一种用于治疗或预防由高脂血症和/或高血压引起的勃起功能不全症的药物组合物

摘要

本发明提供了一种用于治疗或预防由高脂血症和/或高血压引起的勃起功能不全症的药物组合物，其含有干燥重量比为5～10∶5～10∶1～5∶1～5∶0.5～1.5的山茱萸热水提取物、枸杞子热水提取物、覆盆子热水提取物、菟丝子热水提取物及五味子热水提取物。

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种用于治疗或预防由高脂血症和/或高血压引起的勃起功能不全症的药物组合物。

【背景技术】

近来，饮食生活的变化、环境污染以及过度的压力等很大程度上改变了疾病的发生率以及死亡原因，以心肌梗塞或脑中风为代表的心血管类疾病日益增加。到现在为止，虽然已知有多种病态生理能诱发勃起功能不全症，但其中，已知血管性病态生理是引起勃起功能不全症的最重要因素。

高血压、冠状动脉疾病、动脉及静脉疾病、骨盆损伤或高脂血症等均是影响血管系统的疾病及勃起功能不全症的危险因素。10名患有血管类疾病的男性中的8名、3名患有心脏病的患者中的2名、接受过冠状动脉旁路手术的患者中的半数以上均出现勃起功能不全症。在多种情况中，25％患有勃起功能不全症的男性与其服用的药物有关，还显示高血压药物服用者中有14％的勃起功能不全症患病率，肾脏药物的服用者中有28％的勃起功能不全症患病率。此外，已有报告50岁以上的男性中出现勃起功能不全症的一半人都是由血管类疾病诱发的。

心血管系疾病的3代危险因素之一的高脂血症是出现血中胆固醇或中性脂肪非正常升高的状态，是受到例如西欧化的饮食、压力、运动不足等环境要素以及遗传要素影响的多因素疾病。已有报告血管性勃起功能不全症患者出现的脂质代谢障碍是高胆固醇血症的越来越多，两者之间具有密切关系(参见非专利文献1)。高脂血症是心血管疾病、血管性勃起功能不全症的主要危险因素，已知其原因是阴茎海绵体平滑肌的内皮依存性松弛反应障碍及平滑肌细胞自身的变形引起了勃起功能不全症。

高血压将由于血管内皮细胞、血管平滑肌及细胞外基质的变化而增加末梢血管的抗力。高血压是成人最常出现的心血管系疾病，是勃起功能不全症的危险因素之一，已显示30％的高血压患者患有勃起功能不全症。因此，勃起功能不全的程度与高血压的程度及诱发期间成一定比例(参见非专利文献2)。高血压诱发勃起功能不全症的机制是流向阴茎的动脉血流减少，这可用心理因素及抗高血压剂的影响来解释。在诱发了高血压的动物阴茎组织的病理学变化中，出现了阴茎海绵体内皮细胞与平滑肌细胞损伤及增殖、骨胶原沉着、阴茎海绵体白膜弱化等。此外，在其机能的变化中，还出现一氧化氮(NO)活性減少、氧化压力增加、平滑肌收缩增加、神经因性NO依存性阴茎海绵体松弛力減少等(参见非专利文献3及非专利文献4)。

一氧化氮(NO)具有扩张血管作用、抗凝固作用、抗氧化作用、抗炎作用等，是维持血管恒久性的最重要部分。因此，血管内皮中产生NO的NOS(一氧化氮合酶)的减少、游离基的增加时将出现产生的NO是不活化的等，使NO的生理活性降低，结果是导致出现动脉粥样硬化。NO最重要的任务是松弛阴茎海绵体，对与勃起功能不全相关的高龄老化、动脉粥样硬化、高血压及糖尿病等疾病模型的研究結果显示：勃起功能不全症的原因是以NO作用产生的非肾上腺素性-非胆碱性阴茎海绵体平滑肌松弛障碍、NOS活性減少、阴茎内NOS表达障碍为表征示出的NO生理活性的减少。因此，高脂血症、高血压及勃起功能不全症的治疗共通点是找到能提高NO生物利用度的物质。

现在，勃起功能不全症治疗剂是起到与cGMP(环磷酸鸟苷)竞争反应的物质作用的合成衍生物，通过阻断PDE-5(5型磷酸二酯酶)单一通路来增加阴茎海绵体内的cGMP浓度。由于不具有兴奋性神经系统的活性，换句话说由老化及内分泌系疾病导致nNOS基因表达减少或被抑制，而无法增加阴茎海绵体平滑肌内cGMP浓度，因此抑制了PDE-5的酶活性或无法出现阴茎勃起的效果。更具体地说，治疗剂的概念是与QOL(生活质量(Quality Of Life))制品的概念(虽然不与生命直接相关，但用于治疗使生活不便的症状而有助于使生活更加丰富的药物)相近似的药物，仅仅在必要时服用可维持阴茎勃起的治疗剂。此外，虽然已经报告了这种化学合成的单一物质具有心肌梗塞、心功能不全、血压降低、脑梗塞、面色潮红、视力减退等副作用，但由于全世界对勃起功能不全症治疗剂的迫切需求，它仍然被很频繁地使用。

虽然将丙酮酸衍生物、烟酸衍生物、スタチン系衍生物等药物用作高脂血症治疗剂，但是长时间服用将诱发消化不良、肝毒性、肌肉痛、横纹肌变性、光过敏等副作用，必须慎重使用，因此希望通过减少副作用来提高药物的稳定性。

虽然在临床上将硝苯地平(nifedipine)与卡托普利(captopril)用作高血压治疗剂，但是，由于这些药物的毒性与药效的无效率性，希望开发一种新形态的抗高血压剂。

另一方面，通过对经口服用勃起功能不全症治疗剂的高脂血症患者、高血压患者进行研究，不仅仅完成了通过改善病症来治疗勃起功能不全症的研究报告也完成了针对药物的有效性和副作用的研究报告。此外，虽然现在市售的经口服用的勃起功能不全治疗剂在需要的时候服用后能获得一次性及强制性的勃起效果，但是无法使其恢复到自然勃起的效果。

因此，有必要研发一种在对高脂血症、高血压的个别病症有所改善的同时，即使通过慢性给药来维持勃起功能也可能完全没有副作用的药物。

【非专利文献1】Juenemann KP，Aufenanger J，Konrad T，Pill J，Berle B，Persson-Juenemann C.1991.The effect of impaired lipid metabolism on the smoothmuscle cells of rabbits.Urol Res.19：24-28

【非专利文献2】Burchardt M，Burchardt T，Baer L，Kiss AJ，Pawar RV，ShabighA，de la Taille，Hay OR，Shabsigh R.Hypertension is associated with severeerectile dysfunction.J Urol 2000；164：1181-91

【非专利文献3】Behr-Roussel D，Gorny D，Mevel K，Compa gnie S，Kern P，SivanV，Bernabe J，Bedigian MP，Alexandre L，Giuliano F.Erectile dysfunction：anearly marker for hypertension，A longitudinal study in spontaneouslyhypertensive rats.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005；288：R276R283

【非专利文献4】Toblli JE，Stella I，Inerra F，Ferder L，Zeller F，MazzaON.Morphologicai changes in cavernous tissue in spontaneously hypertensive rats.Am J Hypertension 2000；13：68692

【发明内容】

【发明要解决的问题】

因此，本发明人潜心研究没有副作用且经过慢性给药能维持勃起功能的，可有效治疗由高脂血症和/或高血压引起的勃起功能不全症的药剂，确认特定比例配比的山茱萸热水提取物、覆盆子热水提取物、菟丝子热水提取物、枸杞子热水提取物及五味子热水提取物的组合物可减少血中总胆固醇及LDL-胆固醇、增加HDL-胆固醇、降低血压、增加神经系统及血管系统NOS蛋白质的表达、增加最大海绵体内压，由此完成了本发明。

本发明的目的是提供一种用于治疗或预防由高脂血症和/或高血压引起的勃起功能不全症的药物组合物。

【解决问题的技术手段】

为了达到上述目的，依据本发明，提供了一种治疗或预防由高脂血症和/或高血压引起的勃起功能不全症的药物组合物，其含有干燥重量比为5～10∶5～10∶1～5∶1～5∶0.5～1.5的山茱萸热水提取物、枸杞子热水提取物、覆盆子热水提取物、菟丝子热水提取物及五味子热水提取物。

【发明效果】

依据本发明的复合中药热水提取物将减少血中总胆固醇与LDL-胆固醇，增加HDL-胆固醇，降低血压，增加神经系统及血管系统NOS蛋白质的表达，增加最大海绵体内压，不仅具有维持单纯性阴茎勃起的治疗效果，在提高身体NO生物利用度的同时，还可调节伴随有高脂血症和/或高血压的全部病态生理，维持自然勃起的功能。因此，依据本发明的复合中药热水提取物可有效用于治疗或预防由高脂血症和/或高血压引起的勃起功能不全症。

【附图说明】

【图1】示出依据本发明的复合中药热水提取物的浓度与诱发了高脂血症的小白鼠血中总胆固醇、HDL-胆固醇及LDL-胆固醇的数值的关系图。

【图2a】示出依据本发明的复合中药热水提取物及单独中药热水提取物与诱发了高脂血症的小白鼠阴茎组织内蛋白质NOS的表达程度的关系图。

【图2b】示出依据本发明的复合中药热水提取物的浓度与诱发了高脂血症的小白鼠阴茎组织内蛋白质NOS表达程度的关系图。

【图3】示出依据本发明的复合中药热水提取物的浓度与诱发了高脂血症的小白鼠阴茎海绵体最大内压的关系图。

【图4】示出依据本发明的复合中药热水提取物的浓度与诱发了高血压的小白鼠血压变化的关系图。

【图5a】示出依据本发明的复合中药热水提取物及单独中药热水提取物与诱发了高血压的小白鼠阴茎组织内蛋白质NOS的表达程度的关系图。

【图5b】示出依据本发明的复合中药热水提取物的浓度与诱发了高血压的小白鼠阴茎组织内蛋白质NOS的表达程度的关系图。

【图6】示出依据本发明的复合中药热水提取物的浓度与诱发了高血压的小白鼠阴茎海绵体最大内压的关系图。

【具体实施方式】

以下，从中药方面详细说明本发明组合物的组成成分。

山茱萸是山茱萸科落叶小乔木山茱萸果实的干燥果肉，味酸，性温，可用于精血亏虚症或肾阳不足症。此外，还有降低高血压及血糖作用、消炎抗菌作用及保护肝肾的效果。山茱萸提取物中含有熊果酸(ursolic acid)、スズ酸、苹果酸以及其他四种葡糖苷(glucoside)等。熊果酸是具有抗糖尿病活性的脂溶性物质；4种葡糖苷是莫诺苷(morroniside)、马钱素(loganin)、獐牙菜苷(sweroside)、甲基莫诺苷(methylmorroniside)(Lee YC，Kim YE，Lee BY，Kim CJ.Chemical Compositions ofCorni Fructus and Separating Properties of Its Flesh by drying.Korean J FoodSci Technol 1992；24：447-50)。此外，已知山茱萸的齐墩果酸-3-O-单锁链素(oleanolic acid 3-O-mono desmosides)具有抑制葡萄糖吸收的机能(Matsuda H，Murakami T，Shimada H，Matsumura N，yoshikawa M，Yamahara J.Inhibitorymechanisms of oleanolic acid 3-O-mono desmosides on glucose absorption in rats.Biological and Pharmaceutical Bulletin 1997；20：717-9)。

枸杞子是落叶灌木，高可达2.5m，枝头下垂，短枝上有刺，长枝下部丛生有2-3片叶。它具有改善糖尿病、恢复疲劳、防止老化、降脂、保护肝功能以及抗癌抗菌等作用。已知枸杞子中含有的类黄酮类芦丁(rutin)具有维持毛细血管正常抗力且降低血管通透性的机能，对人体内毛细血管具有强化作用和收缩作用，因此可作为循环系统疾病的治疗剂、抗糖尿病活性剂、降血压剂等(Kim HS，Park YS，Kim CI.Changes of SerumLipid Profiles after Eating Lycii Fructus in Rats Fed High Fat Diet.Korean JNutr 1998；31：263-70)。

覆盆子是蔷薇科落叶灌木徳利苺的未成熟干燥果实，味酸，性温，具有保护肝肾的作用。東医宝監中记载覆盆子性平，无毒，味酸，固精、补肝明目、补肾气、乌黑头发。此外，最近的研究证明其具有改善肾脏机能、不孕症、阳痿、遗精及梦遗，强身健体，清涤血液，补肝明目的效果。此外，徳利苺未成熟果实加水分解性单宁中可分离出1种单宁酸(gallotannin)及3种鞣花单宁(ellagitannin)，理化性状及光谱数据还报告具有没食子酸、2，3-(S)-HHDP-D-吡喃葡糖、地榆素(sanguiin)H-4及地榆素H-6。在覆盆子中，确认其成分中没食子酸等酚性化合物对酶的脂质及氧化有较强的抑制活性。酚性化合物广泛分布于食品类的2次代谢产物中，具有多种结构及分子量。此外，由于具有酚羟基，因此具有与蛋白质等大分子结合的性质，具有抗氧化效果、抗菌性、消除亚硝酸盐等生理活性机能。

菟丝子是旋花科1年生寄生草本菟丝子及同属植物的干燥种子，味辛甘，性平，具有抗癌、强心、降血压及降血糖、保护肾脏和脾脏的作用。東医宝監中记载“提神，补气，对腰膝酸软症有较好效果，煎后随时服用还对糖尿病有效。”《神农本草经》中记载“可补多种不足症，补肾固精。长期服用可明目、长寿。”此外，还报告其含有阻碍乙酰胆碱酯酶活性提高记忆力的多种抗氧化物质(Lue SY，Park YG，Kang BS.Studies onthe Acetylcholinesterase inhibitors Effects of Cuscutae Semen.Kor J Herbology2003；18：289-99.)。

五味子是木兰科五味子的干燥成熟果实，具5味，具有护肝作用、抗老化作用、抗菌作用、调整代谢及免疫机能的作用(Park HJ，Lee MS，Chi SC，Lee KT，Shin YH，ChoiJ.Evaluation of a Schzandrin C Derivative DDB-mixed Preparation(DWP-04)onAcetaminophen Detoxification Enzyme System in the Animal Model.Kor J Pharmacogn2005；36：81-7)。

虽然本发明的中药提取物是利用本领域技术人员已知的中药提取方法例如用水、醇或这两种的混合溶剂提取、水煎或常温提取等制得的，但并不限于此。

首先，洗净山茱萸、枸杞子、覆盆子、菟丝子及五味子，除去杂质，干燥后精细粉碎。将粉碎的山茱萸、枸杞子、覆盆子、菟丝子及五味子混合后，加水沉淀，将沉淀出的沉淀物放入提取器中，加热提取，过滤。用减压浓缩器将滤液浓缩成滤液1/10的体积后，冷冻干燥，获得粉末状复合中药热水提取物。

对诱发了高脂血症的实验动物经口给予本发明的复合中药热水提取物(50、100、200、300mg/kg)8周后，测定血中胆固醇、HDL-C及LDL-C等，并测定对脂质代謝有影响的用量，此外，为了考察其对促进阴茎勃起及持续性的影响，用蛋白质印迹法观察NOS蛋白质的表达程度，测定最大海绵体内压。结果是：给予本发明的复合中药热水提取物的全部给药组与高脂肪日常饮食组相比，总胆固醇与LDL-C的数值降低，HDL-C的数值升高，eNOS及n-NOS蛋白质的表达增多，达到最大海绵体内压的平均时间缩短，最大海绵体内压(ICP)的数值也增大。

此外，对自发性高血压雄性小白鼠经口给予本发明的复合中药热水提取物(100、300mg/kg)4周后，测量血压、NOS蛋白质的表达度及最大海绵体内压。结果是：在给予本发明的复合中药热水提取物的给药组中，血压的收缩压有显著降低(p＜0.05)，阴茎组织内的蛋白质eNOS及nNOS的表达度与对照组相比显著增加，最大海绵体内压也增大。

如上所述，本发明的复合中药热水提取物可减少血中总胆固醇与LDL-胆固醇，增加HDL-胆固醇，降血压，增加神经系及血管系统NOS蛋白质的表达，增加最大海绵体内压，不仅具有维持单纯性阴茎勃起的治疗效果，在提高身体NO生物利用度的同时，还可调节伴随有高脂血症及/或高血压的全部病态生理，维持自然勃起功能。

因此，本发明的复合中药热水提取物可用于治疗或预防由高脂血症和/或高血压引起的勃起功能不全症。

本发明组合物在含有复合中药热水提取物的同时还可含有一种以上公知的对由高脂血症和/或高血压引起的勃起功能不全症有预防或治疗效果的有效成分。

本发明的组合物在进行给药时，可与上述有效成分之外的至少一种制药学上允许的载体一起制得。制药学上允许的载体可使用食盐水、灭菌水、林格式溶液、缓冲盐水、右旋糖溶液、マルト糊精溶液、甘油、甲醇及其混合物，如果必要的话还可加入其他常规的添加剂，例如抗氧化剂、缓冲液、灭菌剂等。此外，还可额外地加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂及润滑剂制成水溶液、混悬液、乳浊剂等注射用剂型、丸、胶囊、颗粒或锭剂。或者，用本领域的适当方法或文献[Remington’s PharmaceuticalScience(最新版)、Mack Publishing Company、Easton PA]示出的方法根据各种疾病或成分的不同而制成适宜的剂型。

本发明的组合物可根据目的而采用经口给药或非经口给药(例如、静脉内、皮下、腹腔内或局部适用的)的方式，给药量可根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、日常饮食、给药时间、给药方法、排泄率及疾病的重症程度等出现不同的范围。上述复合中药热水提取物的1日给药量是约1～500mg/kg，优选约50～300mg/kg，此外还优选1日1次或数次分开给药。

本发明的组合物在用于治疗或预防由高脂血症和/或高血压引起的勃起功能不全症时可单独使用或与手术、激素治疗、药物治疗及利用生物学反应调节剂的方法合并使用。

以下示出了有助于理解本发明的优选的实施例。为了使本发明更易于理解提供了下述实施例，但本发明的内容并不限于此。

实施例1：复合中药热水提取物的制备

洗净山茱萸、枸杞子、覆盆子、菟丝子及五味子，除去杂质，干燥后，手工(hand mixer)精细粉碎。混合粉碎后的山茱萸32g、枸杞子32g、覆盆子16g、菟丝子16g及五味子4g，加入1L水，沉淀4小时后，将完全沉淀的沉淀物填充入提取器中，100℃时加热提取5小时后，过滤。用减压浓缩器将滤液浓缩成滤液1/10体积的液体，冷冻干燥，得到粉末状复合中药热水提取物。

对照例1：单味中药热水提取物的制备

用实施例1的相同方法分别提取山茱萸、枸杞子、覆盆子、菟丝子及五味子，获得各种粉末状单味中药热水提取物。

实验例1：用诱发了高脂血症的小白鼠测定血中总胆固醇、HDL-胆固醇及LDL-胆固醇与本发明的复合中药热水提取物浓度的关系

为了调查诱发高脂血症的小白鼠血中总胆固醇、HDL-胆固醇及LDL-胆固醇的数值与本发明的复合中药热水提取物的浓度关系，如下所述进行实验。

1-1.日常饮食性高脂血症的诱导以及样品的给药

实验动物是(株)SAMTAKOバイオ(乌山市、韩国)提供的16周龄的360g小白鼠48只，将其分成6组，每组8只。1组作为正常组，供给一般的日常饮食，另5组实验组自由供给添加了1.5％胆固醇、0.25％胆酸及25％牛脂的高脂肪日常饮食4周，来诱导日常饮食性高脂血症。

正常组给予1mL蒸馏水，实验组中的1组给予1mL蒸馏水，剩余4组用注射器(注射ゾンデ)在8周内一日一次经口给予溶解了上述实施例1制得的复合中药热水提取物(50、100、200、300mg/kg)的1mL蒸馏水。

1)正常组

2)高脂肪日常饮食组

3)高脂肪日常饮食组+实施例1制得的复合中药热水提取物50mg/kg

4)高脂肪日常饮食组+实施例1制得的复合中药热水提取物100mg/kg

5)高脂肪日常饮食组+实施例1制得的复合中药热水提取物200mg/kg

6)高脂肪日常饮食组+实施例1制得的复合中药热水提取物300mg/kg

1-2.血中总胆固醇、HDL-胆固醇及LDL-胆固醇的测定

为了确定上述高脂肪日常饮食饲养的小白鼠是否诱发了高脂血症，从眼窝静脉取血，实验完了后从小白鼠腹部大动脉取血。12小时绝食后取血、37℃时凝固2小时，15000rpm离心分离血清后，取上清液。用市售试剂盒(Kit)(ASAN制药、韩国)在UV吸光度500nm时通过Richmon酶法测定胆固醇，通过Noma等酶法测定高密度脂质胆固醇(HDL-C)。根据Fridewald formula式子计算低密度脂质胆固醇(LDL-C)。

低密度脂质胆固醇(LDL-C)＝总胆固醇-[高密度脂质胆固醇(HDL-C)-(中性脂肪/5)]

图1示出了结果。

如图1所示，在摄取高脂肪日常饮食30天时，正常组与高脂肪日常饮食组的血中胆固醇浓度之间示出有显著差异，确认诱发了高胆固醇血症。对高脂肪日常饮食组经口给予本发明的复合中药热水提取物(50、100、200、300mg/kg)8周，示出高脂肪日常饮食组的总胆固醇及LDL-C数值有减少的趋势，以及HDL-C数值有增加的趋势。其中，给予本发明的复合中药热水提取物50mg/kg组的总胆固醇是104.5±32mg/dL，高脂肪日常饮食组的总胆固醇是174.2±38.1mg/dL，示出给予本发明的复合中药热水提取物50mg/kg的给药组与高脂肪日常饮食组相比有显著的减少。此外，给予本发明的复合中药热水提取物50mg/kg的给药组的HDL-C是29.7±4.9mg/dL，高脂肪日常饮食组的HDL-C是15.5±8.4mg/dL，给予本发明的复合中药热水提取物50mg/kg的给药组与高脂肪日常饮食组相比有显著的增加。

实验例2：诱发了高脂血症的小白鼠的阴茎组织内蛋白质NOS的表达程度与本发明的复合中药热水提取物浓度的关系

为了调查诱发了高脂血症的小白鼠阴茎组织内蛋白质NOS的表达程度与本发明的复合中药热水提取物浓度的关系，如下所述进行实验。

2-1.组织的采取及酶源的制备

饲养结束后，用填充了乙醚的干燥器使小白鼠麻醉后，切开下腹部从腹部大动脉取血，使之死亡后，摘出阴茎和睾丸。将摘出的组织在0.9％生理食塩水中洗去血液，用滤纸吸去盐溶液，称重后，立即用液氮急速冷冻。另一方面，将取得的血液立即转移到肝素处理的管内，在2500rpm(4℃)时离心分离15分钟，分离血浆。将分离的血浆和脏器在使用前于-70℃保存。在200nM Hepes、320mM蔗糖、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1mM二硫苏糖醇(DTT)、10g/mL亮肽素、2g/mL抑肽酶、1g/mL胃蛋白酶抑制剂、10g/mL胰蛋白酶抑制剂、1mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)溶液中使组织内酶源均质化后，离心分离(4℃、10000rpm、15分钟)，蛋白质定量后将上清液于-70℃保存。

2-2.蛋白质印迹法(Western blotting)

用牛血清白蛋白(bovine serum albumin、BSA)根据布拉得福德(Bradford)方法定量的蛋白质30g在95℃时变性5分钟后、用12％不连续SDS-PAGE(discontinuous sodium dodecylsulfate)-聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)进行电泳。进行电泳的蛋白质在25volt下在0.2m聚偏(二)氟乙烯(PVDF(poly-vinylidenedifluoride)、Amershambioscience、USA)膜上移动2小时30分。进行电泳的膜是用抑制缓冲液(blocking buffer)(含有5％脱脂粉乳的TBS-T缓冲器)在室温中反应30分钟后阻断。使eNOS(内皮细胞一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase))、nNOS(神经源性一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase))(BD Biosciences、USA)各抗体反应2小时后，用TTBS(Tris-Tween缓冲的生理盐水(Buffered saline))每隔10分钟清洗3次。在室温中使2次抗体抗-小鼠IgG-HRP、抗-山羊IgG-HRP(1∶2000稀释)(Zymed Laboratories、USA)反应1小时后，经洗净阶段后再用TTBS5分钟洗6次。在显色剂ECL(增强化学发光法(enhanced chemiluminescence))溶液中反应2分钟，比较膜上感光出现的波段的厚度来确定有无表达蛋白质以及其差异。给高脂肪日常饮食组给予以麦酒蔵(ビアグラ)为主要成分的シルデナピル1mg/kg作为阳性对照组。

图2a示出了诱发了高脂血症的小白鼠阴茎组织内的蛋白质NOS的表达程度与本发明的复合中药热水提取物及单独中药热水提取物的关系，图2b示出了诱发了高脂血症的小白鼠阴茎组织内蛋白质NOS的表达程度与本发明的复合中药热水提取物的浓度的关系。

如图2a所示，可以确认将本发明的复合中药热水提取物给药于诱发了高脂血症的小白鼠，其阴茎组织内蛋白质NOS的表达较只给予单味中药热水提取物有显著增加。

此外，如图2b所示，可以确认将本发明的复合中药热水提取物给药于诱发了高脂血症的小白鼠，其阴茎组织内蛋白质NOS的表达与阳性对照组(シルデナピル)相比有显著增加。考虑到这种结果，シルデナピル将是能通过不仅仅增加NOS酶表达增加机制也增加cGMP的浓度来维持勃起功能的药物。此外，这种结果还可来解释依据本发明的复合中药热水提取物的多种机制。特别地，依据本发明的复合中药热水提取物的浓度越低，NOS酶的表达程度越好，其中50mg/kg给药组最为明显。虽然高脂血症及高胆固醇症可由于内皮细胞依存性松弛因子(EDRF)之一的一氧化氮生成体系的障碍而引起勃起功能不全症，但依据本发明的复合中药热水提取物可通过增加eNOS与nNOS蛋白质的表达程度，来很大程度地改善血管性勃起功能不全症。

实验例3：用诱发了高脂血症的小白鼠测定阴茎海绵体最大内压与本发明的复合中药热水提取物浓度的关系

为了调查诱发了高血脂症的小白鼠阴茎海绵体最大内压与本发明复合中药热水提取物浓度的关系，如下所述进行实验。

向诱发了高脂血症的小白鼠腹腔内注射ゾレチル(Zoletil)0.2mL将其全身麻醉后，切开气管插入气道管(PE240聚乙烯管)以确保气道。将聚乙烯管(PE-50聚乙烯管)插入右侧颈动脉后，切开下腹部至龟头表皮正中央的皮肤，露出腹腔至阴茎海绵体的皮下组织后，将23G针插入右侧阴茎海绵体中，聚乙烯管连接在压力转换器及生理记录器之间，同时测定全身血压和阴茎海绵体内压。用iwory作为电算数据处理系统，将整个管用250U/mL肝素进行处理。将前列腺从露出的下腹部至膀胱间小心剥离出后，将钩状的针电极悬挂在右侧前列腺后外部位置上，来电刺激骨盆神经丛及海绵体神经。10V、2.4mA电刺激后，同时测量海绵体内压及全身血压。与实验组进行比较的主要勃起功能指标是最大海绵体内压(intracavernosal pressure、ICP)和最大海绵体内压/平均动脉血压(ICP/mean arterial pressure、ICP/MAP)。神经刺激海绵体后，取血3cc，称量摘出的阴茎与睾丸的重量，液氮中保存。

图3示出了结果。

如图3所示，本发明的复合中药热水提取物给药组达到最大海绵体内压的平均时间与高脂肪日常饮食组相比有显著缩短，与正常组没有差异。示出了本发明的复合中药热水提取物给药组与高脂肪日常饮食组相比的最大海绵体内压(ICP)的增加，其中给药复合中药热水提取物50mg/kg组具有最显著差异。在最大海绵体内压/平均动脉血压(ICP/MAP)方面，按照正常组＞复合中药热水提取物50mg/kg给药组＞复合中药热水提取物100mg/kg给药组的顺序显著增加。因此，依据本发明的复合中药热水提取物实际上作用于阴茎内，这是表明其与勃起功能具有密切关系的直接证据。

实验例4：诱发了高血压的小白鼠血压变化与本发明的复合中药热水提取物浓度的关系

为了调查诱发了高血压的小白鼠的血压变化与本发明复合中药热水提取物浓度的关系，如下所述进行实验。

4-1.高血压的诱导及样品给药

实验动物是(株)SAMTAKOバイオ(乌山市、韩国)提供的16周龄的250～300g自发性高血压雄性小白鼠(spontaneous hypertensive rat、SHR)15只。将实验组分成3组(对照组、实验1组、及实验2组)，每1组中分有SHR小白鼠5只。对照组经口给予蒸馏水，实验组经口给予溶有根据上述实施例1制得的复合中药热水提取物(100、300mg/kg)的水4周。

4-2.血压的测定

将SHR雄性小白鼠装入塑料筒使之固定不动，在尾巴上用卷曲的电子血压計(electro-sphygmomanometer)PE-300(IITC、USA)血流测定器(plethysmography)测量药物给药前后的收缩压3次，比较平均值。

图4示出了结果。

如图4所示，对照组在药物给药前后的收缩压分别是254.3±14.5mmHg、237.7±24.8mmHg，没有显著差异。给予本发明的复合中药热水提取物100mg/kg的给药组在药物给药前后的收缩压分别是266.7±14.0mmHg、187.5±21.6mmHg，复合中药热水提取物300mg/kg给药组在药物给药前后的收缩压分别是271.8±23.9mmHg、178.0±14.6mmHg。如上所述，全部本发明的复合中药热水提取物给药组的收缩压均有显著降低(p＜0.05)。

实验例5：诱发了高血压的小白鼠阴茎组织内蛋白质NOS表达程度与本发明的复合中药热水提取物浓度的关系

为了调查诱发了高血压的小白鼠阴茎组织内蛋白质eNOS、nNOS的表达程度与本发明的复合中药热水提取物浓度的关系，用上述实验例2-2的蛋白质印迹法进行观察。

图5a示出诱发了高血压的小白鼠阴茎组织内蛋白质NOS的表达程度与依据本发明的复合中药热水提取物及单独中药热水提取物的关系，图5b示出诱发了高血压的小白鼠阴茎组织内蛋白质NOS的表达程度与依据本发明的复合中药热水提取物的浓度的关系。

如图5a所示，可确认将本发明的复合中药热水提取物给药于诱发了高血压的小白鼠，其阴茎组织内蛋白质NOS的表达程度较只单独给予单味中药热水提取物有非常显著的增加。

此外，如图5b所示，将本发明的复合中药热水提取物给药于诱发了高血压的小白鼠，其阴茎组织内蛋白质NOS的表达程度与对照组相比有显著增加，特别是复合中药热水提取物100mg/kg给药组的eNOS、nNOS表达程度有较大增加。我们发现，虽然复合中药热水提取物300mg/kg给药组的eNOS、nNOS表达程度与对照组相比有增加，但是与复合中药热水提取物100mg/kg给药组相比则降低了。

实验例6：用诱发了高血压的小白鼠测定阴茎海绵体最大内压与本发明的复合中药热水提取物浓度的关系

为了调查诱发了高血压的小白鼠阴茎海绵体最大内压与本发明的复合中药热水提取物浓度的关系，用上述实验例3的方法神经刺激海绵体后，记录结果。

图6示出了结果。

如图6所示，对照组的最大海绵体内压是27.1±4.5mmHg，给予本发明的复合中药热水提取物(100mg/kg、300mg/kg)的给药组的最大海绵体内压分别是83.3±1.9mmHg、55.0±4.6mmHg，给予本发明的复合中药热水提取物的给药组与全部的对照组相比在统计学上有显著增加(p＜0.05)。对照组最大海绵体内压/平均动脉压(ICP/MAP)的百分比是14.9±1.4％，给予本发明的复合中药热水提取物(100mg/kg、300mg/kg)的给药组的分别是62.8±3.9％、44.1±3.9％，给予本发明的复合中药热水提取物的给药组与全部对照组相比在统计学上有显著增加(p＜0.05)。给予本发明的复合中药热水提取物(100mg/kg、300mg/kg)的给药组之间没有显著差异。

接下来，例证性示出了本发明组合物的制剂例。

制剂例1：散剂的制备

实施例1的复合中药热水提取物    2g

乳糖                           1g

将上述成分混合，装入密封的布袋中，制得散剂。

制剂例2：锭剂的制备

实施例1的复合中药热水提取物    100mg

玉米淀粉            100mg

乳糖                100mg

硬脂酸镁            2mg

混合上述成分后，根据常规的锭剂制备方法打锭，制得锭剂。

制剂例3：胶囊剂的制备

实施例1的复合中药热水提取物    100mg

玉米淀粉                       100mg

乳糖                           100mg

硬脂酸镁                       2mg

混合上述成分后，根据常规胶囊剂的制备方法填充入明胶胶囊内，制得胶囊剂。