小干扰RNA对丙型肝炎病毒核心蛋白基因表达的抑制作用

摘要

丙型肝炎病毒(HCV)属黄病毒属，是导致慢性肝炎及肝硬化的主要因素。HCV基因组是9.6kb的单正链RNA，包含一个位于5’和3’非编码区之间的阅读框ORF，ORF编码全长3,008-3,037个氨基酸的前体蛋白，通过细胞及病毒的蛋白酶切割产生结构蛋白和非结构蛋白，经翻译后修饰产生至少十种不同的蛋白：核心蛋白、E1、E2、p7、非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。大多数慢性感染病人通过干扰素和利巴韦林联合治疗。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指外源双链RNA(dsRNA)被RNaseⅢ家族中的Dicer酶切割为21-23个核苷酸(nucleotide，nt)的小干扰RNA(smallinterferingRNAs，siRNAs)，每个siRNA两条单链末端为5’一磷酸和3’-羟基，且3’端都有2-3个突出的非配对碱基，与胞内一核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RSC)，RISC激活后通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，进行切割mRNA，导致相应的基因沉默，属于转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)，它是1998年Fire在研究反义核苷酸时发现的。RNA干扰现象广泛存在于植物、线虫、果蝇等生物中，但在哺乳动物细胞中，长双链RNA(＞30bp)会引起干扰素效应，促使细胞凋亡；而＜30bp的siRNA转染哺乳动物细胞后，既能引起RNAi，又可避免干扰素效应。因此，通过引入靶mRNA序列特异的siRNA沉默基因的表达，不仅可以研究该基因的功能和复杂的信号传导途径，还可以对癌症，神经系统性疾病，感染性疾病等人类疾病进行基因治疗性研究。作为一种抑制基因表达的新技术，本研究中，我们针对HCV核心蛋白设计并用T7RiboMAXTM表达系统体外转录合成了五段C基因特异的siRNA，并选用EGFP-siRNA和无关siRNA(scramblesiRNA)分别作为阳性和阴性对照，结果筛选并证明了两段siRNA能有效且特异地抑制核心蛋白的表达。 一、HCVcore基因在HEK293T细胞中的表达选人胚肾293T(HEK293T)细胞为宿主细胞，EGFP基因为报告基因，将构建的HCVcore表达质粒pEGFP-C转染HEK293T细胞，48小时后，用荧光显微镜观察转染细胞中的绿色荧光数量和荧光强度，pEGFP-C转染的细胞中可见大量绿色荧光，利用HCVcore单克隆抗体检测核心蛋白的表达，Westernblotting结果显示，pEGFP-C转染的细胞中C-EGFP(47kd)融合蛋白表达较少，而非融合的核心蛋白(2lkd)却有较强的表达。推测其原因可能是真核细胞内有许多蛋白酶，将所表达蛋白在某些敏感的酶切位点进行了切割，使融合蛋白在表达后被切割成EGFP和core两种蛋白，具体原因有待于进一步研究。 二、小干扰RNA抑制HCV核心蛋白的表达采用T7体外转录法合成siRNA，首先合成七段siRNAs(C-siRNA1、C-siRNA2、C-siRNA3、C-siRNA4、C-siRNA5、阴性对照scramblesiRNA和阳性对照EGFP-siRNA)的正、反义链DNA模板以及T7启动子引物模板，用T7RNA聚合5-酶分别转录正、反义链siRNA，然后退火形成双链，用单链特异的S1核酶和无RNA酶的DNase1分别消化dsRNA的5’端突出序列和残留的DNA模板，得到长21nt的双链siRNA。然后将这七段siRNA与pEGFP-C共转染HEK293T细胞。48小时后，在荧光显微镜下观察绿色荧光，初步筛选出两段有效的siRNA(C-siRNA2和C-siRNA2)，以未转染的HEK293T细胞作空白对照，用流式细胞仪检测各实验组中发绿色荧光的细胞数及平均荧光强度，并用CellQuest软件进行定量分析；提取细胞总RNA，逆转录后用HCVcore和GAPDH基因特异的引物进行半定量RT-PCR和实时定量PCR(Real-timePCR)；Westernblotting检测核心蛋白的表达。结果显示，与单独转染质粒pEGFP-C组(其荧光细胞百分数为43.35％，平均荧光强度为110.68)相比，共转染scramblesiRNA组绿色荧光细胞的百分数及平均荧光强度均无明显下降，而共转染EGFP-siRNA组下降了3.9倍和2.5倍，C-siRNA1组下降3.5倍和1.8倍，C-siRNA2组下降2.9倍和3.2倍；与未转染siRNA组相比，共转染EGFP-siRNA或C-siRNA组core基因mRNA水平均明显降低，其中共转染EGFP-siRNA组下降了约15倍，C-siRNA1及C-siRNA2组分别下降了约13倍和9倍，而阴性对照组core基因转录水平无明显抑制，但各实验组看家基因GAPDH的转录水平均未受任何影响。单独转染pEGFP-C的细胞在转染后48h可见到核心蛋白呈高水平表达，阴性对照组核心蛋白的表达水平与之相似，但共转染EGFP-siRNA和C-siRNA1及C-siRNA2组的核心蛋白表达水平均明显降低，只见很弱的蛋白表达条带，但各组看家基因GAPDH的蛋白表达均不受影响。这些结果说明siRNAs通过下调靶基因的转录水平，从而有效且特异的抑制了靶蛋白的表达。 将空载体pEGFP-N1和pEGFP-C分别转染HEK293T细胞，利用Westernblotting检测MAPK/ERK的活化形式磷酸化水平即核心蛋白的激活功能，结果显示空载体对此分子没有作用，而转染核心蛋白表达载体的细胞内MAPK/ERK的磷酸化水平却有显著提高，说明运用瞬时表达的方法可以检测到核心蛋白对MAPK/ERK的激活作用。然后将RNAi与信号转导结合起来，检测RNAi前后MAPK/ERK的磷酸化水平的变化。将筛选的两段有效的siRNA干扰细胞中核心蛋白基因的表达后，再次检测MAPK/ERK的磷酸化水平，结果显示RNAi后核心蛋白对MAPK/ERK产生的激活作用明显降低。 小结：1、本实验以EGFP基因为报告基因，构建真核表达质粒pEGFP-C并转染HEK293T细胞使之表达，蛋白免疫印迹实验结果显示，转染的细胞中核心蛋白有较高水平表达，为后续的RNA干扰实验奠定了基础。 2、本实验针对HCVcore蛋白基因设计并用T7RiboMAXTM表达系统体外转录合成了五段针对core基因的siRNA，与表达质粒pEGFP-C共转染HEK293T细胞，筛选出两段有高效抑制作用的siRNA，并同时利用EGFP-siRNA和scramblesiRNA作为阳性和阴性对照，结果证明这两段siRNA均能有效且特异地抑制核心蛋白的表达。利用Westernblotting检测了瞬时转染空载体pEGFP-N1和pEGFP-C的细胞中MAPK/ERK磷酸化水平，结果表明核心蛋白对MAPK/ERK的激活作用。利用核心蛋白表达的RNAi后，此激活作用明显降低，说明在MAPK/ERK的水平siRNA的有效性。

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英文缩略词表

摘要

前言

第一部分HCV核心蛋白表达质粒pEGFP-C的构建及其在HEK 293T细胞中的表达

第二部小干扰RNA对HCV核心蛋白基因表达的抑制

总结

参考文献

综述HCV研究的新突破：体外培养HCV颗粒的产生

致谢

附录：