一种从林蛙组织中萃取胶原螺旋肽的制备方法

摘要

一种从林蛙组织中萃取胶原螺旋肽的制备方法，用干制与鲜活秋季捕捉野生或人工养殖雄性林蛙或被剥取林蛙油的雌性林蛙体作原料，经预处理、复合酶解、生物酶修饰、离心分离、稀释、超微膜纯化、低温浓缩、离心喷雾干燥、胶囊包装成林蛙胶原螺旋肽成品。本发明的优点为：采用生物技术将林蛙体具有螺旋状两亲性结构与细胞膜和肌肤有高亲和性的林蛙生物防护素——胶原螺旋肽通过生物酶解、修饰、分离纯化、浓缩成林蛙胶原螺旋肽生物保健品，为林蛙的药用价值、食用价值，提供了新的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及到用林蛙体萃取胶原旋肽的制备方法。

背景技术

林蛙以其特有的营养价值和药用价值，而日渐被人们所重视，成为蛙类中经济价值较高的一种。又因其专摄取昆虫类食物，又被誉为“纯绿色食品”。林蛙是延缓衰老、滋补强壮、美容健肤、增强机体免疫力的最佳进补良药。目前林蛙人工养殖数量日益增多，科学加工林蛙已是相关科研单位研究的主要课题。经研究表明源自两栖动物的肽，具有螺旋肽两亲性结构，与细胞膜的肌肤有高亲和性。它们在蛙类的两栖动物的肌健、骨膜、皮肤腺体中形成生物防护素，即胶原螺旋肽。本发明是从林蛙体中萃取胶原螺旋肽的方法，为林蛙药用保健价值提供新的空间。

发明内容

本发明的目的是提供从林蛙体中萃取胶原螺旋肽的制备方法，使林蛙体生物活性物质得到更广泛的应用，为人们能在日常生活中获得林蛙的营养、药用、美容价值的保健食品提供方便，也为林蛙产业发展起到促进作用。

一种从林蛙组织中萃取胶原螺旋肽的制备方法

1.林蛙体的获取：

1.1林蛙体的选择：在秋季捕捉林蛙，经干制法被剥取林蛙油后的雌性林蛙和雄性林蛙体，或经鲜活制法剥取蛙油后的新鲜雌性蛙体，或鲜活的雄性林蛙体为原料。

1.2林蛙体的贮存：A、收集干制的雄蛙干或取油后的雌蛙干，贮于0-4℃冷藏库内；B、收集鲜活雄蛙或被剥取蛙油的雌蛙，速冻后贮存于-18℃的冷冻库内备用；

2、林蛙体的预处理：

2.1取干制的林蛙体，用中药切片机切成1.0-5.0mm的蛙体片，然后将蛙体片置于不锈钢槽内，加入1-5倍蛙体重量的蒸馏水或纯净水，同时加入1-3％蛙体重量的柠檬酸钠、酒石酸或V_C，浸泡4-10小时，水温控制在20-40℃之内，每隔20-60min搅拌一次；

2.2取冷冻贮存的蛙体，采用电动刨肉机，将蛙体均匀的刨成1.0-5.0mm的薄片，然后置于不锈钢槽内，加入1-3倍蛙体重量的蒸馏水或纯净水，同时加入1-3％蛙体重量的柠檬酸钠、酒石酸或V_C，浸泡2-6小时，每隔20-60min搅拌一次，水温控制在10-20℃；

3、生物酶解：

3.1复合酶解：将预处理后的林蛙片连同浸泡汁，加入真空反应釜内，加热至35-60℃，调整PH值为6-8，每千克林蛙体加入2-6g的1398中性蛋白酶，1-3g的1203脂肪酶，1-5g防腐剂乳酸菌素或氟硅酸钠，每100万单位酶活量加入2-8g亚硫酸钠或V_C作为酶激活剂；真空度控制在100-800Pa，搅拌下酶解反应6-12h；然后用100-300目的双联过滤器过滤出骨渣等杂物；在复合酶解反应下，有脱脂反应过程和酶解蛋白质过程；得复合酶解液；

3.2生物酶修饰：经酶降解液体含有蛋白酶与肽酶复合体，味比较苦，为修饰苦味和彻底酶解，将复合酶解液用空气压力输送至生物酶修饰反应釜中，调整PH值为6～8，温度控制在40～60℃，加入蛙体质量0.2～2.0％的丹麦诺维信功能食品工业生产的Flavourzyme复合风味蛋白酶、0.1～1.0％的磷脂酯酰基水解酶(俗称：磷脂酶A)，真空度为200～800Pa搅拌酶修饰3～8h；通过酶修饰成黏度3/mpa.s6～12、产率16～36％的胶原螺旋肽分子液；

3.3灭酶，采用超高温瞬间灭酶法在120-150℃/s，出料温度为30-50℃的条件下灭酶，或加温60-80℃/30-60min使酶失活；

4、胶原螺旋肽分离纯化

4.1离心分离：采用高速离心机将酶解液以6000-60000r/min的速度离心6-20min，将上层液和中层液合并输入稀释罐体内，即酶解分离液，下层液被分离出去；

4.2稀释：将酶解分离液，按1∶1-3重量比例加入纯净水或蒸馏水，在真空度100-800Pa搅拌稀释；

4.3超微膜纯化：将稀释液用循环泵加压0.2MPa-0.8MPa通过平衡保险分离器在0.1um-0.5um的精度下进行分离，然后用5-50m³/h的循环泵将滤液在0.6-1.6MPa的压力下通过50000道尔顿的超微膜纯化，获得分子量大于等于50000道尔顿的胶原螺旋肽液；

4.4低温浓缩：为保持胶原螺旋肽活性，不被高温破坏螺旋肽活性成份，采用热隔膜低温浓缩技术对胶原螺旋肽液进行浓缩，温度为40-60℃，真空度为0.3-1.8MPa，除去胶原螺旋肽液中30-70％体积的水分，然后将浓缩液输送到平衡罐内；

5、干燥成型：

5.1喷雾干燥：将浓缩液用浓浆泵以100-500r/min的流速输入180-260℃的离心喷雾干燥塔内干燥成粉沫；在出料口收集胶原螺旋肽粉，用复合袋密封，获得分子量大于等于50000道尔顿的胶原螺旋肽粉；

5.2将干燥后的胶原螺旋肽糖，经自动充胶囊机灌上每粒200-300毫克的硬胶囊，然后泡罩成PVC和铝箔每板10粒。经检验包装成精品盒或获得林蛙胶原螺旋肽胶囊成品。

本发明的积极效果：

1.采用生物蛋白酶解技术将雄性林蛙和被剥取蛙油的雌蛙降解成胶原螺旋肽。

2.采用超微膜和低温浓缩技术分离林蛙酶解液纯化林蛙胶原螺旋肽分子量。使产品具有稳定性、抗氧化性、易保存，易被人体吸收。

3.采用林蛙干或鲜林蛙制备林蛙螺旋肽胶囊，使人们在日常生活中即食荚豌豆获得林蛙的保健功效，为林蛙的药用价值、营养价值提供新的发展空间。

总之采用生物技术将林蛙体具有螺旋状两亲性结构与细胞膜和肌肤有高亲和性的林蛙生物防护素——胶原螺旋肽通过生物酶解、修饰、分离纯化、浓缩成林蛙胶原螺旋肽生物保健品，为林蛙的药用价值、食用价值，提供了新的途径。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

取秋季捕捉经干制剥取林蛙油的雌性林蛙和雄性林蛙50kg，采用中草药切片机将干制林蛙切成2mm的林蛙片，置于300L的不锈钢槽内，加入200kg的蒸馏水和3kg的柠檬酸钠，浸泡8小时，水温控制在20℃。用木搅拌棒每隔30min搅动3min，将500L不锈钢真空酶反应釜用100PPM/L的二氧化氯消毒液消毒，放出消毒液后，再将浸泡的林蛙片连同浸泡汁一起倒入酶反应釜内，调整PH值为7，蒸汽加热、，温度控制在37℃，加入1398中性蛋白酶150g，酶活力每克90000U，1203脂肪酶100g、乳酸菌素100g、V_C10.8g。密封加料罐盖，抽真空300Pa，维持260Pa，启动搅拌器搅拌使酶反应8小时。然后用供料泵通过200目的双联过滤器滤出骨渣等杂物。滤液输送至500L的酶修饰反应釜内，调整PH值为7，温度为50℃，加入丹麦诺维信功能食品工业生产的FLAUOURZYME复合风味蛋白酶150g、磷脂酶50g，密封罐口，抽真空400Pa，维持真空360Pa。启动搅拌器，搅拌酶降解6小时后，形成勃氏黏度60℃测试为8，产出肽蛋白率为36％的酶解液。采用供料泵将酶解液通过140℃/s的超高温瞬间灭酶，出料温度控制在50℃。趁热用6000r/min的蝶式分离机分离酶解液10min，除去下层液和杂质，合并中、上层液体。输入1000L不锈钢稀释罐内加入400kg的纯净水搅拌稀释20min，真空度为200Pa。启动板式超微膜分离器，将580kg的稀释液在0.4MPa循环泵的输出压力下通过0.2um的微膜过滤保安器。然后启动5m³/h的循环泵在1.0MPa的压力下通过50000道尔顿的126层膜板，分离出50000分子量的胶原螺旋肽液体。启动真空热隔膜泵式低温浓缩器将分离出在55℃、真空1.0MPa的环境下除去水份70％浓缩174kg的浓缩液。用供料泵输入平衡罐内。启动浓浆泵设置200r/min的流速将浓缩液输送到240℃的离心喷雾干燥塔内进行干燥，在二级旋风口集胶原螺旋肽糖18kg，再将18kg胶原螺旋肽糖，经自动充胶囊，每粒胶囊300mg，共灌300mg胶囊60000粒。采用胶囊泡罩机用PVC和铝箔复合每板10粒。然后每两板20粒装入精品盒内获得3000盒胶原螺旋肽胶囊成品。

实施例2

与实施例1不同之处在于，取秋季捕捉鲜活林蛙，100kg采用鲜活取法剥取林蛙油后的雌性林蛙体和雄性林蛙。清洗干净后装2000克的铁盒内，共装48盒，送入-35℃的速冻盒内进行冷冻4小时。冻透后，将48个铁盒放入凉水槽内冲3min倒出林蛙冷冻体，用电动刨肉机刨成3mm的薄片。放在300L不锈钢浸泡槽内，加入150kg的纯净水和2kg的V_C，浸泡6小时，水温控制在20℃，用木棒每隔30min搅动2min，将500L不锈钢真空酶反应釜用100PPM/L的二氧化氯消毒，放出消毒液后，再将浸泡的林蛙片连同浸泡汁一起倒入酶反应釜内，调整PH值为7，加温至37℃，加入1398中性蛋白酶200g、1203脂肪酶150g、氟硅酸钠100g、亚硫酸钠15g，密封罐口，抽真空260Pa，搅拌酶反应8小时。采用料泵通过200目的双联过滤器滤出骨渣等杂物，滤液输送至500L的酶修饰反应釜内，调整PH值为7、温度为50℃，加入丹麦诺维信功能食品工业生产的FLAVOURZYME200g、磷脂酶50g，密封罐口，抽真空360Pa，搅拌酶降解4小时，通过140℃/s瞬间灭酶。趁热用6000r/min的分离机分离出酶解液输入稀释罐内加入400kg蒸馏水真空搅拌稀释20min，用超微膜分离纯化50000分子量的胶原螺旋肽液体，真空低温浓缩成210kg的胶原螺旋肽浓缩液，喷雾干燥成21kg胶原螺旋肽糖，制成300mg的胶囊70000粒，包装成精品3500盒林蛙胶原螺旋肽成品。

实施例3

与实施例1不同之处在于：a.林蛙体的贮存，收集干制的雄蛙干或取油后的雌蛙干，贮于0-4℃冷藏库内备用；

b.取干制的林蛙体，用中药切片机切成1.0mm的蛙体片，然后将蛙体片置于不锈钢槽内，加入5倍蛙体重量的蒸馏水或纯净水，同时加入3％蛙体重量的柠檬酸钠、酒石酸或V_C，浸泡10小时，水温控制在40℃之内，每隔-60min搅拌一次；

c.复合酶解：将预处理后的林蛙片连同浸泡汁，加入真空反应釜内，加热至35℃，调整PH值为6，每千克林蛙体加入6g的1398中性蛋白酶，1g的1203脂肪酶，1g防腐剂乳酸菌素或氟硅酸钠，每100万单位酶活量加入2g亚硫酸钠或V_C作为酶激活剂；真空度控制在100Pa，搅拌下酶解反应6h；然后用100目的双联过滤器过滤出骨渣等杂物；在复合酶解反应下，有脱脂反应过程和酶解蛋白质过程；得复合酶解液；

d.生物酶修饰：经酶降解液体含有蛋白酶与肽酶复合体，味比较苦，为修饰苦味和彻底酶解，将复合酶解液用空气压力输送至生物酶修饰反应釜中，调整PH值为6，温度控制在40℃，加入蛙体质量0.2％的丹麦诺维信功能食品工业生产的Flavourzyme复合风味蛋白酶、0.1％的磷脂酯酰基水解酶(俗称：磷脂酶A)，真空度为800Pa搅拌酶修饰8h；通过酶修饰成黏度3/mpa.s6～12、产率36％的胶原螺旋肽分子液.