一种深层液体发酵法制备富硒金针菇粗多糖原粉的方法

摘要

一种深层液体发酵法生产富硒金针菇粗多糖原粉的方法，属于生物工程技术领域。本发明主要包括菌种的培养，发酵工艺，硒元素的富集，菌丝体的收集，干燥，粉碎，得到富硒金针菇胞内粗多糖原粉；另外将发酵液超滤浓缩，将浓缩液醇提后冷冻干燥得到富硒金针菇胞外粗多糖原粉；二者合并后得到产品富硒金针菇粗多糖原粉。每克粗多糖原粉中有机硒含量达20微克/克以上。富硒金针菇多糖有抗肿瘤，提高人体免疫力，抗疲劳，促进儿童大脑发育等保健功效，是上好的保健品有效成分。用本发明方法生产富硒金针菇粗多糖原粉，周期短，成本低，工艺简便，科技含量高，不易被仿冒，有效成分含量高，附加值高，适宜工业化生产。

说明书

技术领域

一种深层液体发酵法制备富硒金针菇粗多糖原粉的方法，属于生物工程技术领域。涉及发酵法培养金针菇菌体，在发酵培养基中，逐级加入无机硒元素，使金针菇菌丝体中积累高浓度的有机硒。从中得到富硒金针菇胞内粗多糖原粉。同时发酵液的有效成分中也有较高浓度的硒元素。再对发酵液进行超滤浓缩得到富硒金针菇胞外粗多糖原粉。将二者合并得到产品富硒金针菇粗多糖原粉。

背景技术

金针菇(Flammulina velutipes)是世界著名的食用菌之一，属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口蘑科，冬菇属(Flammulina)或金钱菌属(Collybia)。金针菇肉质细嫩、软滑，味道宜人。其蛋白质含量高。据分析表明，每百克鲜金针菇中含维生素B253.2毫克，维生素C10.9毫克。每百克干金针菇中含蛋白质13克，碳水化合物52克，矿物质7.56克，还含有胡萝卜素、多种氨基酸和核酸。金针菇含有人体必需氨基酸成分较全，尤其是赖氨酸和精氨酸的含量特别高，有益于儿童脑细胞的发育，因此国外称其为″增智菇″。金针菇中还含有一种叫朴菇素的物质，可增强机体对癌细胞的抗御能力。金针菇含有的金针菇多糖具有降低胆固醇、抗菌活性、免疫活性和抗肿瘤作用。它可以调节机体代谢水平，提高肝脏解毒能力，促进核酸和蛋白质生物合成，有助于损伤细胞的修复和更新，从而延缓细胞衰老，有益于延年益寿。此外，金针菇多糖能促进蛋白质、核酸的合成，提高机体生物免疫力，主要为药用，金针菇多糖有消炎、护肝、养心和抗衰老作用，同时能有效地阻止肿瘤生长之功效，是癌症病人化疗最好的辅助药物。

研究表明，常以子实体用药的真菌，在它们的菌丝体中亦含有与子实体相同的药效成分与相似有效成分含量。这就给液体发酵法生产金针菇多糖提供了理论依据。

硒是人体必需的微量元素，在体内是谷光甘肽过氧化物酶的必需成分，硒在人体内有抗氧化、保护细胞膜的作用。金针菇已证实具有一定耐硒能力和富硒能力，富硒菌丝体硒的有机化程度高，硒存在于含硫元素的化合物中，如蛋白质、氨基酸、多糖、核糖核酸等生物大分子物质中。一定浓度范围的硒对金针菇菌丝生长及可溶性蛋白、氨基酸和多糖的形成均有促进作用。富硒金针菇具有清除自由基、抗炎、抗肿瘤、抗衰老和抗脂质过氧化的作用。

随着人们生活水平的不断提高，人们对营养保健品的需求从以前的盲目消费向理智精品化转变。富硒金针菇多糖以其卓越的营养品质和口感必将成为高品质的保健品。

发明内容

本发明的目的是提供一种深层液体发酵法生产富硒金针菇粗多糖原粉的方法，采用先进的生物技术，并且利用高等真菌具有转化性的富硒能力的特点，进行纯种液体深层发酵培养金针菇菌体，大大缩短了生产周期，本发明的生产周期为5天(传统的固体培养子实体的周期一般在30-50天左右)。本发明全部采用粮食原料，污染小，技术含量高，富硒金针菇多糖得率高，有利于人体吸收，产品附加值高。

本发明的技术方案：将金针菇孢子接种至新鲜的固体斜面上进行培养，待斜面长好后移至液体培养基中进行种子液的培养；再通过三级发酵，最后转至3000L发酵罐进行深层液体发酵培养。在发酵培养基中逐级加入无机硒元素，并逐级增加浓度，使金针菇菌丝体中积累高浓度的有机硒，同时发酵液中有效成分中也有较高浓度的硒元素。发酵结束后，通过对菌丝体的收集、烘干、粉碎得到富含硒元素的胞内金针菇粗多糖原粉，并对发酵液进行超滤浓缩，醇提、冷冻干燥得到胞外金针菇粗多糖原粉，将两者合并最终得到富硒金针菇粗多糖原粉。

步骤为：

1)菌种培养：

出发菌株为金针菇(Flammulina Valutipes)F12；该金针菇菌株已在“生物技术”杂志2002年06期，2002年12月，题目为《食用菌深层发酵工艺研究及功能性食品开发》中公开。

①斜面培养：

培养基配方以g/L计：葡萄糖10，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁0.5，马铃薯汁200，琼脂20，pH自然；

培养方法：将保存在木屑上的菌种接种到新鲜的空白斜面上，在26±1℃下培养7-10天；

②500mL一级摇瓶种子培养，装液量150mL：

培养基配方以g/L计：葡萄糖20，黄豆粉10，玉米粉15-20，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁0.5和维生素B₁0.05，pH自然；

培养方法：将培养好的斜面接种至事先灭菌的摇瓶中，在26±1℃，转速110rpm下培养7天；

③5000mL二级摇瓶种子培养，装液量1500mL：

培养基配方以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨10，玉米粉15-20，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁0.5和维生素B₁0.05，pH自然；

培养方法：将培养好的一级种子以10％的接种量接种至事先灭菌的摇瓶中，在26±1℃，转速110rpm下扩大培养2天，即成摇瓶种子液；

3)三级发酵培养：

①50L一级发酵种子罐培养，装液量25-30L：

一级种子罐培养基配方以g/L计：葡萄糖20，黄豆20，黄豆浸泡后用胶体磨磨浆离心后取汁，玉米粉5.0，麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁，酵母膏3.0，维生素B₁0.05，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，豆油2.0和亚硒酸钠20μg/L，pH自然；在0.1Mpa下灭菌30分钟，冷却后按接种量5％-10％接入摇瓶种子，温度26±1℃，罐压0.05Mpa，通气量1∶0.3，V/V，搅拌转速100rpm，转罐标准：发酵时间30-35小时，菌丝球上浮三分之一，镜检有锁状联合，无杂菌；

②500L二级发酵种子罐培养，装液量250-300L：

二级种子罐培养基配方以g/L计：葡萄糖20，黄豆20，黄豆浸泡后用胶体磨磨浆离心后取汁，玉米粉5.0，麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁，酵母膏3.0，维生素B₁0.05，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，豆油2.0和亚硒酸钠40μg/L，pH自然；在0.1Mpa下灭菌30分钟，冷却后按接种量10％-15％接入一级种子，温度26±1℃，罐压0.05Mpa，通气量1∶0.3，V/V，搅拌转速100rpm，转罐标准：发酵时间20-25小时，菌丝球上浮三分之一，镜检有锁状联合，无杂菌；

③3000L发酵罐的培养，装液量1800L：

发酵培养基配方以g/L计：葡萄糖30，黄豆20，黄豆浸泡后用胶体磨磨浆离心后取汁，玉米粉5.0，麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁，维生素B₁0.05，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，豆油2.0和亚硒酸钠50μg/L，pH自然；在0.1Mpa下灭菌30分钟，冷却后按接种量10％-15％接入二级种子，温度26±1℃，罐压0.05Mpa，通气量1∶0.3，V/V，搅拌转速100rpm，放罐标准：发酵时间40-45小时，pH>5，平板无杂菌，菌丝球上浮二分之一，镜检有锁状联合，菌丝球不能自溶；

3)产品的提取：将培养好的发酵液用5000-6000rpm的离心机处理，收集菌丝体，将发酵液收集在提取罐中；

①胞内粗多糖原粉的获取：将收集到的菌丝体用纯净水洗涤几次，待洗涤液澄清后，放入真空干燥箱中进行烘干，烘至水分含量在6％以下进行粉碎，即得金针菇胞内粗多糖原粉；

②胞外粗多糖原粉的获取：将收集到提取罐中的发酵液和合并来的菌丝体洗涤液用截留相对分子质量为5000的中空纤维超滤膜设备进行超滤浓缩，浓缩为原液体积的五分之一后，将浓缩液用体积3倍量的95％食用级乙醇醇提12-16小时后，用5000-6000rpm离心20-30分钟，收集固体，将收集到的固体用少量纯净水复溶后，冷冻干燥，粉碎后即可得到金针菇胞外粗多糖原粉；

③产品的获得：将金针菇胞内粗多糖原粉和金针菇胞外粗多糖原粉二者合并，即得产品金针菇粗多糖原粉。

4)检验：检验标准如下：

i.产品外观：颜色为深黄色粉末，细度40目，具有金针菇香味，无异味。

ii.多糖含量≥6％。

iii.蛋白质含量≥8％。

iv.有机硒含量≥20微克/克。

v.水分≤8％。

vi.菌落总数≤1000cfu/g，大肠菌群≤40npn/100g，酵母≤25cfu/g，，霉菌≤25cfu/g，致病菌不得检出。LD50为阴性。

vii.铅≤1.5mg/kg，砷≤1.0mg/kg。

产品均由卫生防疫部门检测合格后方可销售。包装：检验合格后用铝膜包装袋包装后即得产品金针菇粗多糖原粉，可作为保健品的中间体。

本发明的有益效果：本发明采用先进的生物技术，并且利用高等真菌具有转化性的富硒能力的特点，进行纯种液体深层发酵培养金针菇菌体，大大缩短了生产周期，本发明的生产周期为5天，传统的固体培养子实体的周期一般在30-50天左右。本发明全部采用粮食原料，污染小，成本低，工艺简便，科技含量高，不易被仿冒，有效成分含量高，附加值高，适宜工业化生产。富硒金针菇多糖得率高，有利于人体吸收。产品富硒金针菇粗多糖原粉，每克粗多糖原粉中有机硒含量达20微克/克以上。富硒金针菇多糖有抗肿瘤，提高人体免疫力，抗疲劳，促进儿童大脑发育等保健功效，是上好的保健品有效成分。

具体实施方式

1、种子液的制备：将木屑孢子接种至事先灭好菌的用上述斜面配方配制的一只空白茄子瓶斜面上，在26℃下培养7-10天后将斜面上的菌体刮入事先灭好菌的装有玻璃珠的250ml三角瓶中，另加30ml无菌水振荡10分钟，制成菌悬液。吸4ml该菌悬液于事先灭好菌的2只500ml三角瓶中(按上述一级摇瓶配方配制的培养基，装液量为150ml)，在26℃，转速110r/min下培养7天得一级摇瓶种子液；将培养好的一级摇瓶种子液各一瓶在无菌操作下倒入事先灭好菌的用上述二级摇瓶配方配制的5000mL(装液量为1500mL)的三角瓶中，在26℃，转速110r/min下扩大培养2天，长好后将两瓶种子液合并即成摇瓶种子液。

2、一级种子罐培养：按上述一级种子罐培养基配方，在0.1Mpa下灭菌30分钟冷却后接入摇瓶种子。按上述一级种子罐培养参数培养。采用50L全自动发酵罐，装液量为25-30L。

3、二级种子罐培养：按上述二级种子罐培养基配方，在0.1Mpa下灭菌30分钟冷却后接入一级种子。按上述二级种子罐培养参数培养。采用500L发酵罐，装液量为250-300L。

4、发酵罐的培养：采用3000L发酵罐，装液量为1800L。按上述发酵培养基配方，相同条件灭菌后接入二级种子。按上述发酵罐的培养参数培养。

5、胞内粗多糖原粉的获取：将培养好的发酵液用上述产品的提取方法，收集菌丝体，得到260公斤湿菌体，在干燥粉碎后得到30公斤胞内粗多糖原粉。

6、胞外粗多糖原粉的获取：按上述胞外粗多糖原粉的获取方法，得到300L浓缩液，冷冻干燥后，粉碎得到金针菇胞外粗多糖原粉6公斤。

7、将二者合并得产品金针菇粗多糖原粉36公斤。