一种利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法

摘要

一种利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法，它属于基础生物学及医学领域。本发明解决了DNA残留，及菌体生长过程中管家基因表达不稳定和当PCR效率不高或多种基因间PCR效率差别较大时，所分析出的结果误差较大，致使现有基因表达相对定量在实际应用中具有一定局限性的问题。本发明的分析方法是将RNA提取物中的并存DNA作为内标，制备RT、RT

说明书

技术领域

本发明属于基础生物学及医学领域，涉及一种原核生物基因表达的相对定量分析方法，具体是指利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法。

背景技术

随着生物基因组学和生物信息学的不断发展以及功能基因组学研究的深入，基因表达研究成为近年的研究重点。原核生物是整个生物界重要的组成部分，与人类的生存活动密切相关，相应研究已从结构基因组学逐步转入功能基因组领域的探索性研究，从而最终实现原核生物系统生物学的建立。目前对原核生物基因表达的研究主要是从基因的转录水平进行分析，也就是从RNA角度进行定性定量的研究。由反转录PCR发展而来的实时荧光定量反转录PCR(Real-time RT PCR)技术，在生物、医学、食品检测等领域均得到广泛应用，成为基因转录水平上对基因表达进行分析的重要方法。

现有利用Real-time RT PCR技术对原核生物基因表达进行相对定量分析的整个操作计算过程中，基于不同的实验考虑，对以下三个关键部分的处理方式往往各不相同，所采取的方法也分别存在一定的不足：

1、用任何方法提取的RNA中都不可避免的会有部分DNA存在。对于真核生物可以通过PCR引物的跨内含子设计或者mRNA纯化，消除RNA检测中的DNA影响。而原核生物的mRNA不含有内含子及polyA结构，一般是利用DNaseI(RNase Free)对其DNA进行处理，即在37℃酶解10-30分钟不等，再经高温对DNase I灭活或通过苯酚-氯仿抽提去除DNase I酶。由于原核生物的RNA本身稳定性较差，上述的处理过程对RNA的总量及质量会造成较大影响。

2、在RNA相对定量分析中，由于菌体/细胞的不同处理方式或操作差异，均会导致用于提取RNA的初始菌体/细胞量不同。若将样品材料统一到相同菌体/细胞量提取是非常困难的，应选择一种在整个处理过程中转录水平稳定的基因作为内标对初始菌体/细胞量进行均一化校正。一般选择16S rRNA等作为原核生物的内标。但2002年，Vandecasteele SJ等人研究表明，16S rRNA的含量并不稳定，在菌体的不同生长时期也会出现较大的波动。

3、基因表达相对定量的具体分析算法。相关的算法有很多种，最初用外标法进行相对定量，即根据一系列已知拷贝数的外标物作标准曲线，确定目的基因和管家基因(House keeping gene)的确切模板量，将两者的比值作为相对定量的最终结果。这种方法需要进行扩增序列的质粒克隆，并通过检测计算确定拷贝数，才能绘制出绝对定量标准曲线。这种以绝对定量为基础的相对定量分析过程繁琐，易产生误差。后来基于PCR扩增的动力学模型，出现(1+E)^-ΔΔct算法：Q_R＝(1+E)^-ΔΔCt，其中Q_R为实验组中的目的基因与对照组中目的基因的相对定量的结果，ΔΔCt＝(Ct_目的基因-Ct_参照基因)_实验组-(Ct_目的基因-Ct_参照基因)_对照组，Ct值是指荧光信号达到阈值时的循环数，E为PCR效率。但以往PCR效率的计算均由已知确切拷贝数的绝对定量标准曲线的斜率计算出来，使整个操作、计算过程更为复杂，不易推广使用。ABI公司在推出ABI 7700型Real-time PCR仪时，所推出的2^-ΔΔCt法(ABI，Sequence Detector User Bulletin 2)：Q_R＝2^-ΔΔCt，这种算法假设相对定量中各PCR反应的效率E均为1，可以用来对基因的转录水平进行大致的相对定量分析，但是当PCR效率不高或多种基因间PCR效率差别较大时，所分析出的结果误差较大，在实际应用中具有一定局限性。

发明内容

本发明提供了一种利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法，目的是为了解决DNA残留，及菌体生长过程中管家基因表达不稳定和当PCR效率不高或多种基因间PCR效率差别较大时，所分析出的结果误差较大，致使现有基因表达相对定量在实际应用中具有一定局限性的问题。

利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法，所述分析方法是通过下述过程实现的：一、利用被检测原核生物RNA为模板反转录获得的cDNA进行梯度稀释绘制出倍比稀释标准曲线，获得斜率slope，通过PCR效率公式E＝10^[-1/slope]-1计算出Real-time PCR效率E；二、原核生物的总核酸的提取：利用酚-氯仿法提取处于对数生长中期的被检测原核生物的总核酸；三、对所提取的总核酸制备反转录样品和非反转录样品，制备方法如下：取两等份的经步骤二提取的被检测原核生物总核酸；将其中的一份进行反转录反应得到反转录样品；将另一份用体积浓度为0.1％的DEPC水稀释至与RT样品相同的浓度，获得非反转录样品；四、在步骤三得到的反转录样品和非反转录样品进行Real-time PCR检测，将步骤三中分别获得反转录样品的Ct_RT值和非反转录样品的Ct_RT-值；五、原核生物基因相对定量表达的分析：指定被检测原核生物中一组基因表达量Q′为参照组采用上述步骤测得的数据通过相对定量公式$Q_R=\frac{Q}{Q^{\prime }}=\frac{{(1+E)}^{-\mathrm{\Delta Ct}}-1}{{(1+E)}^{-\Delta {\mathrm{Ct}}^{\text{′}}}-1}$计算原核生物基因的相对表达量Q_R；其中Q表示目的基因的表达量，Q′表示参照基因的表达量，ΔCt＝Ct_RT-Ct_RT-，ΔCt′＝Ct_RT′-Ct_RT-′，E＝10^[-1/slope]-1，Ct值是指荧光信号达到阈值时的循环数，RT表示反转录，RT^-表示非反转录。

本发明为保持总核酸中RNA的质量，所有器具及相关溶液均经过0.1％(体积)的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，提取到的总核酸最终溶于0.1％(体积)的DEPC水中。在步骤一中以琼脂糖凝胶电泳检测总核酸中是否包括DNA和RNA；对总核酸进行紫外吸光值的测定，检测核酸提取的纯度。

在常规荧光定量反转录PCR基因表达相对定量分析方法和(1+E)^-ΔΔCt算法的基础上，针对原核生物基因表达中RNA的特点，本发明建立了一种结合DNA扣除法的相对定量检测体系：将RNA提取物中的并存DNA作为内标，制备RT、RT^-样品，并从中进行DNA的扣除(代替原先的酶解步骤)，并且DNA的含量还可作为内标使用，在不增加检测成本和时间的前提下，同时解决了基因表达相对定量分析中存在DNA残留、菌体生长过程中管家基因表达不稳定和2^-ΔΔCt算法无法进行PCR效率的有效评价的问题，本发明的分析方法可以对原核生物中基因的表达进行有效的相对定量分析。

与现有技术相比较，本发明在原核生物基因表达实时荧光反转录PCR相对定量分析应用中的积极效果的主要体现为：

1、本发明不需知道确切拷贝数，而实际操作中拷贝数的测量方法复杂，本发明检测减低成本；

2、可以通过分析计算去除RNA提取中的DNA残留，省去了酶解DNA的步骤，缩短了检测时间及成本；

3、对检测出的DNA含量数据可以进行再次利用，作为DNA内标进行菌体量的均一化校正，进一步降低检测成本；

4、在保证检测结果客观准确的基础上，利用公式：$Q_R=\frac{Q}{Q^{\prime }}=\frac{{(1+E)}^{-\mathrm{\Delta Ct}}-1}{{(1+E)}^{-\Delta {\mathrm{Ct}}^{\text{′}}}-1},$可以对检测结果进行简便快速的计算分析，且实际应用范围较广。

本发明具有过程简单、易操作、一次性可进行大量样品检测、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点。本发明的方法可以对原核生物中基因的表达进行有效的相对定量分析，本相对定量分析方法对原核生物基因表达的相对定量分析有较强的指导意义。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式中利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法，此方法可以一次性对不同的基因进行相对定量分析，所述的分析方法是通过下述步骤完成的：一、利用被检测原核生物RNA为模板反转录获得的cDNA进行梯度稀释绘制出倍比稀释标准曲线，获得斜率slope，通过PCR效率公式E＝10^[-1/slope]-1计算出Real-time PCR效率E；二、原核生物的总核酸的提取：利用酚-氯仿法提取处于对数生长中期的被检测原核生物的总核酸(DNA和RNA)；三、对所提取的总核酸制备反转录样品和非反转录样品，制备方法如下：取两等份的经步骤二提取的被检测原核生物总核酸，；将其中的一份进行反转录反应得到反转录样品(含有cDNA与DNA，二者共同参与下一步PCR检测)；将另一份用体积浓度为0.1％的DEPC水稀释至与RT样品相同的浓度，获得非反转录样品(仅有DNA参与下一步PCR检测)；四、在步骤三得到的反转录样品和非反转录样品进行Real-time PCR检测，将步骤三中分别获得反转录样品的Ct_RT值和非反转录样品的Ct_RT-值；五、原核生物基因相对定量表达的分析：指定被检测原核生物中一组基因表达量Q′为参照组采用上述步骤测得的数据通过相对定量公式$Q_R=\frac{Q}{Q^{\prime }}=\frac{{(1+E)}^{-\mathrm{\Delta Ct}}-1}{{(1+E)}^{-\Delta {\mathrm{Ct}}^{\text{′}}}-1}$计算原核生物基因的相对表达量Q_R；其中Q表示目的基因的表达量，Q′表示参照基因的表达量，ΔCt＝Ct_RT-Ct_RT-，ΔCt′＝Ct_RT′-Ct_RT-′，E＝10^[-1/slope]-1，Ct值是指荧光信号达到阈值时的循环数，RT表示反转录，RT^-表示非反转录。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是所述的步骤一中的计算斜率slope方法如下：将cDNA分别进行5个10倍梯度稀释，然后进行Real-time PCR检测；设稀释的最低模板浓度为10¹，以模板浓度倍数的对数值(lg10¹～lg10⁵)为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线，得到斜率slope。其它反应步骤与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是所述的步骤二中提取总核酸方法如下：先活化基因的菌株，然后将活化后的细菌菌株接种于培养基中，在适宜细菌菌株生长温度下培养到对数生长中期时，将菌液离心分离收集菌体，再利用常规的酚-氯仿法提取总核酸。其它反应步骤与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是所述的步骤三中基因的RT样品制备方法如下：取经步骤一方法提取被检测原核生物总核酸利用ExScript^TM反转录试剂盒进行反转录反应进行反转录反应，反转录的温度为42℃，反转录的时间为15min，反转录酶失活的温度为95℃，反转录酶失活的时间为2min，得到基因的RT样品。其它反应步骤与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是所述的步骤四中对被检测原核生物的RT样品和RT^-样品进行PCR扩增，PCR反应条件为95℃变性10s后，95℃5s，60℃34s扩增40个循环，将在60℃34s时收集荧光信号设定为阈值，在分别测定RT样品的Ct_RT值和RT^-样品和Ct_RT-值。其它反应步骤与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式中利用本发明实时荧光反转录PCR的方法和常规的定量法分析在不同葡萄糖浓度的NB培养基中培养的金黄色葡萄球菌中的肠毒素A基因(sea)、16S rRNA、RNAIII(agr调控系统的效应因子)三种基因相对定量表达量，分别以葡萄糖浓度为0mmol/L的NB培养基中培养的金黄色葡萄球菌的A基因(sea)、16S rRNA、RNAIII表达量(Q’)为参照组，结果见表1：

表1

  基因葡萄糖浓度(mmol/L)    绝对定量法    本发明的方法    区别相对表达量CV相对表达量CV  sea    0    1.0000 0.72％    1.0000 2.14％  -    25    1.3958 0.90％    1.5195 1.14％  8.87％    50    1.3636 0.31％    1.5468 1.68％  13.43％    75    1.3180 0.12％    1.4582 0.38％  10.64％    100    0.8873 0.85％    0.8109 1.10％  8.61％  16s rRNA    0    1.0000 0.72％    1.0000 0.79％  -    25    1.0422 3.85％    0.9552 0.31％  8.34％    50    1.0234 2.59％    1.0800 0.99％  5.53％    75    1.0303 7.78％    1.1101 1.21％  7.74％    100    1.0495 0.44％    0.9238 1.21％  11.98％  RNAIII    0    1.0000 4.57％    1.0000 9.93％  -    25    0.6564 0.92％    0.5965 11.04％  9.14％    50    0.7306 1.67％    0.6246 10.92％  14.50％    75    0.6620 6.23％    0.6104 11.89％  7.79％    100    1.1104 2.84％    1.2529 8.59％  12.84％

对表1中本发明的方法与经典的绝对定量法相对定量分析进行比较，差异较小(均小于15％)，且结果差异不显著(p＞0.05)，因此本法明的方法可以获得与绝对定量法相似的结果。本发明的分析方法可以对原核生物中基因的表达进行有效的相对定量分析。