食品中鱼类过敏原快速检测试剂盒的制备和检测方法

摘要

本发明属于食品中过敏原的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品中鱼类过敏原的试剂盒及方法。试剂盒包括PCR扩增反应液A、阳性对照DNA B；PCR扩增反应液A含有10×PCR反应缓冲液、硫酸镁、dNTP(含dUTP)、UNG酶、Taq酶、上游引物5′－CAGGACAAGAGTGGCTTCAT－3、下游引物5′－GAAGTTCTGCAGGAACAGCTT－3′、TaqMan－MGB探针5′－AGGAGGA(T/G)GAGCT－3′；鱼类过敏原的快速检测方法包括食品DNA的提取、鱼类过敏原基因的实时荧光PCR扩增和结果判定。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、重复性好。

说明书

技术领域

本发明涉及过敏原检测技术，具体的说是运用实时荧光PCR技术快速检测食品中鱼类过敏原的方法。

背景技术

鱼是最常见的食入性过敏原之一。可引起过敏体质者发生荨麻疹、流涕、喷嚏、哮喘、呼吸困难、呕吐、腹痛、腹泻等不同形式的临床症状。病情严重的，可因支气管痉挛、窒息或过敏性休克而死亡。预防和治疗食物过敏反应，最有效的办法就是避免接触相关食物，为此美国、日本、加拿大、欧盟、英国、意大利、荷兰、纽西兰、澳洲等国家，相继制定并实施过敏原标示制度，以保障消费者的饮食安全，维护公众健康。

近年来，国内外研究者对引发过敏反应的鱼类过敏原进行了深入研究。研究表明，小清蛋白是鱼类最主要的过敏原蛋白，95％的鱼类过敏反应，都是由小清蛋白引起的。小清蛋白分子量很小，约为12kD，108-109个氨基酸残基，是一种钙结合蛋白，主要在鱼类的肌肉组织中表达，对热和酶的作用具有较高抗性。小清蛋白具有较高的同源性，是导致过敏体质者对不同鱼种有交叉性过敏反应的主要原因。

食物中潜在过敏原检测，主要采用蛋白检测和DNA检测的方法。两类方法，对于不同食物成品中过敏原的检出和定量检测，各有优、缺点。以DNA为测试对象的方法与以过敏原蛋白本身为测试对象的方法相比，在食物成分复杂的情况下，目标DNA可以有效提取，受食物基质的影响较小；此外，DNA比较稳定，不象蛋白质组成那样受地理条件、季节变化和加工工艺的影响。当前，基于DNA的检测方法中，实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为检测的重要工具。

目前，国外已有商品化的鱼类过敏原PCR检测试剂盒，但价格昂贵，且检测的鱼种有限，本发明可弥补上述缺陷，完成食品中更多不同来源鱼类过敏原蛋白的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种鱼类过敏原快速检测试剂盒的制备和检测方法，克服基于蛋白的检测方法在某些食品检测中的局限性，为鱼类过敏原检测提供有效工具，从而确保食品标签的一致性和消费者的饮食安全。

本发明的主要原理为：针对保守序列设计一组引物(上游引物：5′-CAGGACAAGAGTGGCTTCAT-3′和下游引物：5′-GAAGTTCTGCAGGAACAGCTT-3′)和一条Taqman-MGB探针(序列为：5′-AGGAGGA(T/G)GAGCT-3′)。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94-95℃一定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman-MGB探针与模板特异性结合。MGB探针的5端标记有报告集团，3端有非荧光淬灭集团，同时还连接有MGB修饰集团(MinorGroove Binder)。当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告集团远离淬灭集团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。

本发明涉及的鱼类过敏原快速检测试剂盒，其中的试剂包括如下：

(1)PCR扩增反应液A

包括10×PCR反应缓冲液、0.1-0.4mmol/LdNTP(含dUTP)、2-4mmol/L硫酸镁、1-2UTaq酶、0.2-0.5U UNG酶、0.2-0.6μmol/L上游引物、0.2-0.6μmol/L下游引物、0.2-0.6μmol/L TaqMan-MGB探针；

其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X-100；

其中上游引物序列为：5′-CAGGACAAGAGTGGCTTCAT-3′、下游引物序列为：5′-GAAGTTCTGCAGGAACAGCTT-3′；

其中TaqMan-MGB探针中间部位有一个简并碱基，序列为：5′-AGGAGGA(T/G)GAGCT-3′；

其中上游引物、下游引物、TaqMan-MGB探针的体积比为：1∶1∶1；

其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。

(2)阳性对照DNA

上面所述PCR扩增反应液A，每管24μL的最佳组成为：2.5μL 10×PCR反应缓冲液、2μL 2.5mmol/LdNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、2μL 25mmol/L硫酸镁、1μL 10μmol/L上游引物、1μL 10μmol/L下游引物、1μL 10μmol/LTaqman-MGB探针、0.2μL UNG酶、0.3μL Taq酶、14μL ddH₂O(灭菌双蒸水)。

使用上述试剂盒检测食品中鱼类过敏原的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)：

(1)待检样品DNA的提取

DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。

(2)鱼类过敏原的实时荧光PCR扩增

A.在装有24μL PCR扩增反应液A的反应管中加入1μL待检样品DNA，混匀。

B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

50℃ 2min，1个循环，激活UNG酶；

94-95℃ 4min，1个循环，灭活UNG酶，预变性；

94-95℃ 10-20sec；60℃ 20-40sec，45个循环，PCR扩增。

(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。

如待测样品出现扩增曲线，且Ct值小于或等于41，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品检出过敏原蛋白。

如待测样品Ct值大于或等于45，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品未检出过敏原蛋白。

如待测样品Ct值在41-45之间，应重作实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于45，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品检出过敏原蛋白；再次扩增后的结果Ct值大于45，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品未检出过敏原蛋白。

本发明建立了鱼类过敏原的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。本试剂盒根据鱼类小清蛋白基因的保守序列，设计了一组特异性引物和一条特异性Taqman-MGB探针。该保守基因序列通过对Genebank登录的各鱼种小清蛋白的核酸序列的比对获得，可保证不同鱼种过敏原蛋白的检出。本发明采用实时荧光PCR技术，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，特别适用于一些成分复杂，受食品基质和加工工艺影响，较难检出过敏原蛋白本身的食品中鱼类过敏原的检测。

附图说明

图1用实时荧光PCR技术检测某待测鱼丸样品DNA，样品的扩增曲线。

图2用实时荧光PCR技术检测某待测鱼松样品DNA，样品的扩增曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

按下列配方制作鱼类过敏原的实时荧光PCR检测试剂盒：

包括10×PCR反应缓冲液、0.2mmol/L dNTP(含dUTP)、2mmol/L硫酸镁、0.2U UNG酶、1.5UTaq酶、0.4μmol/L上游引物5′-CAGGACAAGAGTGGCTTCAT-3′、0.4μmol/L  下游引物5′-GAAGTTCTGCAGGAACAGCTT-3′、0.4μmol/L Taqman-MGB探针5′-AGGAGGA(T/G)GAGCT-3′；

其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X-100；

其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。

按照以下程序进行检测：

(1)待测鱼丸样品DNA的提取

A.称取0.5g鱼丸，剪碎，转至1.5mL离心管中。加入500μL抽提裂解缓冲液(0.05M Tris-HCL(三羟基甲基氨基甲烷-盐酸)、0.1M EDTA(乙二胺四乙酸)、0.2M氯化钠、pH值7.6灭菌双蒸水)，充分振荡；

B.加入蛋白酶K 60μL，10％SDS 2μL，颠倒混匀。57℃水浴10h至原料消化为清液，4000rpm离心2min，取上清；

C.加入500μL等体积的Tris-酚，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min，取上清；

D.重复上步；

E.在上清液中加入Tris-酚、氯仿和异戊醇(体积比为25∶24∶1)，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min，取上清；

F.在上清液中加入氯仿和异戊醇(体积比为24∶1)，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min，取上清；

G.加入两倍体积无水乙醇，1/5体积的醋酸钠(4M)，颠倒混匀10min，沉淀DNA；12000rpm离心10min，弃上清；

H.加入600μL乙醇(70％)洗涤DNA，离心弃上清，开盖，晾干；

I.加入100μL灭菌双蒸水溶解DNA。

(2)待测鱼丸DNA的实时荧光PCR扩增

A.在PCR反应管中加入24μLPCR反应液A和1μL样品DNA，混匀。

B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

50℃ 2min，1个循环，激活UNG酶；

94℃ 4min，1个循环，灭活UNG酶，预变性；

94℃ 30sec；60℃ 30sec，45个循环，PCR扩增。

(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。

样品出现阳性扩增曲线，Ct值为23.5，见图1。阴性对照、阳性对照和空白对照结果均正常，据此可判定该样品检出过敏原蛋白。

实施例2

按下列配方制作鱼类过敏原的实时荧光PCR检测试剂盒：

包括10×PCR反应缓冲液、0.2mmol/L dNTP(含dUTP)、2mmol/L硫酸镁、0.2U UNG酶、1.5U Taq酶、0.4μmol/L上游引物5′-CAGGACAAGAGTGGCTTCAT-3′、0.4μmol/L下游引物5′-GAAGTTCTGCAGGAACAGCTT-3′、0.4μmol/L Taqman-MGB探针5′-AGGAGGA(T/G)GAGCT-3′；

其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X-100；

其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。

按照以下程序进行检测：

(1)待测鱼松样品DNA的提取

A.称取0.5g鱼松，剪碎，转至1.5mL离心管中。加入500μL抽提裂解缓冲液(0.05M Tris-HCL(三羟基甲基氨基甲烷-盐酸)、0.1M EDTA(乙二胺四乙酸)、0.2M氯化钠、pH值7.6灭菌双蒸水)，充分振荡；

B.加入蛋白酶K 60μL，10％SDS 2μL，颠倒混匀。57℃水浴10h至原料消化为清液，4000rpm离心2min，取上清；

C.加入500μL等体积的Tris-酚，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min，取上清；

D.重复上步；

E.在上清液中加入Tris-酚、氯仿和异戊醇(体积比为25∶24∶1)，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min，取上清；

F.在上清液中加入氯仿和异戊醇(体积比为24∶1)，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min，取上清；

G.加入两倍体积无水乙醇，1/5体积的醋酸钠(4M)，颠倒混匀10min，沉淀DNA；12000rpm离心10min，弃上清；

H.加入600μL乙醇(70％)洗涤DNA，离心弃上清，开盖，晾干；

I.加入100μL灭菌双蒸水溶解DNA。

(2)待测鱼松DNA的实时荧光PCR扩增：

A.在PCR反应管中加入24μLPCR反应液A和1μL样品DNA，混匀。

B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

50℃ 2min，1个循环，激活UNG酶；

94℃ 4min，1个循环，灭活UNG酶，预变性；

94℃ 20sec；60℃ 30sec，45个循环，PCR扩增。

95℃ 15sec；60℃ 20sec；95℃ 15sec，1个循环，测定熔点曲线。

(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。

样品出现阳性扩增曲线，Ct值为25.8，见图2。阴性对照、阳性对照和空白对照结果均正常，据此可判定该样品检出过敏原蛋白。

核苷酸序列表