公开/公告号CN101293002A
专利类型发明专利
公开/公告日2008-10-29
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申请/专利权人 上海现代中医药技术发展有限公司;
申请/专利号CN200710040135.0
申请日2007-04-27
分类号A61K36/068(20060101);A61P15/10(20060101);A61P11/00(20060101);A61P29/00(20060101);G01N30/02(20060101);G01N30/86(20060101);C12N1/14(20060101);
代理机构31233 上海泰能知识产权代理事务所;
代理人黄志达;谢文凯
地址 200051 上海市长宁区天山路600弄4号7F-C
入库时间 2023-12-17 20:58:06
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2011-08-10
授权
授权
2010-03-24
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-10-29
公开
公开
技术领域
本发明属虫草菌粉原料质量控制方法领域,特别是涉及一种扶正化瘀植物药中虫草菌粉原料指纹图谱质量控制方法。
背景技术
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体,是久享盛誉的名贵中药。它分布于中国的青海、西藏、四川等地,存在于中国西北和西南部海拔3000-4000m山区的多草的土壤中。露在土壤表面部分为真菌的子实体,长3-6cm,色黑,形如刀刃。埋在土中的虫体部分长2.5-4m,黄色至深棕色。因其形态随季节发独特变化,科季为虫形夏季呈草状,故在我国称之为“冬虫夏草”。冬虫夏草早在《本草从新》中已有记载,《本草纲目拾遗》中记载尤详。性味甘,平,归肺、肾经。补肺益肾,止血,化痰。用于久咳虚喘,劳嗽咯血,阳痿遗精,腰膝酸痛。
近年来,国内报道与虫草有关的菌种达10个属的30多种[17][18]。例如:
(1)冬虫夏草头孢菌(Cephalosporium sinensis)从青海产冬虫夏草中分离得到,属半知菌类,丛梗孢目,丛梗孢科,头孢霉族,头孢霉屑。(2)蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)从青海化隆县产冬虫夏草上分离得到,属半知菌类,丛梗孢目,丛梗孢科,曲霉族,瓶梗青霉属。(3)蝙蝠蛾被孢霉(Mortierella hepiali)从四川汶川产冬虫夏草上分离得到,属藻状菌纲,毛霉目,被孢霉科,被孢霉屑。(4)中国拟青霉(Paecilomyees sinensis)从四川康定产冬虫夏草上分离得到,属半知菌类,丛梗孢目,丛梗孢科,被孢霉屑。(5)其它还有虫草多毛孢(Hirsutella hepiti)、中国被毛孢(Hirsutella sinensis)、蝙蝠蛾柱霉(Scytalidium hepiale)、中国弯颈霉(Tolypocladium sinensis)、中国金孢霉(Chrysosporium sinensis)、葡萄穗霉属(Stachybotry)等
本发明生产的虫草菌粉即是蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)Cs-4菌株深层培养的发酵产物。本品为浅棕褐色的粉末;气香,味微味。Cs-4菌株从青海化隆县产冬虫夏草上分离得到,属半知菌类,丛梗孢目,丛梗孢科,曲霉族,瓶梗青霉属。
关于虫草菌粉的的制备,中国医学科院药物研究所杨云鹏、岳德超等最早对青海虫草分离的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)Cs-4菌株及其深层培养其进行了研究。中国中医研究院中药研究所,戴如琴等后来又对从云南天然虫草中分离出来的蝙蝠蛾拟青霉新种((Paecilomyces hepiali chen et Dai.sp.nov)进行了研究。
腺苷含量是评价冬虫夏草内在质量的主要指标,目前核苷类物质的分析方法有HPLC法、薄层色谱法、高效毛细管电泳法等。夏文娟等用HPLC法分析了13个产地冬虫夏草腺苷的含量,结果13个产地冬虫夏草的腺苷含量为142.5~396.6ug/g,其中藏草腺苷含量高于川草,在川草中,炉草腺苷含量高于滇草,灌草最低。Li等用高效毛细管电泳法测定天然和人工冬虫夏草中核苷成分的含量,结果显示人工虫草的核苷含量明显高于天然虫草;新采集的天然虫草中核苷类物质含量极低,而采集日久者核苷成分含量较高,因此腺苷在天然冬虫夏草质量控制中的具有应用价值。米莉莉等建立了对冬虫夏草一次进样使核苷类成分得到理想分离的HPLC定量分析方法。
关于虫草属真菌中核苷类化学成分的研究报道较多,主要集中在冬虫夏草、蛹虫草及其发酵菌丝体,至今已报道从冬虫夏草及发酵菌丝体中分离鉴定有11个核苷类化合物[13],而对冬虫夏草无性型菌株的发酵液中核苷类成分的研究则较少。丁婷等[12]用HPLC法对冬虫夏草及其无性型菌株发酵液中核苷类成分进行了定量分析。结果表明,中国被毛孢RCEF0273发酵液中含有3种核苷标样,分别为腺苷、尿苷、鸟苷,其含量均高于对照品冬虫夏草生药。
姜丽霞等[14]用HPLC对四种人工培养冬虫夏草发酵菌丝体中主要核苷及核酸碱基进行了测定,着重对其中的腺苷成分作了提取溶剂比较及回收率试验。
查阅国内文献,关于报道虫草中核苷类成分的分析很多,但是关于虫草指纹图谱的研究却很少。于超等用RAPD方法对康定虫夏、人工虫草及虫草发酵菌丝体进行指纹图谱的研究,为不同虫草的品质和药效差异提供了分子依据。陈畅等首次建立了蒙山九州虫草的标准红外光谱图,并与冬虫夏草的红外光谱进行了比较,发现两者存在高度的相似性,为蒙山九州虫草成为冬虫夏草的代用品提供了初步的理论依据。但是扶正化瘀植物药制剂中用高效液相色谱对虫草进行指纹图谱的分析报道却没有见到。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种扶正化瘀植物药制剂中虫草进行指纹图谱质量控制方法,该方法重复性好,能充分反映虫草菌丝粉核苷类成分的基本特性。
本发明的技术方案如下:
一种扶正化瘀植物药中虫草菌粉原料指纹图谱质量控制方法,包括下列步骤:
(1)提取虫草菌丝粉
称取0.100g虫草菌粉,加入25ml纯净水,超声提取20-60min,提取液用0.23-0.45um滤膜过滤,进样。
(2)梯度洗脱流动相
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,水和乙腈为流动相进行洗脱流动相,色谱柱为Ace水相柱;流动相A相为水,B相为乙腈;梯度洗脱:0-30min,0-7%B;流速0.8-1.2ml/min;检测波长210-280nm;柱温20-40℃;进样量5-10ul。
梯度洗脱条件为:
(3)标准指纹图谱的建立
通过对十个批次的虫草菌粉指纹图谱的研究,典型指纹图谱选择法,确立符合本发明质量控制需要的虫草菌粉HPLC标准指纹图谱(图1)。对合适样品的HPLC指纹图谱中所有峰进行比较,确定了5个共有峰,并按出峰时间先后次序进行编号(图1)。
在共有峰里选取了3个特征峰,分别为2号峰尿苷,3号峰鸟苷和4号峰腺苷,所有特征峰均经对照品对照定性和HPLC/MS鉴定。
根据LC-MS-MS的鉴定结果,虫草菌丝粉的高效液相色谱指纹图谱表达了核苷类组分的分布特性。选取含量较高的腺苷作为指标成分峰。
从十批样品的HPLC指纹图谱中按照以下原则选取一批虫草菌粉药材的指纹图谱作为对照指纹图谱。结合药效实验情况,优先考虑确定疗效的虫草菌丝粉的指纹图谱。将指纹图谱和定量测定结果进行对照比较,优先考虑含量在平均值附近的样品的指纹图谱。选取特征峰分离较好,峰的保留时间和峰高适宜、峰型(峰的形状和峰高比例)较典型的指纹图谱。优先选取基线平稳、信噪比好的指纹图谱。
(4)指纹图谱的质量控制
A.样品真伪的鉴别
以特征峰的相对保留值作为真伪鉴定指标,根据公式计算十批药材指纹图谱中各特征峰的相对保留时间RRT,结合两个实验室的验证结果,确定了各特征峰的相对保留时间和范围(如表1所示)。
表1虫草菌丝粉HPLC指纹图谱鉴别峰相对保留时间及范围
根据实验条件对待测样品进行测定,得出样品的HPLC色谱图,计算各特征峰的相对保留时间,并与所列对照指纹图谱和相对保留时间表进行比较。如有特征峰不存在,或相对保留时间(RRT)不能吻合,则可判别被测样品不是虫草菌丝粉。
B.样品质量评价
采用中药计算机辅助相似度评价软件,将样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(或对照品共有模式指纹图谱)进行比较。以4个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.9。
所述步骤2色谱柱为Ace水相柱(250*4.6mm,5um,ACT);线性梯度洗脱:0-30min,0-7%B;流速1.0ml/min;检测波长261nm;柱温30℃;进样量10ul。
所述步骤4在指纹图谱测定条件确定后,通过对至少三批样品进行测定,计算相关参数,并在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。腺苷对照品溶液(100μm/ml)的色谱峰面积重现性(RSD)不高于3%,保留时间重现性(RSD)不高于2%;色谱柱柱效以腺苷计算不少于15,000块理论塔板数。
表2两批虫草菌丝粉的指纹图谱数据
*RRT(相对保留时间)=特征峰的保留时间/指标峰的保留时间
*RPA(相对峰面积)=特征峰的峰面积/指标峰的峰面积
本发明的另一技术方案如下:
一种扶正化瘀植物药中虫草菌粉原料的制备方法,包括下列步骤:
6)在种子培养基上接种蝙蝠蛾拟青霉菌种,在28℃的有氧条件下培养2-5天;
7)在种子培养基上接种蝙蝠蛾拟青霉菌种,在28℃的有氧条件下培养2-5天;
8)重复步骤2)使能够得到足够量的菌种,以开始用发酵罐进行大规模的虫草发酵;
9)在发酵罐中用发酵培养基,转速150-250rpm;在28℃溶解氧浓度:20-90下培养2-5天,pH 6.2-6.8;
10)除去培养基,菌丝体干燥,得到产物虫草菌粉.
所述步骤1种子培养:取10mL一级种子到装有100mL二级种子培养基的500mL三角瓶内,转速:150rpm,pH 6.2-6.8;
所述步骤1或2或3的种子培养基为:葡萄糖2%、蛋白胨1%、硝酸铵0.5%、硫酸镁0.05%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸亚铁0.001%、氯化钠0.1%、麸皮5%;
所述步骤4发酵培养基为:葡萄糖2%、蛋白胨1%、硝酸铵0.5%、硫酸镁0.05%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸亚铁0.001%、氯化钠0.1%、5%蚕蛹粉5%;
所述步骤4发酵培养基,5%麸皮,5%蚕蛹粉,水煮30分钟,用4层纱布过滤取滤液。
本发明的有益效果如下:
1、考察了供试品溶液的稳定性,结果表明,4℃冰箱存放,24小时之内,虫草菌粉供试品溶液保持稳定。同时考察公司贮藏的样品在1年内的稳定性,发现相似度大于0.9。
2、将指纹图谱与药材虫草菌粉的制备方法结合起来,这样保证了指纹图谱的实施,并真正运用于虫草菌粉的质量控制。经过对十批虫草菌粉药材的指纹图谱相似度进行计算,发现相似度在0.9-1.0之间。说明建立的虫草菌粉指纹图谱质控方法,灵敏度高,重复性好,专属性强,操作简便,方法可靠,可以对虫草菌粉质量进行科学,有效的评价,并证实能够运用于实际生产中质量控制,满足鉴别和质量控制的需求。
3、通过将指纹图谱运用于生产中的质量控制,也有效地控制产品质量,指导产品的生产过程,同时验证了产品制备方法的稳定,保证扶正化瘀植物药原料质量的稳定,进而保证了药物的疗效。
附图说明
图1虫草菌粉的标准HPLC指纹图谱。
图2虫草菌丝粉的指纹图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
指纹图谱实验方法
1.试剂与药材
纯净水(水森活,可口可乐公司);乙腈(色谱纯,Tedia,美国);腺苷(中国药品生物制品鉴定所,供含量测定用,批号:879-200202);尿苷(中国药品生物制品鉴定所,供鉴别用,批号:887-200202);鸟苷(购自新乡拓新生化科技有限公司);虫草菌丝粉(本发明生产)。
2实验仪器
HP1100液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器,美国Agilent公司);超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司,KQ-50E);色谱柱恒温箱(天津市恒奥科技发展有限公司,HT-130);HPLC滤膜(江苏汉邦科技有限公司,0.45um)
3虫草菌丝粉的提取
称取约0.100g虫草菌粉,加入25ml纯净水,超声提取20min,提取液用0.45um滤膜过滤,进样。
4.HPLC分析条件
色谱柱为Ace水相柱(250*4.6mm,5um,ACT);流动相A相为水,B相为乙腈;线性梯度洗脱:0-30min,0-7%B;流速1.0ml/min;检测波长261nm;柱温30℃;进样量10ul。
5.实验结果
虫草菌粉样品特征峰的相对保留时间与相对峰面积见表2。
实施例2
取10mL一级种子到装有100mL二级种子培养基的500mL三角瓶内,转速:150rpm,pH6.2-6.8;在28℃的有氧条件下培养2-5天;使能够得到足够量的菌种,以开始用发酵罐进行大规模的虫草发酵;发酵罐中用发酵培养基,转速150-250rpm;在28℃溶解氧浓度:20-90下培养2-5天,pH 6.2-6.8;除去培养基,菌丝体干燥,得到产物虫草菌粉.
种子培养基为:葡萄糖2%、蛋白胨1%、硝酸铵0.5%、硫酸镁0.05%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸亚铁0.001%、氯化钠0.1%、麸皮5%;
发酵培养基为:葡萄糖2%、蛋白胨1%、硝酸铵0.5%、硫酸镁0.05%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸亚铁0.001%、氯化钠0.1%、5%蚕蛹粉5%;
发酵培养基,5%麸皮,5%蚕蛹粉,水煮30分钟,用4层纱布过滤取滤液。
机译: 使用这种植物生产抗虫性抗虫药,抗虫性植物药,植物种子和核酸分子的方法
机译: 粉体喷涂中粉体质量控制方法及装置
机译: 激光堆放阀座的原料粉和原料粉中