实施方案中，组合物包含如本文公开的载体和药学上可接受的赋形 剂。在某些具体实施方案中，本发明的组合物包括至少两种如本文公开的 RNA序列。
另一方面，本发明包括抑制丙型肝炎病毒表达或活性的方法。该方法 包括提供能表达丙型肝炎病毒的细胞，并将该细胞与如本文公开的RNA 序列(其非限制性实施例为如图16A-B所示的序列)相接触。该细胞可是 哺乳动物，例如人类或非人灵长类动物，如黑猩猩的。在某些具体实施方 案中，该细胞与至少两种不同的RNA序列相接触。
在某些方面，本发明涉及如下方法，该方法包括鉴定感染或疑似感染 丙型肝炎病毒的对象，向对象提供治疗上有效量的包含一种或多种不同的 本文公开的RNA序列的组合物。在一些具体实施方案中，该方法也包括 在向对象提供组合物之后测定对象的病毒载量是否降低。在一些具体实施 方案中，该方法也包括在向对象提供组合物之后测定对象中至少一种病毒 蛋白或病毒核酸序列是否降低。
除非特别规定，本文所用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域 的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然与本文所述相似或等效的方法 和材料可被用于本发明的实践或测试，但是适宜的方法和材料如下所述。 本文提到的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献以其整体引入作 为参考。另外，材料、方法和实施例仅起解释说明作用，并没有限定作用。
本发明的其它特征和优点由详细的说明书、附图和权利要求书中是显 而易见的。
附图描述
图1A为丙型肝炎基因型1a的IRES核苷酸序列的表示(参见GenBank 登录号：AJ242654)。用下划线标出靶区344-374位的核苷酸。用抑制剂 已成功靶向多个区域(粗体字所示)，所述抑制剂包括HeptazymeTM核酶 (siRNA.com；189-207位)、Chiron 5U5siRNA[25](286-304位)、ISIS 14803硫代磷酸酯反义寡核苷酸[34](330-349位)、Mizusawa 331 siRNA[15](322-340位)和磷酰二胺吗啉寡聚物[8，35](344-363位)。可在[2，3]找 到已经测定到可以下调HCV IRES及其它HCV元件的siRNA的更完整列 表。
图1B显示从相应DNA模板的U6启动子经pol III转录得到的shRNA HCVa-wt(shRNA1)及其突变体的RNA序列。改变HCVa-wt的两个碱 基对(下划线)，以创建包含如所示的1个(HCVSNP1或HCVSNP2)或 2个错配(HCVa-mut)的shRNA HCVa-wt形式。
图1C显示shRNA HCVb-wt(sh9)、HCVc-wt(sh10)和HCVd-wt (sh11)的序列。
图1D显示HCV IRES二级结构，其中指出shRNA HCVa-wt、 HCVb-wt、HCVc-wt和HCVd-wt的靶位点。
图1E是用于制备HCV IRES靶序列及EMCV IRES对照的 pCDNA3/HCV IRES双萤光素酶报道基因构建体的示意图，在EMCV IRES中来自脑心肌炎病毒的IRES取代HCV IRES并因此缺乏定向于 HCV的shRNA的任何靶序列。在每种情况下，萤火虫萤光素酶的表达取 决于自IRES序列的转录起始，而海肾萤光素酶以帽-依赖性方式表达。
图1F是描述筛选在293FT细胞中能抑制HCV IRES介导的基因表达 的shRNA的结果的条形图。将293FT细胞以pCDNA3/HCV IRES双萤光 素酶报道基因构建体、pSEAP2(作为转染和特异性的对照)和shRNA (1nM)在24孔组织培养板的孔中进行共转染。加入pUC18质粒使每孔 中达到总共800ng核酸。转染后48小时，裂解细胞并用光度计测定萤火虫 萤光素酶的活性。所有数据均为相对于SEAP进行标化的，以一式三份实 施的单个独立实验的结果。
图2A的条形图描述测定在293FT细胞中HCV-IRES驱动的基因表达 所受到的抑制的实验的结果，所述的293FT细胞以双萤光素酶报道基因、 SEAP表达质粒和1pmol的体外转录的shRNA共转染。靶质粒为 pCDNA3/HCV IRES双萤光素酶报道基因(HCV IRES，如图1E所示)。 如实施例1所述测定萤火虫萤光素酶活性。将萤火虫萤光素酶和SEAP活 性基于100进行标化。
图2B是描述测定在293FT细胞中HCV抑制相对于EMCB抑制的实 验的结果的条形图。数据表示为用萤光素酶活性除以SEAP活性并基于100 标化后的值。
图2C是描述阐明单碱基错配对shRNA效力的影响的实验的结果的条 形图。实验条件如图2A所述。包含突变碱基对的SNP1与SNP2如图1B 所示。
图2D的线图描述测定HCVa-wt和突变(HCVa-mut)或对照(229) shRNA对HCV IRES驱动的基因表达的抑制的剂量反应的实验结果。实 验条件如图2A所述。数据表示为用萤光素酶活性除以SEAP活性并基于 100标化后的值。所有数据均为一式三份实施的单个独立实验的结果。
图2E的线图描述了如下实验的结果，所述实验测定HCVa-wt、 HCVa-mut与229shRNA在缺少shRNA靶点的双萤光素酶报道基因的基 因表达上的剂量反应。除了靶序列为由EMCV IRES而非HCV IRES驱动 的萤火虫萤光素酶之外，其余操作如图2D所述。
图2F为按如下处理的共转染293FT细胞的Northern印迹分析的再现； 将从未用抑制剂转染的细胞中(道1)、或用229(道2)、HCVa-wt(道 3)或HCVa-mut(道4)转染的细胞中分离出的10μg总RNA以变性凝胶 电泳分离，转移到膜上并相继地用32P-标记的fLuc、SEAP或延伸因子1A (EF1A)cDNA探针杂交。将RNA印迹暴露于进行显象和定量的储存磷 光质屏(storage phosphor screen)(BioRad FX Molecular Imager)。
图3A的线图描述了用人类肝细胞系Huh7来测试HCVa-wt与 HCVa-mut shRNA的剂量反应的实验结果。除了使用Huh7细胞以外，其 余实验操作如图2D所示。
图3B的线图描述了证明HCVa-wt shRNA不抑制缺少HCV IRES的 类似靶的实验结果。除了添加pCDNA3/EMCV IRES双萤光素酶报道基因 (EMCV IRES)以代替pCDNA3/HCV IRES双萤光素酶报道基因(HCV IRES)以外，将细胞如图3A所示进行转染。数据表示为用萤光素酶活性 除以SEAP得到的值。所有数据均产生自一式三份进行的单个独立实验。
图4A描述包含在HCV基因型1A的25个核苷酸靶位点(SEQ ID NO：26)内的7个人工siRNA和shRNA的19碱基对病毒识别序列，及 有关它们在溴乙锭染色的10％非变性聚丙烯酰胺凝胶上的纯度分析。 SiRNA：有义链与反义链包含3′-UU突出端；shRNAs：环序列和3′、5′- 端突出端与25个碱基对的shRNA的环序列和3′、5′-端突出端相同。
图4B是描述如下实验结果的条形图，其中测定RNA抑制剂(siRNA 和shRNA)在抑制剂浓度1nM时对于293FT细胞中HCV IRES-介导的基 因表达的抑制作用。
图4C是描述如下实验结果的条形图，其中测定RNA抑制剂在抑制剂 浓度0.1nM时对于293FT细胞中HCV IRES-介导的基因表达的抑制作用。
图5A是小鼠的IVIS图像的再现，其中将双萤光素酶HCV IRES报道 基因质粒(10μg)与SEAP(为控制注射效率和非特异性抑制而添加)和 100μg所示HCV shRNA或对照229shRNA(直接地或以100μg表达shRNA 的pol III表达质粒的形式)或者作为对照的pUC18质粒，共同注射入小鼠 的尾静脉。在注射后的不同时间点(24、36、48、60、72、84和100小时)， 将萤光素腹膜内施用，并用IVIS体内成像系统(IVIS in vivo imaging system)进行小鼠成像。图像表示84小时时间点的小鼠。
图5B是描述图5A所述实验的定量结果的图，其中RNA进行直接递 送。用ImageQuantTM软件进行定量。每个时间点代表4-5只小鼠的平均 值。在96小时的时间点，小鼠放血并且如实施例1所述用pNPP试验来测 定SEAP活性值。用萤光素酶除以SEAP活性并基于pUC18对照小鼠 (100％，为了清晰在pUC18对照上没有显示误差棒；误差棒与所示的其 它类似)进行标化来表示定量数据。
图6是描述如下实验的结果的条形图，在所述实验中比较shRNA与磷 酸二酰胺酯玛琳代寡聚物对于小鼠中HCV IRES-介导的报道基因表达的 抑制作用。如图5的实验所述，用双萤光素酶HCV IRES报道基因质粒和 pSEAP与100μg所示HCV shRNA抑制剂或1nmole以前已证实可以抑制 HCV IRES表达构建体的玛琳代寡核苷酸[8]共同注射小鼠。在处理后的不 同时间(12小时、24小时、48小时和144小时)给小鼠拍照。所示数据 为48小时时间点的。该定量数据表示为基于pUC18对照(无添加)小鼠 标化的萤光素酶和SEAP活性。由每构建体3-5只小鼠得到所示结果。
图7是描述如下实验结果的图，其中由表达靶向nsp-1基因的抑制性 shRNA的质粒瞬时转染BHK-21细胞。转染后24小时，用10μl高度复制 的表达GFP的塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)(SFV-GFP-VA7； 足以实现约100％感染的感染复数(MOI))感染细胞，并在感染后24小 时用流式细胞计测定病毒-介导的GFP表达。siRNA-介导的抑制的水平约 为35％。标记：靶向Nsp-1基因的Nsp1.shRNA(nsp-l#2)；空载体，pU6； 首次用于实验的()、未感染的BHK细胞。
图8是描述研究shRNA对于复制缺陷SFV(SFV-PD713P-GFP)的 抑制的实验结果的条形图。用表达抑制剂shRNA的质粒瞬时转染BHK-21 细胞。转染后46小时，在无血清培养基中以8％PEG按MOI为5使用 SFV-GFP病毒感染细胞1小时。然后加入完全培养基并于37℃温育细胞 过夜。用流式细胞计在感染后9、24、32、99和125小时分析细胞。为了 清楚，只显示3个时间点(9、24和32小时)。将每个shRNA的抑制值 基于衣壳shRNA标准化。在该SFV-GFP复制缺陷病毒中不存在衣壳 mRNA，因此衣壳shRNA对GFP表达应没有影响。本实验中shRNA表 达构建体的转染效率约为70％，表明实际的病毒抑制作用显著高于所示水 平。第五组条形(混合的)指靶向nsp1-4和衣壳的shRNA的混合物。
图9是描述测定shRNA对HCV复制子的抑制作用的实验结果的线图。
图10是描述用于筛选在293FT细胞中能抑制HCV IRES-介导的基因 表达的shRNA的序列及其结果的表格。在48孔组织培养板的孔中用 pCDNA3/HCV IRES双萤光素酶报道基因构建体(40ng)、pSEAP2(25ng， 作为转染和特异性对照)和shRNA(1或5nM)(使用LipofectamineTM2000) 共转染细胞。加入质粒pUC18以向每个孔提供总共400ng核酸。转染后 48小时，取出上清液来进行SEAP分析，裂解细胞，并用光度计测定萤火 虫萤光素酶的活性。所有数据都是至少两个一式三份进行的独立实验的结 果。SEAP水平在所有样品中都一致。还在突变的pCDNA3/HCV IRES双 萤光素酶报道基因构建体上进行了测定shRNA特异性的对照实验，其中 C340(IRES中)被U替代。
图11是具有被shRNA靶向的片段的HCV IRES 3′端序列的图示。其 中指出C340→U的突变(用于测定shRNA的特异性)。
图12A是HCV IRES的5′端和六个19-bp shRNA的靶向位置的图示。
图12B的条形图描述了筛选在293FT细胞中能抑制HCV IRES-介导 的基因表达的shRNA的结果。如图10进行实验；shRNA浓度，1nM。
图13A是所示25个碱基对shRNA的测试变体的序列的图示，其中检 查了不同的环大小和序列以及3′端。
图13B是描述筛选能在293FT细胞中抑制HCV IRES介导的基因表 达的图13A所示shRNA的结果的条形图。如图10进行实验。shRNA浓 度，1nM。(shRNA序列列于图16A-B)
图14A是所示19-bp shRNA的测试变体的序列的图示，其中检查了不 同的环大小和序列以及3′端。
图14B是描述筛选能在293FT细胞中抑制HCV IRES介导的基因表 达的图14A所示shRNA的结果的条形图。如图10所述进行实验。shRNA 浓度，1nM。(shRNA序列列于图16A-B)
图15是描述筛选shRNA(和siRNA)在HCV复制子系统中的抑制活 性的结果的条形图。用RNA抑制剂转染稳定表达HCV亚基因组复制子的 人类肝细胞(AVA5，Huh7细胞系的衍生物)，并测定HCV表达的量。 测试了一系列浓度并确定了产生50％抑制作用的sh/siRNA浓度(EC50)。 暗条和浅条表示两个独立实验的结果。
图16A-B是描述靶向所示HCV IRES的shRNA序列的表格。用下划 线表示ShRNA环。小写所示的核苷酸与靶序列不互补。
发明详述
本发明提供用于抑制病毒(例如丙型肝炎)基因表达和/或治疗哺乳动 物的病毒感染的组合物、方法和试剂盒。
RNA干扰提供了一种治疗病毒感染的新的治疗方法。本发明提供靶向 病毒序列并抑制(即减少或消除)病毒基因表达的小干扰RNA(例如， shRNA和siRNA)，以及使用这种小干扰RNA治疗哺乳动物(如人类) 的病毒感染的方法。在一些具体实施方案中，本发明的小干扰RNA构建 体通过在小干扰RNA的反义序列所识别的靶序列内部或附近诱导病毒多 核苷酸序列的断裂来抑制病毒的基因表达。
如本文所用，“小干扰RNA”指包含一个或多个至少部分互补于病毒的 多核苷酸序列并能与其相互作用的短序列的RNA构建体。相互作用可采 取小干扰RNA的互补(反义)序列与病毒靶多核苷酸序列之间直接结合 的形式，或可采取通过酶机器(例如，蛋白质复合体)允许小干扰RNA 的反义序列识别靶序列的间接相互作用的形式。有些情况下，小干扰RNA 识别靶序列导致在小干扰RNA的识别(反义)序列所识别的靶位点内部 或附近的病毒序列断裂。小干扰RNA可仅包含核糖核苷酸残基，或小干 扰RNA可包含一个或多个修饰残基，尤其是在小干扰RNA的末端或在小 干扰RNA的有义链上。本文所用的术语“小干扰RNA”包括shRNA和 siRNA，两者均为本领域技术人员所理解和知道，是指具有特定的构型特 征和类型的RNA构建体。
如本文所用，“shRNA”指包含双链区和在一端形成发夹环的环区的 RNA序列。该双链区在茎的每一侧各典型地有大约19个核苷酸到大约29 个核苷酸的长度，该环区典型地有大约3到大约10个核苷酸长度(并且任 选存在3’或5’端单链的突出核苷酸)。这种shRNA的一个实例HCVa-wt shRNA具有一个25碱基对双链区(SEQ ID NO：12)、一个10核苷酸环、 一个在5′末端的GG延伸以及一个在3′末端的UU延伸。在说明书(例如 图16A-B)中提供了适用于如抑制HCV表达的shRNA的其它实例。
如本文所用，“siRNA”指包含双链区并在每末端具有非同源残基的3′ 突出端的RNA分子。该双链区一般有大约18到大约30个核苷酸的长度， 且突出端可为任何长度的非同源性残基，例如2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16或更多个核苷酸。SiRNA还可包含由非配对 区分开的两个或多个19-30碱基对的区段。不参照任何特定理论，非配对 区可起到阻断先天免疫途径的激活的作用。这种siRNA的一个实例是 HCVa-wt siRNA，其具有一个25个碱基对的双链区(SEQ ID NO：12)， 并在每个3′末端具有一个UU延伸。
在一个具体实施方案中，如本文所述的小干扰RNA包含互补于丙型肝 炎(“HCV”)内部核糖体进入位点(IRES)元件的序列的序列。在一个具 体实施方案中，病毒为HCV基因型1a。
已经表明siRNA基因抑制作用可显著抑制许多哺乳动物系统的基因表 达。由于具有高水平的二级结构，HCV IRES已经被提示是siRNA或 shRNA的差靶点。但是Mizusawa报道了，在293和Huh7组织培养细胞 中对HCV IRES的成功打靶，报道基因表达分别降低了50％和74％。类 似地，Seo和同事[25]报道了100nM siRNA能在5-2Huh7细胞中抑制HCV 的复制(大约降低85％)。如本文所述，现在已经证明了靶向HCV IRES 3′末端(包括AUG翻译起始位点及其下游)的小干扰RNA(shRNA和 siRNA)，可在293FT细胞中以0.3nM诱导HCV IRES-依赖性萤光素酶 表达降低96％，并在Huh7细胞中以0.1nM诱导75％降低(参见图2D和 3A)。此外，已证明将shRNA直接运送到小鼠肝脏中可有效抑制HCV IRES-依赖性报道基因的表达。这是直接运送RNA发夹(而非由质粒或病 毒载体在体内表达)在动物模型中达成RNAi介导的基因抑制的第一个证 明。鉴于血液中存在的高水平的核酸酶，通过流体动力学注射而直接运送 到小鼠肝脏中的shRNA的有效性是使人惊讶的。这些shRNA有效降低肝 脏中基因表达的观察结果表明：这些shRNA抑制剂(1)很有效，并且不 需要在小鼠肝脏中达到高水平来产生基因抑制，(2)可以被足够快速地运 送到肝脏中，如在其被核酸酶大量切割而阻碍抑制作用之前，或者(3)对 核酸酶降解作用具有内在稳定性(或这些特征的结合)。
有报道提示，由于非天然5′三磷酸的存在，来自噬菌体启动子的体外 合成的转录物可有效诱导干扰素(IFN)α和β[26]。此外，由pol III表达 载体表达的shRNA也可诱导IFN[27]。这种干扰素诱导将如何影响shRNA 在HCV感染中的临床应用还不清楚。目前的HCV疗法包括用干扰素α治 疗，这表明如果干扰素被shRNA所诱导，它可具有正效应。迄今为止， 还没有报道过动物在接受RNAi施用后出现干扰素-相关的副作用[3]。此外， 已引起关注的是：siRNA的脱靶效应以及当用慢病毒载体运送siRNA或 shRNA时的潜在细胞毒性作用[28]。
本发明还涉及测定靶向HCV IRES序列的siRNA和shRNA以鉴定具 有足够活性(如在选定的一组这种序列中的最高活性)以作为用于治疗的 候选物的那些序列的方法。测定也可包括筛除具有不想要的脱靶效应或普 遍的细胞毒性作用的小干扰活性。脱靶效应包括，而不限于非靶基因的敲 除、非靶基因表达的抑制和与天然小RNA(microRNA)途径的竞争 (Birmingham等人，Nat.Methods.20063(3)：199-204；Grimm等人， Nature 2006 441(7092)：537-541)。在本领域已知鉴定细胞毒性作用的 方法(例如，Marques等人，Nat.Biotechnol.2006 24(5)：559-565；Robbins 等人，Nat.Biotechnol.200624(5)：566-571)。
HCV 5′-UTR中的IRES区是高度保守的(92-100％同一性[15，29-31]) 并有几个片段似乎是不变的，这使得IRES成为基于核酸的抑制剂的主要 靶点。AUG翻译起始密码子周围的区域尤其是高度保守的，正如在来自不 同地理区域的超过81个分离株中观察到的，在+8位到-65位(除了-2位有 单核苷酸变化外)是不变的[32]。尽管IRES基序中序列的保守性，但是不 太可能靶向单一序列(即使其高度保守)就足以防止逃避突变体。已知RNA 病毒具有高突变率，这是由于RNA聚合酶的高出错率和该酶缺乏校对活 性所致。平均起来，HCV RNA每复制一次将有一个错误加入新链中。此 出错率会因病毒颗粒在活跃感染时的大量产生而增加(在慢性感染患者体 内，每日大约一兆)[33]。因此，在本发明的一些具体实施方案中，靶向几 个保守位点或，备选地，将如本文所述的shRNA用作联合治疗(如与三 氮唑核苷和/或聚乙醇化干扰素一起)的组分。如本文证明的，单一错配不 会完全阻断shRNA活性(参见实施例2；图2D)；因此每个不同的shRNA 都可具有一些对抗有限数量的突变的活性。因此，本发明包括利用可包括 与靶序列的错配的shRNA来抑制HCV表达的方法。本发明还包括通过施 用至少两种不同的靶向HCV IRES的shRNA来抑制HCV表达的方法， 其中的所述shRNA在靶向序列中有差异。
McCaffrey与同事们报道了靶向在AUG翻译起始位点处的保守HCV IRES位点的磷酰二胺吗啉寡核苷酸有效抑制了报道基因的表达[8]。使用相 同的吗啉化合物抑制剂来与本文所述的shRNA抑制相对比。发现靶向保 守HCV IRES位点的吗啉化合物和shRNA两者都有效并强烈地抑制了 IRES-依赖性的基因表达。在吗啉化合物中需要有4个突变来阻断活性， 而在shRNA中有2个改变就足够了，这说明更大的shRNA特异性。这种 潜在优点与shRNA抑制剂缺乏非天然残基及由此所致的可能更少的副作 用相联合，可以与吗啉寡聚物的稳定性的增加相抵。
使用双报道基因萤光素酶质粒，其中萤火虫萤光素酶(fluc)的表达取 决于HCV IRES[24]。上游海肾萤光素酶的表达不是HCV IRES依赖性的， 而是在帽依赖性过程中翻译。HCV IRES shRNA的直接转染，或者备选地， 从pol III启动子载体表达shRNA，均有效地阻断了人类293FT与Huh7 细胞中HCV IRES介导的fLuc表达。包含双突变的对照shRNA对fLuc 表达几乎没有或完全没有作用，并且仅包含单一突变的shRNA表现出部 分抑制作用。还在小鼠模型中评估了这些shRNA，其中通过流体动力学压 转染经由尾静脉将DNA构建体运送到肝脏的细胞中。利用双萤光素酶表 达质粒、shRNA和分泌性碱性磷酸酶质粒转染肝脏的细胞，并且在12到 96小时的多个时间点上进行动物的成像。体内成像显示出，HCV IRES shRNA(直接地或者备选地从pol III质粒载体表达)抑制了HCV IRES 依赖性报道基因的表达；突变或无关shRNA几乎不起或完全不起作用。 这些结果表明以RNA形式运送的或从病毒或非病毒载体表达的shRNA， 可用作控制HCV和相关病毒的有效抗病毒剂。
对靶向HCV IRES域IV上的不同位点的三个额外的shRNA的测定显 示出另一个有效shRNA，即HCVd-wt，其靶位点自HCVa-wt的靶位点移 动6个核苷酸。HCVb-wt与HCVc-wt是低效得多的抑制剂。
为了进一步研究局部序列对于效力的影响，测定了七个体外转录的包 含与HCV IRES序列互补的19个碱基对序列的shRNA构建体以及包含相 同的19个碱基对序列的相应合成的siRNA的抑制活性，其中所述shRNA 构建体和合成的siRNA靶向HCVa-wt的25个碱基对位点(344-368)内 的所有可能位点。还测定了与HCVa-wt shRNA相应的25个碱基对的合成 siRNA。所有测试的构建体都表现出高水平的活性。通常，19个碱基对的 siRNA比19个碱基对的shRNA更有效。最有效的siHCV19-3在1nM (＞90％抑制)、0.1nM(大约90％抑制)以及甚至在0.01nM浓度下(大 约40％抑制)有效。因此，设计以靶向HCV IRES上344-374区的19-25 个碱基对的shRNA和siRNA是通常有效的HCV表达的抑制剂，但有一 些局部差异。
本发明的小发夹RNA可任选地包括在shRNA的有义链和反义链之间 导致强非共价键的结构。这种非共价键的例子包括由金属离子介导的交联。 可在天然或修饰的核苷酸残基(包括，例如，修饰的碱基、糖和端基)之间 形成这种交联，如Kazakov和Hecht 2005，Nucleic Acid-Metal Ion Interactions，King，R.B.(编辑)，Encyclopedia of Inorganic Chemistry. 第二版，Wiley，Chichester，第VI卷，第3690-3724页，如5.4.3部分中所述。 所述键的变体的其它非限制实例可在专利申请WO 99/09045(US 2006074041；如图10)中找到。通常可交联的核苷酸残基的位置处在当双 链体形成时紧靠在一起的互补RNA链的末端。某些金属离子(或金属离 子配位化合物)的加入可导致对这些金属离子具有强亲合力的官能团(例 如-SH、-SCH3、硫代磷酸酯、咪唑化物(imidazolide)、邻菲咯啉及其它) 的交联。可以在有义RNA链和反义RNA链的化学合成中，导入这些修饰 的核苷酸。有义链和反义链中的修饰的核苷酸可形成碱基对或成为1-3个 核苷酸的突出端的部分。
靶向序列(targeting sequence)
说明书中提供了靶向序列的实例。在如表1和图10中提供了靶向序列 的非限定实例。并入靶向序列的SiRNA和shRNA的非限制性实例参见说 明书(如图1和图16A-B中)。
环
还研究了shRNA的环区的大小和序列的影响。shRNA茎-环的环区可 小至2个到3个核苷酸，且没有明确的大小上限；通常，环是4个到9个 核苷酸，且通常为不引起不期望的作用(如由与非靶基因互补导致的作用的 序列)。可将如GNRA四环这样的高度结构化环序列用于shRNA的环区(如 作为环)。环可位于分子的任一端；即，有义链可为相对于环的5′或3′。 此外，可以将非互补双链区(大约1个到6个碱基对，如4个CG碱基对) 置于靶向双链体和环之间，如充当“CG夹”来增强双链体的形成。如果用 了非互补的双链体，就需要至少19个碱基对的靶互补双链体。
环结构还可包括可逆的连接，如S-S键，其可由导入核苷酸残基的-SH 基团的氧化而形成，例如，如(Earnshaw等人，J.MoI.Biol.，1997，274： 197-212；Sigurdsson等人，Thiol-Containing RNA for the Study of Structure and Function of Ribozymes.METHODS：A Companion to Methods in Enzymology，1999，18：71-77)中所述。具有SH基团的核苷 酸残基的定位的非限制性实例是位于在双链体形成时紧靠在一起的互补 RNA链的末端。可以在小干扰RNA的有义RNA链和反义RNA链的化学 合成期间，导入这种修饰的核苷酸。有义RNA链和反义RNA链中的此修 饰核苷酸可形成碱基对或形成1个到3个核苷酸的非互补突出端。
可在实施例中找到环及其应用，如在靶向HCV的shRNA和siRNA中 的应用的其它非限制性实例。
末端
如本文所述的shRNA的3′端可具有2个或更多个核苷酸的非靶互补性 突出端，例如UU或dTdT，但是突出端可为包括化学修饰的核苷酸在内 的任何核苷酸，例如，促进核酸酶耐受性的增加的核苷酸。在其它具体实 施方案中，3′末端上有1个或0个核苷酸的突出端。
5′末端可具有非互补的延伸，例如两个G(如图1B所示)，一个 GAAAAAA序列，或仅仅1个或0个延伸超出靶互补性双链体区的核苷酸。 在图1B所示的序列中，包括两个5′G主要是为了便于从T7启动子进行转 录。
其它特征
可任选地包括在用于抑制HCV表达的shRNA中并为本发明所包括的 其它特征是：靶互补性双链体区从大约19个碱基对至大约30个碱基对的 长度变化，所靶向的序列的小的移动(通常0个到大约2个核苷酸)，以 及沿靶的任一方向的多至大约10个核苷酸的移动可位于可靶向的区域内。 类似地，还可以耐受错配：反义链中的大约1个到大约2个与有义链中的 大约1个到大约9个(后者使发夹双链体丧失稳定性但不影响反义链对靶 序列的结合强度)；耐受的数量部分取决于靶互补性双链体的长度。如本 文所述，例如使用靶向HCV IRES的序列，在29个碱基对的靶互补性双 链体中具有至少7个G-U错配的shRNA能成功地用于抑制HCV表达。 注意图1B所示的两个突变大幅消减了抑制作用，但在其它位置具有突变 的其它突变体，尤其是如果它们密集在一起和/或紧靠末端，则可能被更好 地耐受。某些变化在本技术领域内是已知的或在本申请中被证实。
载体
本文描述了用于制备shRNA和siRNA的适宜载体，其是本技术领域 已知的。在非限制性实例中，可在来源于腺相关病毒或慢病毒的载体环境 中用Pol III启动子例如U6或H1表达shRNA。人U6细胞核RNA启动子 和人H1启动子为可用于表达shRNA的pol III启动子。
通常在载体中想要的一个特征是相对延长的转基因表达。慢病毒载体 能转导非分裂细胞，并保持转基因的持续长期表达。腺相关病毒血清型8 被认为是安全的，并且其一个特征在于延长的转基因表达。
候选的shRNA和siRNA
在有些情况下，一个或多个小干扰RNA被鉴定为具有抑制靶病毒(如 HCV)的活性。可进行其它实验来进一步表征这些RNA用于例如抑制动 物中的HCV表达的适宜性。可利用动物模型进行这种实验。一个非限制 性实例包括小鼠模型，例如，如实施例3所列举的(下文)。在本领域内 已知适合于测试对HCV的治疗的其它动物模型，如使用黑猩猩。
方法
本发明涉及抑制病毒中基因表达的方法，包括将病毒与小干扰RNA接 触，例如本文所述的包含至少部分互补于病毒的多核苷酸序列并能与之相 互作用的序列的shRNA或siRNA。在一些具体实施方案中，接触病毒包 含将小干扰RNA导入包含病毒的细胞，即，被病毒感染的细胞。如本文 所用的“抑制基因表达”指病毒的至少一个基因的表达的减少(即，水平降 低)或消除。例如，与被病毒感染的相应的细胞或动物相比的表达减少。 在一些具体实施方案中，对基因表达的抑制作用通过小干扰RNA所结合 的病毒靶序列的断裂来实现。可通过分析病毒RNA或病毒蛋白来测定基 因表达。在有些情况下，通过评价感染动物中症状的减少或与病毒感染有 关的蛋白(例如，病毒蛋白如p24，或宿主蛋白如干扰素)的表达或活性 的变化(如减少)来测定方法(例如，使用本文所述的组合物治疗)的效 力。
本发明还涉及在哺乳动物中治疗病毒感染或治疗疑似被感染的对象 (包括对于预防性治疗而言暴露于病毒的对象)的方法，包括向哺乳动物 给予含有治疗上有效量的小干扰RNA(如本文所述的包括至少部分互补于 病毒的多核苷酸序列并能与其相互作用(如在生理条件下杂交，或实现 RNAi活性)的序列的shRNA或siRNA，所述病毒的多核苷酸序列为如 HCV的IRES序列)。在一些具体实施方案中，该哺乳动物为人类。在一 个具体实施方案中，哺乳动物是人类并且病毒感染是HCV感染，如HCV 基因型1a的感染，并且小干扰RNA包含至少与HCV的IRES序列互补 的序列。
如本文所用，“治疗上的有效量”指能达到希望的治疗效果(例如减少 或消除病毒感染)的小干扰RNA的量。治疗上的有效量可分一剂或多剂 施用。剂量的非限制性实例为大约0.1mg/kg到大约50mg/kg，例如大约1 到大约5mg/kg。在本领域中已知适当的运送方法，并且适当的运送方法包 括，例如，静脉内施用(例如经由末梢静脉或经由导管)。非限制性实例 包括经由肝动脉或门静脉运送。
通常在治疗哺乳动物的病毒感染的方法中，小干扰RNA与药学上可接 受的载体一起施用。如本文所用，“药学上可接受的载体”(本文也可替换 称为“药学上可接受的赋形剂″)是便于一种或多种小干扰RNA施用的相 对惰性物质。例如，载体可赋予组合物形状或稠度或可充当稀释剂。药学 上可接受的载体是生物相容的(即对宿主无毒)，并适于药学上有效的物 质的特定施用途径。适宜的药学上可接受的载体包括但不仅限于稳定剂、 湿润剂和乳化剂、改变渗透性的盐、包囊剂、缓冲剂和皮肤渗透增强剂。 在一些具体实施方案中，药学上可接受的载体为水或盐水。药学上可接受 的载体的实例描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences(Alfonso R. Gennaro，编辑，第18版，1990)。
在治疗病毒感染的方法中，如本文所述的小干扰RNA通常是胃肠外施 用，例如皮下、静脉内或肌内。
组合物
本发明提供抑制病毒基因表达和/或治疗哺乳动物的病毒感染的组合 物，其包含至少一种如本文所述的小干扰RNA。本发明的组合物可包含两 种或两种以上的如本文所述的小干扰RNA。根据本发明，小干扰RNA(例 如shRNA或siRNA)包含与大约19个到大约30个核苷酸的病毒多核苷 酸序列基本互补的序列，其中小干扰RNA的基本互补序列与病毒的多核 苷酸序列的相互作用，通过例如断裂病毒多核苷酸序列而抑制病毒基因的 表达。
在一些具体实施方案中，组合物包含包括选自由SEQ ID NO：12、17、 18、19、20、21、22、23、24与25组成的组的序列的shRNA。在一些具 体实施方案中，组合物包含包括下列序列之一的shRNA：SEQ ID NO：34、 SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、 SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ BD NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、 SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56(表10)。 在一些具体实施方案中，组合物包含SEQ ID NO：57-110中的一种或多种 shRNA。在一些具体实施方案中，组合物包含包括从SEQ ID NO：19、20、 21、22、23、24和25中选出的序列的siRNA。在其它的具体实施方案中， 组合物包含包括SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、 SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、 SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56(图10)的序列的siRNA。在一些具体实施方案 中，组合物包含shRNA或siRNA，其中所述shRNA或siRNA可以结合 于HCV(如HCV基因型1a)的IRES元件内的大约19个到大约30个核 苷酸的序列，即包含与HCV(如HCV基因型1a)的IRES元件内的大约 19个到大约30个核苷酸的序列基本互补的序列。组合物可包括多于一种 的不同shRNA，如靶向IRES中的不同序列或靶向靶序列的不同等位基因 或突变的shRNA。如本文所述的shRNA或siRNA可包括多于一种的所鉴 定到的序列。某些组合物包含多于一种的不同shRNA或siRNA序列。
在一些具体实施方案中，本发明提供包含如本文所述的小干扰RNA和 药学上可接受的载体的药物组合物。在一些具体实施方案中，配制药物组 合物来对哺乳动物，例如人类进行肠胃外施用。
可以配制包括短干扰RNA(例如siRNA或shRNA)的药物组合物以 便与其预定的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、 真皮内、皮下、吸入、经皮(局部)、经黏膜和直肠施用或口服。用于肠 胃外、真皮内或皮下施用的溶液或悬液可包括下列组分：灭菌的稀释剂， 例如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它 合成的溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例 如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如醋 酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调整渗涨度的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。 可用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)来调节pH。肠胃外制剂可封入由玻璃 或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量瓶中。
适于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(当为水溶性时)或分散 体及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。就静脉内施用而 言，适当的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF， Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物都 必须是无菌的，并应当是达到易于注射的程度的流体。它应当在生产和储 存的条件下稳定，并必须抗微生物如细菌和真菌的污染作用而保存。载体 可为溶剂或分散介质，其包含如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和 液体聚乙二醇等)及它们的适宜混合物。可以如通过利用如卵磷脂等包衣 料，在分散体的情况下通过保持悬液中选定颗粒的大小以及通过利用表面 活性剂，来保持适当的流动性。可通过各种抗细菌的和抗真菌的试剂(例 如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来防止微 生物作用。在有些情况下，可以包括等渗剂，例如糖或多元醇，如甘露醇、 山梨醇，或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包含延迟 吸收剂(如单硬脂酸铝或明胶)来实现。
可通过将指定量的活性物质混入含有上述列举的一种组分或多种组分 的联合的适当溶剂中，按照需要，随后过滤除菌，来制备无菌的可注射溶 液。通常，通过将活性化合物混入包含基本分散介质及从上述所列的或本 领域已知的其它组分中选出的其它组分的无菌载体中来制备分散体。对于 用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法为真空干燥与冷冻 干燥，从相应的前已除菌过滤的溶液产生活性组分加上任何的额外想要的 组分的粉末。
口服的组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。为了实现口服治 疗施用的目的，可将活性化合物与赋形剂混合，并以片剂、锁剂或胶囊剂 (例如明胶胶囊)的形式使用。可包括药学上相容的粘合剂作为组合物的 一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可包含任何下列组分，或具有类似 性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂，例 如淀粉或乳糖；崩解剂，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如 硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或 糖精；或矫味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调料。
为了通过吸入施用，从加压容器或包含适当推进剂(如气体，例如二 氧化碳)的分配器或喷雾器中以气溶胶喷雾的形式递送组合物。
还可通过经黏膜或经皮的途径进行全身施用。为了经黏膜或经皮施用， 可在制剂中使用适于待被渗透的屏障的渗透剂。本领域中通常已知这种渗 透剂，其包括，例如，用于经黏膜施用的去污剂、胆盐以及梭链孢酸衍生 物。经黏膜施用可通过使用鼻喷雾法或栓剂完成。就经皮施用而言，将活 性物质配制成如通常本领域中已知的软膏、油膏、凝胶或霜剂。
还可以将组合物配制成栓剂(如具有传统栓剂基质，例如可可脂及其 它甘油酯)或滞留灌肠剂形式用于直肠递送。
在一个具体实施方案中，使用保护活性化合物使之免于从身体中被快 速清除的载体来配制活性化合物，例如控释制剂，包括植入物和微囊化的 递送系统。可使用可生物降解的、生物可相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙 烯酯共聚物、聚酐、聚羟基乙酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这种制剂的 制备方法对本领域技术人员来说是显而易见的。还可从Alza Corporation 和Nova Pharmaceuticals，Inc商业获得这些材料。脂质体悬液(包括以抗 病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接受 的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法(例如如美国专利号 4,522,811中所述)来制备。
以单位剂量的形式配制口服或肠胃外的组合物有利于方便施用和统一 剂量。本文所用单位剂量形式指适于作为一个剂量用于治疗对象的物理上 离散的单位；每个单位包含经计算可以与选定的药学载体共同产生想要的 治疗效果的预定量的活性化合物。
本文公开的化合物的毒性和治疗效力可通过本领域已知的制药方法， 例如在细胞培养物或实验动物中确定，如测定LD50(使群体的50％致死 的剂量)和ED50(在群体的50％中产生治疗效力的剂量)。毒性与治疗 性效果之间的剂量比为治疗指数，并且其可表示为比值LD50/ED50。优选 显示高治疗指数的化合物。尽管可以使用显示毒副作用的化合物，但应当 谨慎设计递送系统以将这种组合物靶向患病组织部位，从而将对未患病细 胞的潜在损害降到最小，并且由此减少副作用。
可将从细胞培养物试验和动物研究获得的数据用于配制人类用的剂量 范围。化合物的剂量优选位于几乎没有或完全没有毒性的包括ED50的循 环浓度范围内。剂量可根据使用的剂型和所用的施用途径在此范围内变动。 就本发明方法中使用的任何化合物来说，最初可从细胞培养物试验中估算 治疗上有效的剂量。可在动物模型中配制剂量，以达到包括如在细胞培养 物中所测定的IC50(即，达到症状的最大抑制的一半的受试化合物的浓度) 的循环血浆浓度范围。可将该信息用于更精确地确定人类中的有用剂量。 可以如通过高效液相色谱法测定血浆中的水平。
本发明还涉及制备用于治疗如HCV感染的对象的药物的方法。也可 将该药物用于有HCV感染危险的对象或疑似感染了HCV的对象进行预防 性治疗。
试剂盒
本发明提供包含如本文所述的小干扰RNA的试剂盒。在一些具体实施 方案中，试剂盒还包括用于本文所述的抑制病毒基因表达的方法和/或治疗 哺乳动物病毒感染的方法的使用说明书。说明书可以以印刷品形式或以如 软盘、CD或DVD等电子媒介的形式，或以能获得此说明书的网址的形式 提供。
在一些具体实施方案中，试剂盒包括本发明的药物组合物，例如包括 至少一种小干扰RNA(例如shRNA或siRNA)的至少一个单位剂量，以 及在治疗或预防病毒感染的用法方面给卫生保健者提供信息的说明书。经 常小干扰RNA以无菌水性药物组合物或干粉(例如冻干的)组合物形式 包括在内。
可以提供适宜的包装。如本文所用，“包装”指通常用于系统中能在固 定界限内容纳适于给个体施用的本发明组合物的固体基质或材料。这种材 料包括玻璃和塑料(例如聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯)瓶、小瓶、纸、塑 料和箔覆盖的塑料封套等。如果使用电子光束(e-beam)消毒技术的话， 包装应具有足够低的密度来允许对内容物消毒。
试剂盒还可任选地包括本发明的药物组合物的施用装置，例如注射器 或静脉内施用装置，和/或无菌溶液，例如稀释剂，如水、盐水或葡萄糖溶 液，用于将干粉(例如冻干的)组合物配制为施用形式。
表1
本申请中公开的可并入shRNA或siRNA中的靶向序列以及这种shRNA和 siRNA的实例的列表
图16A-B列举了包含靶向HCV IRES的序列以及使用本文所述的方法 测试的shRNA的实例。
实施例
下列实施例进一步举例说明本发明。实施例仅以举例说明为目的。它 们不以任何方式被解释为限制本发明的范围或内容。
实施例1：shRNA表达盒的设计与构建、T7转录反应以及报道基因试验
从IDT(Coralville，IA)得到化学合成的寡核苷酸，在无RNase与无 致热原的水(Biowhittaker)中重悬浮，并如下所述退火。下列用来制备 shRNA的寡核苷酸对包含T7启动子元件(双下划线)、有义和反义HCV IRES序列与miR-23小RNA环结构(据报道有利于细胞质定位[21，22])。
T7-HCVa-wt fw：
5’-agcacgaatcctaaacctca
aagaCTTCCTGTCAtctttgaggtttaggattcgtgctcTT-3’(SEQ ID NO：1)；
T7-HCVa-wt rev：
5’-AAgagcacgaatcctaaacctcaaagaTGACAGGAA
Gtctttgaggtttaggattcgtgct-3’
(SEQ ID NO：2)
(双下划线标出T7启动子序列)。除了将核苷酸改变(G→C与C→G) 在单下划线标出的残基处并入合成的寡核苷酸中以外，HCVa-mut shRNA 的T7转录物是相同的。
将HCVa-wt shRNA(图1B)设计为靶向HCV IRES上的344-374区； 将HCVb-wt设计为靶向299-323区(图1C)；将HCVc-wt设计为靶向 318-342区(图1C)；并且将HCVd-wt设计为靶向350-374区(图1C)。
使用MEGAscript试剂盒(Ambion)体外转录ShRNA#1-7(靶向 HCV IRES上的位置344-362，345-363，346-364，347-365，348-366，349-367， 350-368；参见图4A，其描述了19个碱基对的病毒识别序列)，ShRNA#1-7 包含与HCVa-wt shRNA相同的环序列和5′、3′突出端。在Dharmacon (Lafayette，CO)化学合成SiRNA#1-7(参见图4A，其描述了19个碱 基对的病毒识别序列)，SiRNA#1-7在有义和反义链上都包含3′-UU突出 端。
用来制备对照shRNA229的寡核苷酸对(其靶向肿瘤坏死因子α)为 229-5′-GGCGGTGCCTATGTCTCAGCC TCTTCTCACTTCCTGTCATGAGAAGAGGCTGAGACATAGGCACC GCCTT-3′(SEQ ID NO：3)和 229-3′-AAGGCGGTGCCTATGTCTCAGCCTCTTCTCATGACAGGAA GTGAGAAGAGGCTGAGACATAGGCAC-5′(SEQ ID NO：4)。
Pol III U6 shRNA表达载体的构建——小发夹shRNA表达载体的设计
在95℃下将寡核苷酸对在RNA聚合酶缓冲液中一起温育(例如60μl 5X退火缓冲液(Promega；IX＝10mM Tris-HCl(pH7.5)，50mM NaCl) 中每种100μM寡核苷酸各120μl)两分钟，并经1小时缓慢冷却(退火) 至低于40℃。所述寡核苷酸被设计成提供4个碱基突出端，以便快速克隆 入Bbs1/BamH1消化的pCRII-U6质粒中(用下划线标出寡核苷酸序列中 的Bbs1与BamH1识别位点或突出端)。利用TA克隆试剂盒(Invitrogen)， 将利用引物huU6-5′ATCGATCCCCAGTGGAAAGACGCGCAG(SEQ ID NO：5)和huU6-3′-GGATCCGAATTCGAAGACCA CGGT GT TTC GTCCTTTCCACAA-5′(SEQ ID NO：6)[23]从人HT-1080基因组DNA得 到的PCR产物亚克隆入pCRII载体(Invitrogen)，以制备pCRII-U6 pol III表达质粒。将由退火的寡核苷酸(编码HCV IRES shRNA)组成的盒 连入Bbs1/BamH1消化的pCRII-U6质粒中。该表达的shRNA包含便于 细胞质定位[21，22]的miR-23小RNA环结构。通过测序确认最终的pCRII-U6 构建体。所用的引物对为：pHCVa-wt 5′-ACCGGAGCACGAATCC TAAACCTCAAAGACTTCCTGTCATCTTTGAGGTTTAGGATTCGTG CTCTTTTTTG-3′(SEQ ID NO：7)和5′-GATCCAAAAAAGAGCA CGAATCCTAAACCTCAAAGATGACAGGAAGTCTTTGAGGTTTAG GATTCGTGCTC-3′(SEQ ID NO：8)。如图1B和以上所述，用在下划 线标出的残基处(参见上面)包含适当序列改变的寡核苷酸产生 pCRII-U6/HCVa-mut(双突变体)、HCV snp1(5′侧的单个改变)和HCV snp2(3′端的单个改变)。按照类似方式，用寡核苷酸 5′-ACCGGGCGGTGCCTATGTCTCAGCCTCTTCTCACTTCCTGTCA TGAGAAGAGGCTGAGACATAGGCACCGCCTTTTTT-3′(SEQ ID NO：9)以及3′-GATCAAAAAAGGCGGTGCCTATGTCTCAG CCTCTTCTCATGACAGGAAGTGAGAAGAGGCTGAGACATAGGCA CCGCC-5′(SEQ ID NO：10)来制备对照pCRII-U6/229。
T7转录反应
95℃下在RNA聚合酶缓冲液中温育寡核苷酸对两分钟(例如，60μl 5X 转录缓冲液(Promega)中每种100μM寡核苷酸各120μl)，并经1小时 缓慢冷却(退火)至低于40℃。用AmpliScribeTM T7 Flash转录试剂盒 (Epicentre Technologies)在42℃下从5μM生成的退火双链DNA模板转 录ShRNA 4小时，然后在凝胶过滤旋转柱(MicrospinTM G-50，Amersham Biosciences)上纯化，所述的凝胶过滤旋转柱已用磷酸盐缓冲盐水(PBS) 彻底清洗3遍以除去防腐剂。
SiRNA
通过退火化学合成的(Dharmacon)RNA的互补链来制备siRNA，所 述互补链各包含适当的识别序列加上3’末端的(突出的)UU延伸。
转染和报道基因试验
在补充2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的具有10％胎牛血清 (HyClone)的DMEM(Biowhittaker)中，维持人293FT(Invitrogen) 和Huh7细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，马纳萨斯，弗吉尼 亚)。转染前一天，按照1.7×105细胞/孔，在24孔板中接种细胞，导致在 转染时大约80％细胞汇合。按照制造商的说明书，用LipofectamineTM 2000 (Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚)转染细胞。就抑制实验而言，用 40ng的pCDNA3/HCV IRES双萤光素酶(海肾和萤火虫)报道基因构建 体、50ng的pSEAP2对照质粒(BD Biosciences Clontech，作为转染对照) 和所示量的T7产生的shRNA(典型的量1pmole)或pCRII-U6 shRNA表 达构建体(710ng)共同转染293FT或Huh7细胞(一式三份)。将补偿 性pUC18质粒加入转染混合物，以达到每个转染800ng总核酸的最终浓度。 48小时后，取出上清液，在65℃下加热15-30分钟，并将5-10μl上清液加 入150μl对硝基苯基磷酸酯液体底物系统(pNPP，Sigma)中。室温温育 30-60分钟之后，在Molecular Devices Thermomax微板读取器上读取样品 (405nm)，并用SOFTmax软件(Molecular Devices)定量。裂解剩下 的细胞，并用双萤光素酶报道基因测定系统(Promega)和MicroLumat LB 96P光度计(Berthold)测定萤光素酶的活性。
小鼠
从斯坦福大学动物研究所得到6周龄的雌性Balb/c小鼠。根据动物保 护的NIH原则和斯坦福大学的原则来处理动物。
小鼠流体动力学注射以及体内成像
根据McCaffrey和同事所述，但其中包括省去RNasin[24]的小改变， 进行流体动力学尾部静脉注射。用大约五秒，将总量1.8ml的包含抑制剂 (RNA或质粒)、10μg pHCV dual Luc质粒和2μg pSEAP2对照质粒(BD Biosciences Clontech，包含SV40早期启动子)的磷酸盐缓冲盐水稳定地 注射入小鼠尾部静脉(N＝每组4-6只动物)。在所示的时间处，腹膜内注 射100μl的30mg/ml萤光素。注射后10分钟，使用IVIS7成像系统(Xenogen 公司，阿拉米达，加利福尼亚)分析活的麻醉的小鼠，且使用Livinglmage 软件(Xenogen)对得到的光发射数据进行定量。以每分钟相对的检测到 的光报告原始数值，并且显示了每组(N＝4-5只动物)的平均值的标准误。
分泌性碱性磷酸酶(SEAP)试验
在第5天，通过眼睛的眼眶后静脉对小鼠取血。用微量离心机从血细 胞中分离血清，在65℃下加热30分钟来失活内源的碱性磷酸酶，将5-10μl 血清加入150μl pNPP液体底物系统(参见上面)中。在室温下温育30-60 分钟后，如上所述读取样品(405nm)并定量。
实施例2：人类组织培养细胞中HCV IRES-介导的基因表达的shRNA抑制
在本研究中，测试按实施例1设计并构建的靶向丙型肝炎IRES保守 区的短干扰RNA(shRNA和siRNA)在人类组织培养细胞中抑制HCV IRES-介导的报道基因表达的能力。
图1A显示HCV IRES靶位点(A图)以及自从包含T7启动子序列和 HCV IRES靶的杂交寡核苷酸制备的模板经由T7转录得到的HCV shRNA (图1B)。下划线标出的残基是为产生突变HCV shRNA而进行改变的残 基。该shRNA包含此前被提示可以有利于细胞质定位的mir-23小RNA 环结构[21，22]和25个碱基对的RNA茎以及在5′(2个鸟嘌呤)和3′(2 个尿苷)末端的2个核苷酸(其也可通过非Watson-Crick G:U碱基配对来 杂交)。就载体运送的shRNA而言，将重叠的寡核苷酸亚克隆入poIII表 达载体(pCRII-U6，参见实施例1)中。
将靶向HCV IRES结构域IV中的附近位点的其它3种shRNA也设计 成具有相同茎长和环序列(图1C)。根据生化足迹研究，HCVb-wt shRNA 靶向高度结构化的区域(用作阴性对照，以比较效力)，而HCVc-wt和 HCVd-wt shRNA靶向更“易接近”的区域(图1D；Brown等人，Nucleic Acids Res.，1992，20：5041-5)。类似于HCVa-wt shRNA，将所有RNA 由包含T7启动子的dsDNA模板进行体外转录。
为了测定HCV shRNA抑制HCV IRES介导的基因表达的有效性，将 人293FT或肝细胞Huh7细胞用pCDNA3/HCV IRES双萤光素酶表达质 粒、分泌型碱性磷酸酶表达质粒(pSEAP2，控制转染效率)以及体外合 成的shRNA或备选地包含相应shRNA盒的pol III表达载体共转染。
如图1F所示，靶向AUG翻译起始位点紧下游的IRES区域(分别为 344-368位和350-374位)的HCVa-wt与HCVd-wt shRNA，均强烈地抑 制人293FT细胞中HCV IRES介导的fLuc表达。正如预期的一样， HCVc-wt(靶向318-342)显示出中度抑制作用，而HCVb-wt(299-323) 显示出即使有也是非常低的活性。因此，初步筛选揭示出有效的shRNA， 即HCVa-wt，其被选出用于进一步的详细研究。
在293FT细胞中shRNA对HCV IRES-介导的基因表达的抑制的特异性和 效力
为了进一步测定对HCV-IRES驱动的基因表达的抑制，用双萤光素酶 报道基因和SEAP表达质粒以及1pmol体外转录的shRNA共转染293FT 细胞。靶质粒为pCDNA3/HCV IRES双萤光素酶报道基因(HCV IRES， 如图1E所示)。将pUC18质粒加入转染混合物，以使每孔(24孔组织培 养板)每次转染的最终总核酸浓度达到800ng。48小时后，取出上清液用 于SEAP分析，然后裂解细胞并按照实施例1所述测定萤火虫和海肾(未 显示)萤光素酶活性。将萤火虫萤光素酶和SEAP活性按100进行标准化。 结果如图2A所示。
靶向AUG翻译起始位点紧下游的IRES区域的HCVa-wt shRNA强烈 抑制了人293FT(图2)和肝细胞Huh7(图3B)细胞系两者中HCV IRES 介导的fLuc表达。使用在RNA发夹的配对中有两个改变的突变shRNA (HCVa-mut)(对于错配位置，参见图1B)或无关的TNF(229)shRNA 都观察到几乎没有或完全没有抑制作用。229TNF shRNA对抑制TNF表 达非常有效(Seyhan等人，RNA，2005，11：837-846)，表明RNAi元 件可以有效利用此shRNA。发夹区的单一核苷酸变化，不论是在上游或下 游的位点(分别是SNP1和SNP2；参见图2C)，都有部分效果。
当将HCV shRNA靶向类似的双萤光素酶构建体(其中HCV IRES被 脑心肌炎病毒(EMCV)IRES替代)时，观察到几乎没有或完全没有抑 制(图2B和3B)。因此，图2B的数据说明HCVa-wt shRNA不抑制缺 乏HCV IRES的类似靶。在这个实验里，除了用pCDNA3/EMCV双萤光 素酶报道基因(EMCV IRES)代替pCDNA3/HCV作为靶以外，其余按照 图2A转染细胞。在图2B中用按100进行标准化的SEAP活性除萤光素酶 活性所得的值表示这些数据。
为了验证shRNA通过降解其靶mRNA起作用，进行Northern印迹分 析(图2F)。从未以抑制剂或以HCVa-wt、HCVmutl/2或229shRNA转 染的细胞中分离出总RNA，通过凝胶电泳分离等量的这些RNA。将分离 的RNA转至膜上并与特异于fLuc、SEAP和延伸因子1A(EF1A)的放 射性标记的cDNA探针杂交。在用磷屏成像仪(phosphorimager)定量之 后，HCVa-wt shRNA(道3)特异性抑制fLuc mRNA积累(当基于SEAP 与EF1A mRNA水平进行校正后，与229shRNA(道2)相比63％抑制； 对于HCVa-mut1/2而言未观察到抑制作用)(比较道3和道4)。这些数 据表明shRNA降解靶mRNA。
剂量反应实验表明HCVa-wt shRNA在293FT细胞中以0.3nM(96％ 抑制，参见图2D)并且在Huh7细胞中以0.1nM(75％抑制，参见图3A) 有效抑制了HCV IRES依赖性的基因表达。
为了进一步研究局部序列对效力的影响，测定了靶向HCVa的31个 碱基对位点(344-374；图4A)中所有可能位点的7个体外转录的19bp shRNA和相应的合成19碱基对siRNA的抑制活性。还测定了对应于 HCVa-wt shRNA的、25个碱基对的人工合成的siRNA。它们都表现出高 水平的活性(图4B)。最有效力的是HCVa的siRNA和shRNA以及 siRNA#3(其在1nM(＞90％抑制，图4B)以及0.1nM(大约90％抑制， 图4C)有效)。因此，设计以靶向HCV IRES上的344-374区域的19-25 个碱基对的shRNA和siRNA是有效的，具有一些局部差异。
实施例3：小鼠模型系统中HCV IRES介导的基因表达的shRNA抑制
将HCV shRNA和HCV shRNA表达质粒抑制靶基因表达的能力，通 过使用流体动力学注射将这些核酸运送到小鼠肝脏的方式，而延伸到小鼠 模型系统。图5显示了将包含pHCV dual Luc、pSEAP2和shRNA(基于 shRNA或表达shRNA的pol III表达载体的质量，10倍过量于靶)的大 体积PBS(1.8ml)注射到小鼠尾部静脉(n＝4-5只小鼠)的结果。在如图 5B所示的时间点处，腹膜内注射萤光素并用高灵敏性、冷却的CCD相机 给小鼠拍照。(图5A显示84小时时间点上从每组(每组4-5只小鼠)中 选出的代表性小鼠)。在所有测试的时间点上，HCV shRNA都强抑制了 萤光素酶表达，与注射ρUC18而非shRNA抑制剂的小鼠相比，具有从98％ (84小时时间点)到94％(48小时时间点)的抑制。突变(mut)或对照 (229)shRNA几乎没有或根本没有作用。应该注意萤光素酶活性随着时 间降低，这可能是由于DNA的丢失或启动子沉默[8]所致的，并且数据在每 个时间点上均进行了标准化(参见上述图5的描述)。
图6显示HCVa-wt shRNA抑制活性与之前已证实可以有效靶向此相 同位点的磷酰二胺吗啉寡聚物[8]的比较。HCVa-wt shRNA与吗啉寡聚物 两者在测试的所有时间点上都有效阻断萤光素酶的表达。显示了48小时时 间点的数据，其中分别对应于HCVa-wt shRNA和吗啉化合物抑制剂，抑 制作用为99.95％与99.88％。
实施例4：使用shRNA对塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus，SFV)的抑制
已将SFV用作毒力更强的正链RNA病毒的模型系统。为了测定RNAi 对SFV生长的抑制作用，产生靶向4个SFV基因(nsp-1、nsp-2与nsp-4 与衣壳)的shRNA和1个nsp-4位点的错配对照，并由U6启动子表达出 来。测定其抑制SFV-A7-EGFP增殖的能力，所述SFV-A7EGFP为一种 表达eGFP报道基因的高度复制的SFV菌株SFV-A7[49]。显示出利用靶向 nsp-1(图7)时SFV-GFP复制被适度减少(大约35％)，但靶向nsp-2、 nsp-4或衣壳编码区的shRNA及错配siRNA无此作用(未显示)。
此前已经证明对辛德毕斯(Sindbis)病毒有效的衣壳编码区内的位点 [50]对SFV无效。此位点上辛德毕斯(Sindbis)-SFV序列的同源性仅为77％。 SFV是生长非常迅速的病毒，在其感染周期中产生多达200,000个细胞 质RNA。为了观察是否能在缓慢生长的病毒的情况下更好地保护细胞，在 两个单独实验中，测试这些SiRNA对SFV-GFP的复制-缺陷菌株的作用。 图8显示靶向此SFV菌株的U6表达的shRNA在不超过5天的时间中可 减少病毒表达≥70％。靶向非结构基因nsp-1、nsp-2与nsp-4的siRNA以 及相对于nsp-4而言带有1个错配的siRNA显示出了该作用，但靶向衣壳 基因(其在此缺陷病毒中是缺乏的)的SiRNA或其它对照未显示出该作用 (图8)。注意shRNA所靶向的序列的长度是29个核苷酸，且nsp-4错 配shRNA中所用的单个错配对RNAi的作用明显地不具有破坏性。在不同 shRNA的效力上的广泛差异强调了当处理快速复制和高突变性病毒(例如 SFV)时，文库方法在寻找最佳的siRNA与shRNA中的重要性。
实施剂量-反应实验来检测Huh7细胞中由HCVa-wt shRNA和 HCVa-mut shRNA以及非特异性对照shRNA(229)引起的HCV复制子 系统的抑制。在稳定复制HCV RNA-的细胞系中测定受试化合物的抗病毒 活性，所述HCV RNA-复制细胞系为通过转染人成肝细胞瘤 (hepatoblastoma)细胞系Huh7衍生的AVA5(Blight等人，Science，2000， 290：1972)。用DsRed表达质粒与基于RNA的抑制剂共转染大约80％汇 合的培养物。用斑点印迹杂交测定转染后48小时HCV RNA的水平。在 一式三份的培养物中进行测定。将总共4-6个未经处理的对照培养物，和 用10、3和1IU/mlα-干扰素(无细胞毒性的抗病毒活性)，以及用100、 10和1uM三氮唑核苷(无抗病毒活性和细胞毒性)处理的一式3份培养 物作为阳性抗病毒和毒性的对照物。用荧光显微术(DsRed表达)估计转 染的效率。按照未经处理的培养物(总共6个)中检测到的RNA的平均 水平的百分比，来确定一式三份处理的培养物中HCV和b-肌动蛋白RNA 两者的水平。β-肌动蛋白RNA的水平既用作毒性的量度，又用来在每个样 品中标准化细胞RNA的量。30％或更低的HCV RNA水平(相对于对照 培养物)被认为具有阳性抗病毒作用，50％或更低的b-肌动蛋白RNA水 平(相对于对照培养物)被认为具有细胞毒性作用。用建立的中性红染料 摄取试验(Korba，B.E.和J.L.Gerin(1992)用标准化的细胞培养物试验 来测定核苷类似物抗乙型肝炎病毒复制的活性(Antivir.Res.19：55-70)。) 测定细胞毒性。
HCVa-wt shRNA与HCVa-mut shRNA以及不相关的对照shRNA (229)在Huh7细胞中对HCV复制子系统的抑制；剂量反应。在稳定复 制HCV RNA-细胞系中测定测试复合物的抗病毒活性，所述HCV RNA- 复制细胞系为由人类肝胚细胞瘤细胞系Huh7转染衍生的AVA5(Blight 等人，Science，2000，290：1972)。用DsRed表达质粒共转染基于RNA 的抑制剂，形成80％融合的培养物，并用斑点印迹杂交测定转染后48小 时HCV RNA的水平。在一式三份的培养物中进行测定。将总共4-6个未 经处理的对照培养物，和用10、3和1IU/mlα-干扰素(无细胞毒性的抗病 毒活性)处理的3份培养物，以及100、10和1uM利巴韦林(无抗病毒活 性和细胞毒素)作为阳性抗病毒和毒性的对照物。用荧光显微术(DsRed 表达)测定转染的效率。按照未经处理的培养物(总共6个)中测定的RNA 的平均水平的百分比，来确定三份处理的培养物中HCV和β-肌动蛋白 RNA两者的水平。β-肌动蛋白RNA的水平既用作毒性的尺度，又用来在 每个样品中标准化细胞RNA的量。30％或更低的HCV RNA的水平(相 对于对照培养物)被认为具有正的抗病毒作用，50％或更低的b-肌动蛋白 RNA的水平(相对于对照培养物)被认为具有细胞毒素作用。用建立的中 性红色染料吸收试验(Antivir.Res.19：55-70)测定细胞毒性。用标准化的 细胞培养物试验来测定核苷类似物抗乙型肝炎病毒复制的活性(Korba等 人，1992，上述)。
实施例5：对抑制组织培养细胞中HCV IRES依赖性基因表达的shRNA的鉴定
研究体外转录的小发夹RNA(shRNA)抑制培养细胞中丙型肝炎病毒 内部核糖体进入位点(HCV IRES)依赖性基因表达的能力。如上所述， 发现靶向靠近AUG转录起始位点的HCV IRES 3′端的25个碱基对的 shRNA HCVa-wt(表2)可以有效破坏HCV的表达。为了测定共转染的 shRNA构建体干扰IRES功能的能力，使用报道基因构建体(pHCV双萤 光素酶质粒)，其中萤火虫萤光素酶(fLuc)的表达依赖于HCV IRES(图 1；Wang等人，MoL Ther.，2005，12：562-568)。在这些实验中，培养 293FT细胞，并用报道基因构建体和HCVa-wt或其它受试序列之一按照 Wang等人，2005，上引文所述实施转染。
发现在1nM浓度下，HCVa-wt导致293FT细胞中HCV IRES-依赖性 萤光素酶表达受到90％抑制(Wang等人，2005，同上引文)。在随后的 实验中，设计并测试了另外26个靶向HCV IRES的不同区域的shRNA(图 10、图16A-B)；26个中的3个为上文所述的副本(HCVb、HCVc、 HCVd-wt)；23个为新序列，以鉴定HCV的其它抑制剂。目标是要鉴定 可用于与HCVa-wt联合的shRNA，使得病毒更难于通过突变HCVa-wt 靶位点而产生抗性，或鉴定可用作HCVa-wt的替代物的shRNA。选择要 测试的shRNA以避免在不同HCV基因型之间存在变化的区域。使用例如 在jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/可获得的算法挑选了一些受试序列，并且 排除意在靶向HCV-IRES序列但由于其CG含量及其它特征而导致不被多 数算法所推荐的其它受试序列，例如GC丰富的或高度结构化的区域。使 用T7RNA聚合酶由dsDNA模板体外转录产生shRNA，并且为了促进转 录效率，shRNA从序列5′-pppGGG开始。该5′序列形成两个到三个核苷 酸的突出端，确切长度取决于靶位点在其5′末端是否包含一个或多个鸟苷 残基(参见图16A-B)。如果与靶序列相配的RNA有义链的最后一个核 苷酸是‘G’，则只必须再加入两个G以便有效转录，并且这些G在shRNA 5′端上为单链，不与靶互补。如果与靶相配的shRNA有义链的最后一个核 苷酸不是G，那么为了在试验系统中有效转录，需要加入不与靶互补的三 个G。所有在本组实验中测试的shRNA都具有长21-25个碱基对的双链体 茎和如针对HCVa-wt所述的小RNA-23的10个核苷酸的环。
按照Wang，2005所述来测定所有的shRNA(总共27个，包括 HCVa-wt)的活性。简要地说，用pHCV双萤光素酶报道基因表达质粒 (Promega，Madison，WI)和用于控制转染效率和可能的脱靶效应 (off-target effect)的分泌型碱性磷酸酶表达质粒(pSEAP2，Clontech， Mountain View，CA)以及shRNA，共转染人293FT细胞。结果如图10 所示。SEAP水平在所有样品中是一致的，表明在1nM到5nM的shRNA 浓度下可以实现有效转染且无非特异性抑制或毒性作用。大多数的shRNA 仅仅表现中等活性(1nM下小于60％抑制)。不遵循任何特定理论，该作 用可能是由于IRES上的靶区域的高度结构化所致。例外情况是HCVd-wt、 sh37、sh39、hcvl7，其靶向靠近HCVa-wt位点的IRES位置。这些shRNA 在1nM浓度下导致HCV IRES依赖性基因表达受到85-90％抑制。选择 1nM的低shRNA浓度以允许容易地鉴定到具有超高功能性的shRNA。如 果在10nM shRNA下进行筛选，则更多shRNA将表现出高活性；然而， 在一些情况下在该浓度下观察到显著的非特异性抑制。因此，本筛选揭示 了44个核苷酸的区域(HCV IRES上的331-374位)，其中5个重叠的 shRNA显示出高活性。
实施例6：单碱基错配对于shRNA活性的影响
期望的是用于HCV的疗法可以有效地抵抗突变的HCV。为了确定本 文所述的RNA在这方面的性能(例如，靶向HCV IRES的shRNA)，以 及为了阐明脱靶效应是否构成问题，测试指向HCV IRES的所选shRNA 对靶序列中的点突变的敏感性。就这些实验而言，用QuikChangeII定 点诱变试剂盒(Stratagene，拉荷亚，加利福尼亚)将C340→U突变引入 HCV IRES中。所测试的27种shRNA中，九个靶向突变区(图11)，因 此其活性理论上会受到这种突变的影响。用pHCV的突变形式分析了所有 这些shRNA，并将靶向其它位点的所选shRNA用作对照。就所有受试的 shRNA而言，都发现与原来完全匹配的靶相比，活性未受影响或稍微降低 (图10)。
然而，在复制子系统中，惊奇地发现shRNA是SNP-敏感的(见下文)。
实施例7：靶位点的精细作图
设计六个短的19个碱基对的shRNA来靶向靠近HCV IRES 3′端的44 个核苷酸的位点：3个靶向核苷酸331-353，3个靶向核苷酸354-374。这 些分子包含10个核苷酸的环和5′-GG以及3′-UU突出端。进行筛选以鉴 定在这些受试序列中最有效抑制HCV表达的非重叠候选物。所有6个受 试的shRNA都能在测试系统中抑制活性。六个shRNA中的三个(sh52、 sh53和sh54)被确认为是最有效的(图12)。这并不排除在组合物中使 用效力较低的那些shRNA，如用于治疗HCV，例如作为包括超过一种 shRNA和/或siRNA的组合物的一部分。
实施例8：shRNA设计：茎长、环长和序列以及3′端的影响
进行附加实验以测试shRNA设计如何影响基因沉默活性。HCVa-wt 包含具有25个碱基对的茎和5′-GG和3′-UU突出端(其可形成非标准碱 基对)及10个核苷酸的miR-23环。为了测试在抑制表达的有效性上这些 参数的重要性，分别改变每项参数(图13A)。最初挑选小RNA-23环序 列是因为它是自然存在的序列(Lagos-Quintana等人，Science，2001， 293：854-258)并因此不大可能有毒性。测试了2个备选的10个核苷酸的 环、以及6个核苷酸、5个核苷酸和4个核苷酸的环(每种有两个序列版 本)。发现环大小和序列都不影响这些25个碱基对的shRNA的活性(图 13B；参见图16A-B的序列)。
缺少3′-UU末端序列(单链突出端)的小发夹RNA与包含该特征的 亲代shRNA具有相同的效力。具有全长(25个核苷酸)的有义链但短(13 个核苷酸)的反义区的对照shRNA不具有活性，证实靶向序列中的双链 体结构的重要性。具有3′-CC而非3′-UU末端的shRNA(允许形成2个附 加的Watson-Crick碱基对)与HCVa-wt相比在降低HCV表达方面更有 效，但也影响了SEAP的水平。该非特异性抑制可能是由更长的茎(27个 碱基对)所致的结果，该较长茎可能诱导干扰素反应途径的基因和活化蛋 白激酶R(PKR)。令人惊讶的是，将该环移动到shRNA的另一端，产 生了活性的剧烈下降(1nM下为15％而非90％抑制)。对该效应的可能 解释包括Dicer加工位置(以及由此所靶向的序列)的移动以及5′-末端处 的不同GC含量。
因为证实19个碱基对的shRNA显示出与25个碱基对的shRNA有类 似的效力，所以测定19个碱基对的shRNA的环变异的作用。结果如图14 所示；序列参见图16A-B。测试了10、6、5和4个核苷酸的环大小，每种 有两个序列版本。包含所有这些环大小的序列都显示出抑制基因表达的能 力。然而，与25个碱基对shRNA的结果相比，环大小的减少(尤其是低 于5个核苷酸)导致19个碱基对shRNA在两种受试环序列下均有降低的 活性。具有至少5-6个核苷酸的环表现出最大活性。
3′-UU的去除也导致19个碱基对以及20个碱基对(但并非25个碱基 对)的shRNA活性的剧烈下降。不遵照任何特定理论，3′-UU和5′-GG可 形成非标准碱基对，并且shRNA双链体的总长度是重要的，因为为了有 效加工，双链体不能小于21个碱基对。因此，就25个碱基对的shRNA 而言，环长度或3′-UU的存在都是无关紧要的，但是这些参数对短的(例 如19个碱基对的)shRNA的效力却是重要的。不遵照任何特定理论，可 能是在加工之前Dicer结合于末端并且如果是较长shRNA的话将不会“感 觉到”环，但在19个碱基对的shRNA的情况下，当Dicer从末端“测量”19-21 个核苷酸时将会“感觉到”环。
因此，发现19个碱基对的shRNA可如25个碱基对的shRNA和19 个碱基对的siRNA一样有效力。还发现一些shRNA分子在0.1-1nM的低 浓度下具有活性(“超强效shRNA”。其它组典型地使用10-25-50-100nM siRNA)。
这些数据证明不包括3′-UU并且有至少22个碱基对(例如23个碱基 对、24个碱基对或25个碱基对)的序列可适用于抑制HCV的表达。类似 地，环的大小对至少22个碱基对长度的shRNA而言并非关键的。
实施例9：HCV复制子系统
将一些shRNA和siRNA抑制剂以及阴性对照用于转染稳定表达HCV 亚基因组复制子(Blight等人，Science，2000，290：5498)的人类肝细胞 (AVA5，Huh7细胞系的衍生物)，且确定HCV的表达量。测试各种浓 度，并确定导致50％抑制(IC50或EC50)的RNA浓度。从两个独立实 验得到的IC50并列显示于图15中。结果与在293FT细胞中用fLuc/IRES 系统获得的数据一般相关，具有下列差异：(1)19个碱基对的shRNA在 复制子系统中比19个碱基对的siRNA更有效力，而在报道基因系统中， 19个碱基对的siRNA比shRNA更有效力；(2)具有点突变的shRNA HCVa-wt在复制子系统中并未表现出活性，而其在fLuc/IRES报道基因系 统中是有效的；(3)一般而言，25个碱基对的siRNA与25个碱基对的 shRNA与测试的其它19个碱甚对的shRNA和siRNA相比具有较小的活 性。一般而言，IRES与复制子系统可用于鉴定候选序列。可用本文所述的 方法和本领域中已知的方法进一步测试用于确认所选shRNA或siRNA的 效力(例如，抑制对象中的HCV表达)的方法。
其它的具体实施方式
应当理解，尽管本发明已通过详述进行了描述，但上述描述用来举例 说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由后附权利要求的范围限定。 其它方面、优点和修改都在下列权利要求的范围之内。
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机译： RNA干扰介导的乙型肝炎病毒（HBV）基因表达的抑制作用使用小干扰核酸（新浪）
机译： RNA干扰介导使用小干扰核酸（SINAS）的乙型肝炎病毒（HBV）基因表达的抑制
机译： RNA干扰介导使用小干扰核酸（SINAS）的乙型肝炎病毒（HBV）基因表达的抑制
