通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法

摘要

本发明涉及一种通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法，包括1)：底物+草酸脱羧酶+醋酸缓冲溶液，30－37℃，反应0.5－1h；2)配制pH 7.3～8.5的含磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、NADH、苹果酸脱氢酶的Tris－HCl缓冲液，30－37℃，温育，380nm处测A1；3)在步骤2)中添加步骤1)反应液，30－37℃反应，380nm处测A2；4)根据ΔA380nm＝A1－A2计算NADH减少量，再根据反应原理计算生成二氧化碳的浓度，从而计算草酸脱羧酶的活力。本方法可靠，灵敏度高，与测定草酸脱羧酶的经典方法所测值相近，是一种很好的测定草酸脱羧酶酶活的方法。

说明书

技术领域

本发明属于草酸脱羧酶活力的测定方法，特别是涉及一种通过测定酶反应产物二氧化碳浓度来确定草酸脱羧酶活力的方法。

背景技术

目前草酸脱羧酶活力的测定方法主要有HPLC法、分光光度法、测压法等。酶的活性可以通过测定底物草酸分解产生的甲酸的量、二氧化碳的量或者草酸分解减少的量得到。甲酸的测定可以用HPLC或甲酸脱氢酶法，二氧化碳的测定可以通过测压计测定，草酸的测定可以通过HPLC或草酸氧化酶法测定。HPLC方法主要是对仪器和样品的要求比较高，不利于推广；酶法测定中的草酸氧化酶因为产率较低，售价昂贵，也不利于进一步推广。

1980年Beutler等人以草酸为底物，加入氧化型辅酶I(NAD⁺)以及甲酸脱氢酶，用紫外分光光度法在340nm处测定其吸光值从而得到甲酸的量。经过许多学者的改进，现在的经典方法如下具体所述：

(1)在0.3mL 0.2M醋酸缓冲液(pH 5.6)中加入0.1mL 50mM的草酸溶液和0.1mL(v)的草酸脱羧酶液，反应液最终pH为3.0，37℃条件下反应30min(T)；

(2)然后加入2mL氧化型辅酶I和0.3mL的去离子水，继续在30℃下反应2min，终止酶促反应，用紫外-可见光分光光度计在340nm处测定反应液的吸光值A₁；

(3)再加入0.2mL的甲酸脱氢酶(约5.27U/mL)，反应液最终体积(V)为3mL，在同样的温度下，反应30min，在340nm处测定反应液的吸光值A₂，得ΔA＝A₂-A₁；

(4)按照公式(2)计算草酸脱羧酶的酶活，一个酶活单位定义为在30℃pH 3.0，一个大气压下，每分钟生成1μmol甲酸的量。体积酶活单位为U/mL。

公式(2)

V——最终体积(mL)

T——反应时间(min)

v——待测粗酶液体积(mL)

d——光路直径(cm)

ε₂——NADH在340nm处的吸收系数(6.3L·mmol^-1·cm^-1)

这种方法简便、精确度高，是目前测定草酸脱羧酶的经典方法。但这种方法存在耗时长、成本高的缺点，如第二步添加甲酸脱氢酶后的酶反应时间需要半小时，较耗费时间；所用的甲酸脱氢酶由于产量低等原因，价格昂贵，使测定草酸脱羧酶活力的成本大大增加。因此大家都在寻找一种能替代这种经典方法，且耗时短、价格较便宜、精确度与该方法相近的测定草酸脱羧酶活力的方法。

由草酸脱羧酶的催化反应可以知道该酶活性也可以通过测定其反应产物二氧化碳的量来得到。二氧化碳的测定可以利用测压计法和酶法。测压计法繁琐，且对仪器要求高，而酶法是一发展方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法，该法通过测定酶反应产物二氧化碳的浓度的变化得到草酸脱羧酶活力，这种测定方法与经典方法相比，精确度相近，耗时短，价格相对便宜，有很好的实用性。

本发明的一种通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法，包括步骤：

(2)第一步酶催化反应体系——草酸脱羧酶催化降解草酸生成甲酸和二氧化碳

空白组：混合0.3mL 200mM醋酸缓冲液、0.1mL 50mM草酸和0.1mL处理失活(沸水浴15min-20min)的草酸脱羧酶酶液

待测样品组：混合0.3mL 200mM醋酸缓冲液、0.1mL50mM草酸和0.1mL待测草酸脱羧酶酶液底物(v)

第一步酶催化反应体系总体积(V₂)为0.5mL，反应pH为3.0～3.7，反应温度为30～37℃，反应时间(T)为30～60min；

(2)第二反应体系

空白组和待测样品组都为：1.0mL CO₂试剂，其CO₂试剂的组成为8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mM还原型辅酶I(NADH)、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和200-300U/L的苹果酸脱氢酶的Tris-HCl缓冲液(pH 7.3～8.5)；

第二反应体系在30～37℃温育5～10min，380nm条件下测定A₁；

(3)第三反应体系

空白组：混合1.0mL CO₂试剂和0.01～0.1mL上述第一步酶反应空白组液(V₃)

待测样品组：混合1.0mL CO₂试剂和0.01～0.1mL上述第一步酶反应待测样品组液(V₃)

第三反应体系总体积(V₁)为1mL+V₃，30～37℃，5～10min，pH 7.3～8.5，380nm下测定A₂，计算ΔA＝A₁-A₂；

(4)计算草酸脱羧酶活力(U/mL)

一个酶活单位定义为在30～37℃，pH 3.0～3.7，一个大气压下，每分钟生成1μmol二氧化碳的量。体积酶活定义为每mL草酸脱羧酶酶液中的酶活力单位数，体积酶活单位为U/mL。

公式(1)

其中，ΔA_380nm＝ΔA_样品-ΔA_空白

V₁——最后的反应液总体积(mL)

T——第一步草酸脱羧酶反应时间(min)

v——待测酶液样品体积(mL)

V₂——第一步酶反应液总体积(mL)

V₃——参加第三步反应的酶反应液体积(mL)

d——比色皿光路直径(cm)

ε₁——NADH在380nm处的吸收系数(1.33L·mmol^-1·cm^-1)

本方法通过分光光度在380nm波长下检测NADH浓度的变化计算二氧化碳的浓度，从而计算草酸脱羧酶的酶活力，第三步反应中加入的第一步酶反应液的体积可以随待测样品酶活力的变化而改变。

本发明的测定原理是采用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)催化碳酸氢盐和烯醇式丙酮酸反应，生成草酰乙酸和磷酸；草酰乙酸在苹果酸脱氢酶(MDH)的催化下还原成苹果酸，同时还原型辅酶I(NADH)被氧化成NAD，通过在380nm波长出测定吸光度的变化值，即可测得样品中二氧化碳的浓度，进而计算草酸脱羧酶活力(见图1)。

本发明的有益效果：

(1)利用烯醇式丙酮酸和苹果酸脱氢酶系测定二氧化碳浓度，较简便，相对缩短了第二步的反应时间(5min，甲酸脱氢酶方法需要30min)；

(2)价格相对经典方法便宜几十倍，精确度与经典方法相近。

附图说明

图1是测定草酸脱羧酶活力的原理和步骤简图；

图2是本方法与经典方法测定结果的比较，图中显示本方法结果与经典方法结果相近，精确度较高，每组结果均为三次测量值的平均值。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                            实施例1

按照下表1，进行实验。

                                表1

[1]、CO₂试剂的组成：8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mM NADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和200-300U/L的苹果酸脱氢酶，Tris-HCl缓冲液，pH 8.0。

[2]、参见公式(1)。

计算：

                      实施例2

按照下表2，进行实验。

                        表2

[1]和[2]见实施例1。

计算：

                      实施例3

按照下表3，进行实验。

                    表3

[1]和[2]见实施例1。

计算：