茶儿茶素生物合成相关基因表达的实时荧光定量PCR分析

摘要

茶儿茶素生物合成主要涉及的酶类有PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR、LAR、ANS和ANR等，其中与非酯型儿茶素C、GC、EC和EGC合成直接相关的酶是LAR和ANR。寻找儿茶素生物合成的关键基因，对开展茶树次生代谢基因工程研究具有重要意义。
　　 本论文首先对四个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况进行分析，筛选适合实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术的内参基因；以茶树鲜叶为材料，利用qRT-PCR技术，研究了儿茶素生物合成相关结构基因和调节基因的表达差异；利用高效液相色谱(HPLC)方法和酶学检测方法，研究了儿茶素含量的变化和DFR/LAR、ANR酶活性变化；探讨了儿茶素合成途径中儿茶素含量变化与相关基因表达、酶活性变化之间的相关性。主要研究结果如下：
　　 1．检测了18SrRNA、GAPDH、β-Actin和α-Tubulin四个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况，GeNorm和NormFinder软件分析结果显示，在qRT-PCR分析中，当比较茶树不同器官组织的基因表达差异时，可选择β-Actin作为校正内参基因；比较不同成熟度叶片和愈伤组织时，可以选择GAPDH作为校正内参基因。
　　 2．应用qRT-PCR技术，研究了儿茶素合成相关基因在茶树鲜叶不同发育阶段中的表达情况，结果显示，PAL、F3H、LAR和DFR的表达量随叶片成熟度增加而逐渐下降；F3'HC4H在第一叶中表达丰富，随着叶片成熟度增加而表达量逐渐降低；CHI和F3’5'H的表达量从第一叶到第四叶没有明显的变化；ANR和ANS表达趋势基本一致，在芽和第三叶中有较高表达；CHS和CsMYB2从第一叶到第三叶表达量比在芽和老叶中表达丰富；UFGT和CCoAOMT在第四叶中表达量最强。
　　 3．HPLC检测结果显示，不同发育阶段茶鲜叶中，第一叶的儿茶素总量最高，芽次之，成熟叶片中明显低于第一叶。从儿茶素各组分看，C、GC和EC含量较低且变化不明显；而EGC的含量随叶片成熟度增加而增加，EGCG和ECG含量随叶片成熟度增加而逐渐降低。
　　 4．酶活性检测结果表明，儿茶素C和GC、EC和EGC分别是DFR/LAR、ANR的直接产物；随叶片成熟度增加，DFR/LAR活性逐渐降低；茶鲜叶中DFR/LARDHM活性高于DFR/LARDHo;ANR的活性以第三叶最高，ANRCYA的酶活性远远高于ANRDEL的酶活性。酶活性变化规律与相应基因表达规律相符。