抗对虾白斑综合症病毒重组伤寒沙门氏菌株及制备和用途

摘要

本发明公开了一种抗对虾白斑综合症病毒重组鼠伤寒沙门氏菌株及制备和用途。从患病对虾体内提取对虾白斑综合症病毒WSSV的基因组DNA，并通过PCR的方法得到病毒囊膜蛋白VP28基因；从家蚕脂肪体中提取总RNA，反转录获得家蚕抗菌肽CD基因；构建含有WSSV囊膜蛋白VP28基因和家蚕抗菌肽CD基因的真核表达质粒pcDNA3.1(－)－VP28－CD。将其转化减毒鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium W0420感受态细胞。将此疫苗直接口服喂养对虾，该疫苗与当前常用的蛋白疫苗和注射单一DNA疫苗相比，具有阻断WSSV的感染和提高对虾免疫力的双重功能。

说明书

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域，更具体涉及一种抗对虾白斑综合症病毒重组鼠伤寒沙门氏菌株，该菌株涉及对虾白斑综合症病毒wssv囊膜蛋白VP28基因和家蚕抗菌肽CD基因，同时还涉及一种以减毒鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium W0420为宿主，携带质粒为pcDNA3.1(-)-VP28-CD的基因工程菌的制备方法。本发明还涉及该菌株在制备预防或治疗对虾抗病毒的药物中的用途。

背景技术

1987和1988年，世界范围内首次出现的对虾白斑综合症的大面积爆发，我国台湾地区养殖的斑节对虾发生了大规模的死亡，其典型的症状是病虾甲壳内侧出现0.5-2mm大小不等的白色斑点，该病传播速度快，感染虾在3-7天内死亡率壳高达90％；1993年，日本及中国沿海的对虾养殖场液大面积爆发白斑综合症，虾池大部分绝产；1994年底，泰国南部、印度、马来西亚的养殖对虾也大部分死于白斑病。随后，白斑综合症侵袭了亚洲、印度、太平洋地区及欧美的绝大多数对虾养殖场。到目前为止，在世界大部分对虾养殖区都发现了白斑综合症，该症已成为当前全球对虾养殖业面临的最严峻的挑战之一。此外，出于对虾白斑综合症病原宿主广泛，除了感染对虾外，还感染甲壳纲的很多动物，如螃蟹、龙虾等，因此它也对自然生态环境造成了极大的威胁。

对虾白斑综合症病毒是一种无包涵体、具囊膜、一端有尾巴状结构、杆状的双链环状DNA病毒，其完整的病毒粒子横切面为圆形，纵切面为杆状而略带椭圆，粒子外被囊膜，囊膜为双层结构，囊膜内可见杆状的核衣壳和核衣壳内致密的髓核。2001年中美科学家合作在世界上首次完成了wssv全基因组测序，其结果显示其基因组大小约为300000碱基对左右，是迄今为止最大的动物病毒。对虾白斑综合症病毒具有广泛的宿主谱，在甲壳纲核昆虫钢动物中均有其敏感宿主，以虾、蟹等十足类为多。对虾白斑综合症病毒能感染致病的对虾种类有斑节对虾、日本对虾、墨吉对虾、长毛对虾。中国对虾、万氏对虾、印度对虾、蓝对虾、万额新对虾等。

根据对虾白斑综合症病毒的完整病毒粒子的SDS-PAGE分析，该病毒有5个主要的结构蛋白，VP15，VP19，VP24，VP26和VP28。其中作为wssv囊膜上主要的结构蛋白的VP28是目前研究较多的蛋白，它的分子量为28kD。张晓波等(Zhang，X.et al.，Identification andlocalization of a prawn white spot syndrome virus gene that encodes an envelope protein，J.ofGen.Virol.，2002，83：1069-1074)在大肠杆菌中表达了VP28蛋白，同时证明了VP28的基因是一个晚期表达的基因，并用免疫金标记法得出VP28是wssv外层囊膜蛋白的结论，

已经有文献报道，利用VP28的多克隆或者单克隆抗体能够有效的抑制病毒的吸附和侵入，从而阻断病毒的复制而达到中和病毒的效果(Van Hulten，M.C.，et al.White spot syndromevirus envelop protein VP28 is involved in the systemic infection of shrimp.Virology，2001b.Jul.5，285(2)：228-233)，从而认为VP28蛋白在wssv感染宿主的起始步骤中起关键作用，故在本发明中是采用VP28的基因来构建对虾白斑综合症的DNA疫苗。

抗菌肽是昆虫产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽类活性物质，它具有分子量小，热稳定，水溶性好，无免疫原性，抗菌谱广等特点。现在，它被认为是从细菌到高等哺乳动物普遍存在的一类防御性多肽，被称为“第二防御体系”。抗菌肽不仅抗菌谱广，而且还可以抑杀某些真菌、病毒及原虫，并对多种癌细胞及动物实体瘤有明显的杀伤作用，而不破坏正常细胞。近年来，对昆虫抗菌肽的研究已成为一个迅速发展的新领域，越来越引起人们的关注和重视。

家蚕抗菌肽Cecropion D(简称CD)，最早是从家蚕免疫血淋巴中分离得到的。1999年Yang通过mRNA差异显示的方法，获得其全长cDNA其编码全长肽蛋白为62个氨基酸，经过翻译后修饰，去掉信号部分和C末端酰胺后，成为具有生物活性的成熟肽。CD为线性阳离子肽，成熟肽链长36个氨基酸残基，不含半胱氨酸，对大肠杆菌和其它革兰氏阴性菌如沙门氏菌具有很强的活性，对某些革兰氏阳性菌也有杀伤活性。但至今未见有相关文献报道将其用于抗对虾白斑综合症病毒的研究。

DNA免疫现象的发现和研究始于1990年，Wolff等发现，直接注射纯化的DNA进入小鼠骨骼肌肉细胞中，该基因能在小鼠骨骼肌中表达，并在接种60天后，该基因编码的酶仍有生物学活性。同时，Williams等通过氦驱动的已包被有DNA的微粒轰击鼠肌和鼠肝脏，发现编码的基因在两种组织中的表达存在达14天以上。

DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，其建立和发展很大程度上就是基于这个上个世纪九十年代初新兴的免疫学理论和技术——DNA免疫。由于DNA免疫没有繁琐的蛋白纯化步骤，更重要的是，基因在体内的表达及诱生免疫反应的过程，模拟了自然状态下机体感染病原生物表达抗原及诱导免疫的过程。因此，DNA免疫系统一建立，很快便成为抗感染、抗肿瘤免疫等领域的研究热点。自1994年以来，美国FDA已陆续批准了HIV、流感病毒、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、疟疾和肿瘤相关抗原等DNA疫苗进入临床实验。至今为止，以DNA免疫技术为关键技术，已研制除不同预防性和治疗性DNA疫苗，发展为以DNA免疫为特征的第三代疫苗。

目前已有文献报道，将对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白基因VP28构建到真核表达载体pVAXI中，注射免疫老虎虾，可以大幅降低对虾白斑综合症病毒的感染力(Namita Rout，Sudhir Kumar，Shanmugam Jaganmohan，Vadivel Murugan DNA vaccines encoding viralenvelope proteins confer protective immunity against WSSV in black tiger shrimp.Vaccine 2007；25(15)：2778-2786)。

DNA疫苗可以通过多种途径免疫，如肌肉注射，皮下注射，静脉注射，腹腔注射，基因枪微粒轰击，口服免疫等，这些途径都能在不同程度上诱导细胞和体液免疫反应。细胞内感染性细菌减毒后作为DNA疫苗载体是一种新型的基因免疫途径，弱毒的胞内细菌可以将质粒DNA呈递给专职的抗原呈递细胞(APCs)，携带质粒DNA的细菌在APC细胞内发生溶解或以宿主吞噬小体为桥梁进入胞质，并将DNA释放到细胞核中，使抗原基因在体内进行表达而诱导相应的细胞免疫和体液免疫反应。

目前，减毒细胞内感染性细菌已被试验性的用作载体携带外源抗原，如李斯特菌、沙门氏菌、耶尔森菌、志贺氏菌及分枝杆菌等。这些通过多种方法减毒的胞内菌对宿主致病性明显降低，但仍保留良好的侵袭力。国外学者已初步证实细菌载体可直接将真核表达质粒携带进入动物细胞内表达相应的蛋白而诱导免疫反应。另外，以细菌为载体的DNA疫苗还具有易于制备和使用。成本较低等优点，有利于群体的免疫接种。因此，弱毒胞内菌有望成为真核质粒的导入载体，在动物疫病的基因免疫方面具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种抗对虾白斑综合症病毒重组伤寒沙门氏菌株，该菌株含有真核表达质粒pcDNA3.1(-)-VP28-CD，简单，口服方便，安全无毒，提高了对虾抗对虾白斑综合症病毒的能力。

本发明的另一个目的是在于提供了一种抗对虾白斑综合症病毒重组伤寒沙门氏菌株的制备方法，该方法简便易行，操作方便。

本发明还有一个目的是在于提供一种对虾白斑综合症病毒重组伤寒沙门氏菌株在制备治疗或预防抗对虾白斑综合症病毒的药物中的应用(对养殖业中的应用)。

本发明通过如下技术路线实施：

一种预防对虾白斑综合症病毒的口服DNA疫苗的制备首先是克隆得到对虾白斑综合症病毒VP28基因和对虾抗菌肽CD基因，二者通过酶切位点HindIII连接融合，且中间加入五个编码甘氨酸的碱基作为接头，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。将该融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中，然后在将该融合表达的质粒转化的鼠伤寒沙门氏菌中，得到预防对虾白斑综合症病毒的口服DNA疫苗。在本发明中，已经成功将其应用于免疫对虾，预防对虾白斑综合症病毒。

细胞内感染性细菌减毒后作为DNA疫苗载体是一种新型的基因免疫途径。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种可产生局部或全身感染的胞内病原体，通过基因工程方法减毒的沙门氏菌对宿主致病性显著降低，但仍保留良好的侵袭力，对粘膜组织有很强嗜性。携带重组质粒的沙门氏菌口服免疫动物可直接将外源基因运至抗原呈递细胞进行有效表达后诱导特异性的免疫应答反应。与常规疫苗相比，以减毒沙门氏菌作为载体传递外源抗原基因进行基因免疫具有很多优势，沙门氏菌作为细胞内感染性细菌可侵入免疫相关细胞，能更有效的激发宿主的体液和细胞免疫。而且，以减毒沙门氏菌为载体不需提纯抗原，制备简单，可用口服途径进行免疫，既省时有方便。

同样的道理，以海洋中存在的弧菌或者其它细胞内感染的细菌都可以作为口服DNA疫苗的载体，本发明仅采用鼠伤寒沙门氏菌作为口服DNA疫苗的载体，其它细菌亦可达到同样的效果。

VP28和CD两种融合后，既可以发挥单独VP28的特异性抗对虾白斑综合症病毒的功效，又可以利用CD的广谱抗菌、抗病毒的作用，来增强对虾对对虾白斑综合症病毒的抵抗力，同时，CD基因的表达，在一定程度上也可以为对虾免疫系统最终清除鼠伤寒沙门氏菌。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供一种预防对虾白斑综合症病毒的口服DNA疫苗，其特征在于：该疫苗由VP28、CD基因和真核表达载体pcDNA3.1(-)组成，VP28和CD基因间通过酶切位点HindIII连接融合，二者之间使用编码5个甘氨酸的碱基序列作为接头，具有SEQ ID NO：1所示的核酸和氨基酸序列。然后将该融合表达质粒转化入鼠伤寒沙门氏菌中。

本发明提供一种减毒鼠伤寒沙门氏菌的基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

A、wssvVP28基因的制备：于冰上取病虾的腮、胃、肝等内脏，加入10倍体积(W/V)的TN缓冲液于匀浆器中，缓冲液为20mmol/LTris-HCl；0.4mol/LNaCl，pH7.4，冰浴匀浆，8000r/min，离心5min，取上清液，加入蛋白酶K 100μg/mL，DS缓冲液50mmol/L KCl；10mmol/L Tris-HCl，pH8.3；明胶0.1mg/mL；NP-40，0.45％，于沸水中煮10-15min，冰浴5min，12000rpm高速离心，取其上清液做模板DNA，。根据Genbank中wssvVP28基因的序列设计特异性引物，用PCR扩增得到VP28基因的序列；

B、家蚕抗菌肽基因的制备：通过大肠杆菌JM109诱导家蚕，按照RNA提取试剂盒(购买于QIAGEN公司)的方法提取其脂肪体总RNA，根据CD的序列设计引物，按照反转录试剂盒(购买于Promega公司)的方法进行cDNA合成和PCR扩增，得到CD基因的序列；

C、融合基因的制备及真核表达载体质粒的构建；VP28和CD基因间通过酶切位点HindIII连接融合，二者之间使用编码5个甘氨酸的碱基序列作为接头，将该融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中，构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-VP28-CD；

D、将所构建的真核表达质粒pcDNA3.1(-)-VP28-CD，通过电转的方法，转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌SALMONELLATYPHIMURIUMW0420中，得到预防对虾白斑综合症病毒的口服DNA疫苗。该DNA疫苗为一种鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌株，重组基因工程菌株Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3.1(-)-VP28-CD，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2008年5月13日，保藏编号：CCTCC No：M208072，分类命名：重组基因工程菌株Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3.1(-)-VP28-CD。

本发明使用所构建的对虾白斑综合症病毒的口服DNA疫苗免疫对虾，一周后用对虾白斑综合症病毒攻击，可以看到DNA疫苗免疫组较未免疫组有很高的保护效率(高达98％以上)。

本发明的优势在于：1)本DNA疫苗所使用的VP28基因，其编码的病毒囊膜蛋白在对虾体内表达后，一方面可以封闭病毒在细胞表面的受体，阻断病毒的感染，另一方面，也可以起到亚单位疫苗的作用，提高对虾对病毒的免疫力；2)家蚕抗菌肽CD具有广谱的抗菌，抗病毒的作用，本发明创新性的把它用于对虾抗wssv，一方面，它表达后可以直接起到抗病毒的作用，另外，CD基因的表达在一定程度上也为对虾免疫系统最终清除鼠伤寒沙门氏菌起到关键性作用；3)本发明采用DNA疫苗的形式免疫对虾，和传统的蛋白疫苗相比，成本低廉，操作工艺简单；4)本发明中的DNA疫苗是口服给药，至今在国内外仍未见将口服DNA疫苗应用于对虾抗wssv的文献报道。

附图说明

图1：质粒pGEM-T-VP28-CD构建方法示意图

图2质粒pcDNA3.1(-)-VP28-CD构建方法示意图

图3：pGEM-T-VP28-CD的构建图

1：MarkerIII 2：pGEM-T-VP28质粒3：pGEM-T-VP28/Hind III、Pst I4：pGEM-T-CD质粒5：pGEM-T-CD/Hind III、Pst I 6：Marker D2000

图4：质粒pGEM-T-VP28-CD酶切鉴定图

1：MarkerIII 2：pGEM-T-VP28-CD质粒3：pGEM-T-VP28-CD双切/Xba I、BamHI4：Marker D2000

图5：pcDNA3.1(-)-VP28-CD酶切鉴定图

1：MarkerIII 2：pcDNA3.1(-)-VP28-CD质粒3：pcDNA3.1(-)-VP28-CD双切/Xba I、BamHI4：Marker D2000

图6：对虾白斑综合症口服DNA疫苗抗病毒的效果图(样品组即第四组和对照组相比有高达98％以上的保护效率)

具体实施方式

实施例1：VP28基因的制备。

于冰上取病虾的腮、胃、肝等内脏，加入10倍体积(W/V)的TN缓冲液(20mmol/L Tris-HCl；0.4mol/L NaCl，pH7.4)于匀浆器中，冰浴匀浆。8000r/min，离心5min，取上清液，加入蛋白酶K(100μg/mL)，DS缓冲液(50mmol/L KCl；10mmol/LTris-HCl，pH8.3；明胶0.1mg/mL；NP-40，0.45％)，于100℃沸水中煮10-15min，立即冰浴5min，12000rpm高速离心，取其上清液做模板DNA。根据Genbank中wssvVP28基因的序列(序列号：DQ979620)设计特异性引物(VP28上游引物，GCTCTAGAATGGATCTTTCTTTCACTCT(划线处为Xba I位点)；VP28下游引物，CTAAGCTTCTCGGTCTCAGTGCCAGA(划线处为HindIII位点))，用PCR扩增得到VP28基因的序列。PCR反应体系：10×reaction buffer 5uL，25mM MgCl₂ 3uL(1.5mM)，dNTP 1uL(0.2mM)，上下游引物各1uL(20μmol)，Taq DNA聚合酶1uL(5U)，模板4uL，加无菌水至终体积为50uL。PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 60s，72℃ 60s(30个循环)；72℃ 10min。将所得的基因克隆于pGEM-T载体(从Promega公司购买)，转化到大肠杆菌JM109(从Promega公司购买)中，测序鉴定，得到pGEM-T-VP28质粒。

实施例2：CD基因的制备。

取5-10条经大肠杆菌JM109诱导24小时后的家蚕，用DEPC水(0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液)清洗干净后，切开腹腔，将脂肪体挤出后，在液氮中研磨成粉末状，按照RNeasy^RKit的操作说明书提取脂肪体总RNA。按照Reverse Transcription System试剂盒说明书，以Oligo(dT)₂₀为因为合成cDNA第一链。反应体系如下：20mM MgCl₂ 12 uL，ReverseTranscription 10×Buffer 6uL，dNTP Mixture 10mM 6uL，Recombinant RNasin RionucleaseInhibitor 2uL，CMV Reverse Transcriptase 4uL，Oligo(dT)₂₀ Primer 6uL，总RNA 15uL，Nuclease-free H₂O 9uL。反应条件为：42℃ 1h，95℃ 5min，4℃ 5min。将反应后的产物作为目的基因克隆的模板，根据CD的序列(序列号：AB010825)设计引物(CD上游引物，GCAAGCTTGGCAACTTCTTCAAGGATCT(划线处为HindIII位点，方框处为5个甘氨酸)；CD下游引物，GCGGATCCCTAGTTTTGTCCGAGAGCTTTTGC(划线处为BamHI位点))，用PCR扩增得到CD的基因。PCR反应体系为：cDNA第一链20uL，25mM MgCl₂ 4uL，10×reaction buffer 2uL，dNTP Mixture 10mM 4uL，CD上游引物，2uL，CD下游引物2uL，Taq DNA聚合酶0.5uL，H₂O 3.5uL。PCR反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s(30个循环)；72℃ 10min。将所得的基因克隆于pGEM-T载体(从Promega公司购买)，转化到大肠杆菌JM109中，测序鉴定，得到pGEM-T-CD质粒。

实施例3：VP28-CD融合基因的获得。

HindIII、Pst I(限制性内切酶均从TAKALA公司购买)分别双酶切已经构建好的质粒pGEM-T-VP28和pGEM-T-CD，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，回收pGEM-T-VP28酶切后的大片断(3600bp左右)和pGEM-T-CD酶切后的小片断(130bp左右)。

再将pGEM-T-VP28酶切后的大片断和pGEM-T-CD酶切后的小片断通过T4 DNA连接酶(从TAKALA购买)连接，连接产物转化大肠杆菌JM109细胞。37℃过夜培养，次日挑取平板上单菌落鉴定，筛选阳性克隆命名为pGEM-T-VP28-CD(构建方法如附图1所示)。

用Xba I、BamH I双酶切表达载体pcDNA3.1(-)(购买于Invitrogen公司)和重组克隆载体pGEM-T-VP28-CD，分别用胶回收试剂盒回收目的片断pcDNA3.1(-)和VP28-CD，再通过T₄ DNA Ligase连接，16℃连接15h后，转化大肠杆菌JM109感受态细胞。用无菌牙签从转化平皿上挑取单菌落，接种于5mL含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜。次日提取质粒做PCR和双酶切鉴定，筛选阳性克隆进行测序鉴定，测序正确者即为所需克隆，命名为pcDNA3.1(-)-VP28-CD(构建方法如附图2所示)。该克隆即具有SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸及氨基酸序列。

实施例4：将pcDNA3.1(-)-VP28-CD转化鼠伤寒沙门氏菌。

接种沙门氏菌的一个单菌落于20mL LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％NaCl)中，37℃震荡培养过夜。将1mL培养物接种到盛有100mL LB培养基的三角瓶中，37℃震荡培养至OD₆₀₀为0.5-0.6。将菌液置于冰上冰浴10-15分钟，然后转移到预冷的离心管中，离心收集菌体。再次用预冷的无菌水重悬菌体，离心收集，重复3次。沉淀用预冷的无菌水重悬，按100μL分装于离心管中。

将质粒pcDNA3.1(-)-VP28-CD与上述感受态混匀，然后转移到预冷的电转杯，放入样品槽中，脉冲电转化(2.5kV)。电击后马上取出电转杯，加入1mL LB培养基，并将其转移到无菌的EP管中，37℃温育1小时，分小份涂布于含有Amp的LB平板(LB培养基中加入1％的琼脂粉)上。第二天挑取单菌落进行PCR鉴定，阳性菌即为我们所要的克隆。即为一种减毒鼠伤寒沙门氏菌的基因工程菌株。

实施例5：口服DNA疫苗在对虾中实际预防对虾白斑综合症病毒的疗效实验。

口服DNA疫苗样品的制备：将37℃、300R/min震荡培养16-18小时的鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium W0420和鼠伤寒沙门氏工程菌Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3.1(-)-VP28-CD计数。分别移取5×10⁹/ml菌液20ml，于4℃10000R/min离心10min去上清，分别用4ml无菌水重悬，然后分别加10克玉米淀粉吸附，小于35℃烘干，用研钵研磨过120目筛，即样品含菌1×10¹⁰个/克。用万分之一天平分别称取0.0500克上述两种样品和0.05玉米淀粉，取8ml水，于塑料小盘分别搅拌均匀后，加入40克的粤海牌对虾饲料2号料拌匀、凉干备用。即鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium W0420包被好的饲料中每克含有1.25×10⁷个菌，鼠伤寒沙门氏工程菌Salmonella typhimurium W0420/pcDNA3.1(-)-VP28-CD包被好的饲料每克含有1.25×10⁷个菌。

口服病毒饲料的制备：取实验室提取的病毒贮存液20mL，添加辅料(玉米淀粉)混合到100g对虾饲料中，晾干后即立即使用。

将平均体重约为1.5g的南美白对虾随机分成四组，每组约120头。分别用作以下实验：

第一组，阳性对照组，不喂任何处理过的饲料，一周后喂食包裹有对虾白斑综合症病毒的饲料4克。其余时候每天三次喂食正常饲料。

第二组，在第一、二、五日喂食包裹有未转入任何质粒的鼠伤寒沙门氏菌的饲料(即空菌)4克(具体免疫剂量为平均每次每只虾摄入10⁶cfu)，一周后喂食包裹有对虾白斑综合症病毒的饲料4克。其余时候每天三次喂食正常饲料。

第三组，在第一、二、五日喂食包裹有转入空载体pcDNA3.1(-)的鼠伤寒沙门氏菌的饲料4克(具体免疫剂量为平均每次每只虾摄入10⁶cfu)，一周后喂食包裹有对虾白斑综合症病毒的饲料4克。其余时候每天三次喂食正常饲料。

第四组，在第一、二、五日喂食包裹有转入质粒pcDNA3.1(-)-VP28-CD的鼠伤寒沙门氏菌的饲料4克(具体免疫剂量为平均每次每只虾摄入10⁶cfu)，一周后喂食包裹有对虾白斑综合症病毒的饲料4克。其余时候每天三次喂食正常饲料。

各组死亡率情况如附图6及下表所示，样品组有很好的抗对虾白斑综合症病毒的效果，和对照组相比，具有高达98％以上的保护效率。

实施例6口服DNA疫苗在对虾中实际预防对虾白斑综合症病毒的安全性实验

随机取平均体重约为1.5g的南美白对虾约60头。所喂食的样品为包裹有鼠伤寒沙门氏菌的饲料(具体剂量为平均每次每只虾喂食10⁶cfu)。除第一、二、五日喂食样品外，此后每5日喂一次样品，30日后，所有对虾均活泼健康，未见死亡。

序列表

<110>广东湛江开发区肽源生物工程有限公司

<120>抗对虾白斑综合症病毒重组伤寒沙门氏菌株及制备和用途

<130>抗对虾白斑综合症病毒重组伤寒沙门氏菌株及制备和用途

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>747

<212>DNA

<213>融合蛋白

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(747)

<223>

<400>1

atg gat ctt tct ttc act ctt tcg gtc gtg tcg gcc atc ctc gcc atc     48

Met Asp Leu Ser Phe Thr Leu Ser Val Val Ser Ala Ile Leu Ala Ile

1               5                   10                  15

act gct gtg att gct gta ttt att gtg att ttt agg tat cac aac act     96

Thr Ala Val Ile Ala Val Phe Ile Val Ile Phe Arg Tyr His Asn Thr

            20                  25                  30

gtg acc aag acc atc gaa acc cac aca gac aat atc gag aca aac atg    144

Val Thr Lys Thr Ile Glu Thr His Thr Asp Asn Ile Glu Thr Asn Met

        35                  40                  45

gat gaa aac ctc cgc att cct gtg act gct gag gtt gga tca ggc tac    192

Asp Glu Asn Leu Arg Ile Pro Val Thr Ala Glu Val Gly Ser Gly Tyr

    50                  55                  60

ttc aag atg act gat gtg tcc ttt gac agc gac acc ttg ggc aaa atc    240

Phe Lys Met Thr Asp Val Ser Phe Asp Ser Asp Thr Leu Gly Lys Ile

65                  70                  75                  80

aag atc cgc aat gga aag tct gat gca cag atg aag gaa gaa gat gcg    288

Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Asp Ala Gln Met Lys Glu Glu Asp Ala

                85                  90                  95

gat ctt gtc atc act ccc gtg gag ggc cga gca ctc gaa gtg act gtg    336

Asp Leu Val Ile Thr Pro Val Glu Gly Arg Ala Leu Glu Val Thr Val

            100                 105                 110

ggg cag aat ctc acc ttt gag gga aca ttc aag gtg tgg aac aac aca    384

Gly Gln Asn Leu Thr Phe Glu Gly Thr Phe Lys Val Trp Asn Asn Thr

        115                 120                 125

tca aga aag atc aac atc act ggt atg cag atg gtg cca aag att aac    432

Ser Arg Lys Ile Asn Ile Thr Gly Met Gln Met Val Pro Lys Ile Asn

    130                 135                 140

cca tca aag gcc ttt gtc ggt agc tcc aac acc tcc tcc ttc acc ccc    480

Pro Ser Lys Ala Phe Val Gly Ser Ser Asn Thr Ser Ser Phe Thr Pro

145                 150                 155                 160

gtc tct att gat gag gat gaa gtt ggc acc ttt gtg tgt ggt acc acc    528

Val Ser Ile Asp Glu Asp Glu Val Gly Thr Phe Val Cys Gly Thr Thr

                165                 170                 175

ttt ggc gca cca att gca gct acc gcc ggt gga aat ctt ttc gac atg    576

Phe Gly Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asn Leu Phe Asp Met

            180                 185                 190

tac gtg cac gtc acc tac tct ggc act gag acc gag aag ctt ggt ggt    624

Tyr Val His Val Thr Tyr Ser Gly Thr Glu Thr Glu Lys Leu Gly Gly

        195                 200                 205

ggt ggt ggt ggc aac ttc ttc aag gat ctt gaa aaa atg ggt cag agg    672

Gly Gly Gly Gly Asn Phe Phe Lys Asp Leu Glu Lys Met Gly Gln Arg

    210                 215                 220

gtt cga gac gcc gtc atc agc gcg gct cca gca gtc gac acc ctg gca    720

Val Arg Asp Ala Val Ile Ser Ala Ala Pro Ala Val Asp Thr Leu Ala

225                 230                 235                 240

aaa gca aaa gct ctc gga caa aac tag                                747

Lys Ala Lys Ala Leu Gly Gln Asn

                245

<210>2

<211>248

<212>PRT

<213>融合蛋白

<400>2

Met Asp Leu Ser Phe Thr Leu Ser Val Val Ser Ala Ile Leu Ala Ile

1               5                   10                  15

Thr Ala Val Ile Ala Val Phe Ile Val Ile Phe Arg Tyr His Asn Thr

            20                  25                  30

Val Thr Lys Thr Ile Glu Thr His Thr Asp Asn Ile Glu Thr Asn Met

        35                  40                  45

Asp Glu Asn Leu Arg Ile Pro Val Thr Ala Glu Val Gly Ser Gly Tyr

    50                  55                  60

Phe Lys Met Thr Asp Val Ser Phe Asp Ser Asp Thr Leu Gly Lys Ile

65                  70                  75                  80

Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Asp Ala Gln Met Lys Glu Glu Asp Ala

                85                  90                  95

Asp Leu Val Ile Thr Pro Val Glu Gly Arg Ala Leu Glu Val Thr Val

            100                 105                 110

Gly Gln Asn Leu Thr Phe Glu Gly Thr Phe Lys Val Trp Asn Asn Thr

        115                 120                 125

Ser Arg Lys Ile Asn Ile Thr Gly Met Gln Met Val Pro Lys Ile Asn

    130                 135                 140

Pro Ser Lys Ala Phe Val Gly Ser Ser Asn Thr Ser Ser Phe Thr Pro

145                 150                 155                 160

Val Ser Ile Asp Glu Asp Glu Val Gly Thr Phe Val Cys Gly Thr Thr

                165                 170                 175

Phe Gly Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asn Leu Phe Asp Met

            180                 185                 190

Tyr Val His Val Thr Tyr Ser Gly Thr Glu Thr Glu Lys Leu Gly Gly

        195                 200                 205

Gly Gly Gly Gly Asn Phe Phe Lys Asp Leu Glu Lys Met Gly Gln Arg

    210                 215                 220

Val Arg Asp Ala Val Ile Ser Ala Ala Pro Ala Val Asp Thr Leu Ala

225                 230                 235                 240

Lys Ala Lys Ala Leu Gly Gln Asn

                245