一种低温脂肪酶菌株、低温脂肪酶及其生产方法

摘要

本发明公开了一种产生低温脂肪酶的出芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)和利用此菌株生产低温脂肪酶的生产方法，同时还提供了低温脂肪酶。通过利用出芽丝孢酵母(CGMCC.No.1674)，建立菌种保藏、复壮及选育的系统方法，经过培养基配方优化筛选及发酵工艺条件优化控制，确立了稳定的发酵方法，生产的低温脂肪酶具有良好的低温活性、高酶活。可广泛用于洗涤、食品加工、皮革加工、助消化剂、有机合成化工产品、香料、药物制备、油脂加工等行业，并具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种低温脂肪酶、该酶的产生菌及其制造方法。具体就是，本发明涉及一种由耐低温微生物菌种产生的、在较低的温度下具有较高活性的脂肪酶，及其利用该微生物菌种生产低温脂肪酶的生产方法。

技术背景

脂肪酶(Lipase)是一种在自然界中普遍存在的酶类。按其来源不同，可分为动物脂肪酶、植物脂肪酶及微生物脂肪酶三大类。其中，微生物脂肪酶因其生产容易、易于扩大等特点及其对脂肪类物质特异性的分解特性，使其在洗涤、食品加工、皮革加工、助消化剂、有机合成化工产品、香料、药物制备、油脂加工等方面得到广泛应用，成为世界主要工业用酶制剂之一。八十年代以后，脂肪酶在开发应用方面的研究加速，显示出良好的应用前景。

可产生脂肪酶的微生物菌种主要有以细菌和霉菌为主，有些酵母菌也可产脂肪酶。因此菌种特性的差异性，使其产生的脂肪酶在酶学特性上存在差异性，以下为目前脂肪酶研究的主要研究菌种及其产生的脂肪酶的特性。

假单胞菌属菌H-1(Pseudomonas H-1)，其产生的脂肪酶最适反应温度为47℃以上(Frederic Marie Tavea，章克昌从非洲土壤中分离新的产生脂肪酶的细菌无锡轻工大学学报2000，19(1)：41-44)；

链霉菌Z94-2，其产生的脂肪酶最适酶解条件为：37℃、pH9.4～10.2(周晓云，黄建宁，欧志敏，王慧中，王荣伟链霉菌Z94-2碱性脂肪酶产生条件及酶学性质微生物学报2000，40(1)：75-79)；

扩展青霉，其产生的脂肪酶最适酶解条件为：36℃、pH7～9(郑毅，龚福生，施巧琴，吴松刚扩展青霉脂肪酶催化性质的研究药物生物技术2000，7(2)：98-101)；

毛霉(Mucor sp.)M₂菌株，其产生的脂肪酶最适酶解条件为：50℃、pH8.0(肖春玲，宋欣毛霉脂肪酶的研究微生物学通报1998，25(5)：274-277)；

青霉菌株4041，其产生的脂肪酶最适酶解条件为：25℃、pH10.0(邹显章，李江华洗涤剂用酶的研究与开发-新型碱性脂肪酶无锡轻工业学院学报1994，13(1)：201-207)；

根霉属(Rhizopus)脂肪酶产生菌NQ23，其产生的脂肪酶最适酶解条件为：50℃、pH7.0(乔红群，徐虹，付闪雷，欧阳平凯脂肪酶产生菌的筛选及其酶性质南京化工大学学报1998，1：15-19)；

华根霉(Rhizopus chinensis CCTCC M201021)其产生的脂肪酶最适酶解温度为40℃、pH7.5(徐岩一种脂肪酶产生菌及其筛选方法和产业化应用公开号CN 1443841A)；

无花果丝孢酵母(Trichosp figureiae)其产生的酶最适酶解条件为：40℃、pH8.0(张苓花，王运吉脂肪酶产生菌分离、鉴定及酶学性质研究生物技术1996，6(1)：12-16)；

异常毕赤酵母(Pichia anomala)1013，其产生的酶最适酶解条件为：48℃、pH4.8(章文贤，蒋咏梅，施巧琴，吴松刚异常毕赤酵母产生耐温酸性脂肪酶的研究福建师范大学学报(自然科学版)2000，9：72-82)；

南极假丝酵母菌(C.Antarctica)DMS-3855，其产生的酶最适酶解条件为：70℃、pH8.5(刘均洪，邱龙辉，徐军伟，张媛媛南极假丝酵母脂肪酶发酵条件优化及酶学性质化学工业与工程技术2005，2：1-4)；

假单孢菌B11-1，其产生的脂肪酶最适酶解条件为：45℃、pH 8.0(DONG-WON CHOO，TATSUO KURIHARA，TAKESHI SUZUKI，ACold-Adapted Lipase of an Alaskan Psychrotroph Pseudomonas sp.StrainB11-1：Gene Cloning and Enzyme Purification and Characterization Appliedand Environmental Microbiology Feb.1998，486-491)；

以E.coli为受体构建的基因工程菌株，所产生的脂肪酶最适酶解温度为60～70℃、pH9.0，具有较高的热稳定性(向华，张健，周坚，田宇清，谭华荣，热稳定脂肪酶及其编码基因与应用和专用工程菌公开号CN1552866A)；

假单胞菌属(Pscudomonas)菌产生的脂肪酶最佳作用温度为55～65℃、pH10～12(石田礼子，铃木雅博，小绿隆司，崎元和范，新领的脂肪酶、产生该脂肪酶的微生物、该脂肪酶的制造方法及用途C 12N 9/20)；

低温微球菌(Mcrococcus antarcticus)T2所产生的低温脂肪酶最适酶解温度为35℃、pH8.0(刘洪灿，马延和，薛燕芬，周培谨一种低温脂肪酶及其编码基因与生产方法公开号CN 1611600A)；

适冷性海洋酵母(Yarrowia lipolytica)Bohaisea-9145，所产生的低温脂肪酶的最适反应温度为35℃，在0℃时保存20％的相对酶活力，最适pH8.5、pH4.0～9.0范围内稳定，热稳定性差(邵铁娟，孙谧，郑家声，王跃军，邱秀宝，Bohaisea29145海洋低温碱性脂肪酶研究微生物学报2004，6：789-792)；

南大洋深海嗜冷菌22521021，其产生的酶最适酶解条件为：35℃、pH7.5；深海适冷假单胞菌(Pseudomonas sp.)KB700A产的低温脂肪酶的最适酶活性温度也为35℃；方金瑞从深海泥样分离到的菌株EQ223产的低温脂肪酶的最适作用温度为10℃；适冷菌(Pseudomonas sp.)B1121，产生的冷适应脂肪酶最适作用温度为45℃(林学政，杨秀霞，边际，黄晓航，南大洋深海嗜冷菌2-5-10-1及其低温脂肪酶的研究海洋学报2005，5：154-158)；

气单孢菌属菌(Aeromonas sp.)LPB4，所产生的低温酶最适酶解温度为10℃(Han-Ki Lee Min-Jung Ahn Sung-Ho Kwak Won-Ho SongByeong-Chul Jeong Purification and Characterization of Cold Active Lipasefrom Psychrotrophic Aeromonas sp.LPB 4 The Journal of MicrobiologyMarch 2003，p.22-27)；

假单孢菌Pseudomonas fragi，所产生的低温脂肪酶最适酶解温度为29℃、pH8.0(Claudia Alquati，Luca De Gioia，Gianluca Santarossa，LiliaAlberghina，Piercarlo Fantucci and Marina Lotti The cold-active lipase ofPseudomonas fragi Heterologous expression，biochemical characterizationand molecular modeling Eur.J.Biochem.269，3321-3328(2002)_FEBS2002)

耐冷假单胞菌属(Pseudomonas)BTs10022，该菌脂肪酶的最适酶解温度为24℃、10℃可保持35％的相对酶活力；pH为8.0，在pH7～9范围内具有较高的酶学特性(俞勇，李会荣，陈波，曾胤新，任大民，低温脂肪酶产生菌的筛选、鉴定及其部分酶学性质高技术通讯2003，10：89-93)；

嗜冷杆菌属(Psychrobacter sp.)7195，该菌株所分泌的脂肪酶最适作用温度为30℃，最适pH值为9.0，对热敏感，60℃热处理10min，剩余酶活为30％，是典型的低温酶。(张金伟，曾润颖，南极产低温脂肪酶菌株Psychrobacter sp.7195的选育、发酵条件及酶学性质研究生物磁学2006，6(1)：6-10)；

发光杆菌属(Photobacterium)D₂菌株所产脂肪酶的最适作用温度在35℃左右，证明其脂肪酶为低温酶，最适pH值为8(林容霞，马延和，谭天伟，低温脂肪酶产生菌的筛选及鉴定北京化工大学学报2006，33(1)：31-35)。

现报道的低温脂肪酶产生菌主要以细菌为主，兼以少量真菌，而这些菌中有些菌株所产生的低温脂肪酶由于其最适酶解温度过低(＜20℃)存在中温条件下不稳定、使用与保藏中同样需消耗能量而使其应用受到限制；有些菌可产生在室温下具有较好酶解特性的低温脂肪酶，但其最适酶解条件主要是在碱性范围内(pH≥8.0)，在酸性条件下其不能发挥较好的酶解特性，而部分菌株所产生的脂肪酶最适酶解温度接近于中温脂肪酶。

低温脂肪酶因其独特的酶解特性及用途而受到重视。目前，研究的低温脂肪酶主要由耐冷性微生物菌种产生，可供研究的菌种较少。而每一种微生物菌产生的酶的特性存在差异，如酶的作用pH范围与最适酶解pH、酶的作用温度范围与最适作用温度，以及酶的热稳定性等。

发明内容：

针对目前国内外有关低温脂肪酶的研究工作刚刚展开，其低温脂肪酶菌株性能及适合工业化生产方法还没有健全的技术体系。本发明提供了一种低温脂肪酶、产生该酶的微生物菌种及生产该低温脂肪酶的方法。所述的低温脂肪酶与常温脂肪酶、高温脂肪酶比较，在较低的作用温度下可发挥较高的酶解特性。

本发明通过对新疆阿勒泰、富蕴等典型高原低温地区的环境土壤样本进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批耐低温微生物菌株，并从中分离筛选出低温脂肪酶产生菌株，编号为GL-1，从而提供了一株低温脂肪酶产生菌，其具有生产低温脂肪酶的优良特性，经微生物学分类与鉴定，属于出芽丝孢酵母菌(Trichosporon pullulans)。

同时，本发明还提供了一种低温脂肪酶，通过利用本发明的菌株经过本发明确定的具体发酵工艺而获得。

本发明提供了一种低温脂肪酶菌株，命名为GL-1，其能够产生低温脂肪酶。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编：100080，保藏日期是2006年4月11日，保藏号是CGMCC.No1674。经微生物学鉴定为出芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)。该菌株培养温度5-25℃，最适培养温度20℃左右；优先生长于MYPG-agar培养基表面(麦芽膏3g、酵母膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂30g、蒸馏水1L)，经20℃、24h培养，菌落呈白色、小米粒状；培养48h后，菌落开始为酵母样薄膜生长，随后在中央出现细毛刺样菌丝，后生成乳白色菌丝覆盖，背面呈淡棕色；72h后菌落迅速增大，边缘呈纤毛状；细胞椭圆性，大小为(3～5)um×(5～9)um，芽殖；形成节孢子；参照《真菌鉴定手册》等对GL-1菌株进行形态学测定，确定GL-1菌株为丝孢酵母属(Trichosporon)中的成员。依据微生物鉴定有关方法，对该菌株的生理生化特性及26S rDNA序列进行系统发育分析，确定GL-1菌株为丝孢酵母属出芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans，T.pullulans)。T.pullulans GL-1可产生低温脂肪酶，在pH3～8、温度4～45℃范围内均有作用，其最适酶解条件为25～30℃、pH6.5。本发明进一步建立菌种保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。

本发明的低温脂肪酶微生物菌种T.pullulans GL-1，其生物学特性如表1所示：

表1低温脂肪酶产生菌T.pullulans GL-1生理生化特性

  测定项目  结果  测定项目  结果  测定项目  结果  Galactose(GAL)  -  Dulcitol(DUL)  -  Melezitose(MLZ)  -  Lactose(LAC)  -  Adonitol(ADO)  -  Raffinose(RAF)  +  Sucrose(SUC)  +  Palatinose(PAL)  -  N-acethl-D-glucosamine  (NAG)  -  Maltose(MLT)  +  Glycerol(GLY)  -  Xylitol(XLT)  -  Cellobiose(CEL) -  Sorbitol(SOR)  +  Incsitol(INO)  +  Methyl-D-glrcosede  (AMG) -  Erthritol(ERY)  +  Nitrate(NIT)  +  Xylose(XYL) -  Melibiose(MEL)  +  2-Keto-D-glucose  (2KD)  +  Arabinose(ARA) -  Cyclohexamide  (CYC)  -  Urea(URE)  -  Trehalose(TRE) -  Glucose(GLU)  +  48H  -

本发明的低温脂肪酶产生菌T.pullulans GL-1，其26S rDNA序列如下：

1   GTTTCAAGAC GGGTCGTTTA AAGCCATTAT GCCAGCATCC TAAGCACGGA CGTGTCCGAA

61  GACCGACCTA CAAGAGGCGT GCTGCGTTCC TCAGTCCCGG GCGATGTATT CGAAAGCGGG

121 CTATAACACA TCCGAGGATG CCACATTCCC GCCAACCTTT TCCACCGCCC AAAACTGATG

181 CTGGCCTGCA AACCGAGAAG TACACCGGCA GAACCGGCTG AGTCTCGGAA AGCATGACTG

241 ACTTCAATCG TTTCCCTTTC AACAATTTCA CGTACTGTTT AACTCTCTTT CCAAAGTGCT

301 TTTCATCTTT CCCTCACGGT ACTTGTTCGC TATCGGTTTC TCGCCAATAT TTAGCTTTAG

361 ATGGAATTTA CCACCCATTT TGAGCTGCAT TCCCAAACAA CTCGACTCTT TGAGAGCGCA

421 TCACAAAGCA CTGGAGATCT GTGTCAAGGA CGGGATTCTC ACCCTCTATG ACGCCGTGTT

481 CCAACGGACT TGTACACAGG CCAGCACGGA AAACGCTTCT CTAGACTACA ACTCGGACGA

541 TCTGAGACCG CCAGATTTTA AATTTGAGCT CATCCCGCTT CACTCGCCGT TACTAGGGGA

601 ATCCTTGGTA GTTTCTTTTC CTCCGCTTTT TT

将GL-1的26S rDNA序列与Genebank中的同源序列进行对比及进化分析，GL-1的26S rDNA序列与T.pullulans AF189861同源性高达98％以上，且对其同源序列进行进化分析中，T.Pullulans(AF189861)与GL-1分在同一分支，其进化拓扑结构如图1所示。结合低温脂肪酶产生菌GL-1的形态结构特性及生理生化特性，确定其为丝孢酵母属的出芽丝孢酵母(T.pullulans)GL-1。

作本发明低温脂肪酶的产生菌种，既可为本发明所保护的菌株，也可为自然筛选的原始菌株，或为保护菌株通过自然变异或人工诱导变异的变异菌株，通过本发明所述的方法，均可实现本发明所阐述的技术效果。

作为上述变异菌株的研制方法，包括物理诱变，如紫外线辐射处理、钴60辐照处理、离子注入处理、激光辐照等各种射线处理；化学诱变，如亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯等化学诱变剂处理，用常规脂肪酶产生菌分离筛选培养基及方法优选出生产性能优异的菌株。

另外，也可通过分子生物学技术，从原始菌株或诱导变异菌种中获取低温脂肪酶基因，以原菌核微生物，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等、真核微生物，如酵母等，作为基因受体菌，构建基因工程生产菌株，也可作为本发明的低温脂肪酶产生菌种。

作为本发明的低温脂肪酶产生菌种T.pullulans GL-1，可采用如下方法对其进行保存、活化与筛选，及其摇瓶发酵获得本发明的低温果胶酶。

本发明的低温脂肪酶产生菌T.pullulans GL-1采用常规的斜面传代保存法，此方法是将本发明菌种接种于只要适合于酵母菌生长的斜面培养基表面，15～25℃培养3～4天，再于4℃下低温保藏，可存放3个月左右，或是利用真空冷冻干燥法将本发明菌种制成干粉菌种，低温或常温保藏可达1年以上。

长期保藏的菌种在使用时按如下方法进行活化、筛选。将长期保藏的本发明菌种接种于MYPG-agar培养基或其它适合于酵母菌生长的培养基表面，15～25℃培养3～4天；本发明优先选用MYPG-agar培养基，其MYPG-agar培养基成分如下：麦芽膏3g、酵母膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂30g、蒸馏水1000mL。再将培养后的菌种接种于脂肪酶筛选培养基上，其筛选培养基如下：(NH4)₂SO4 0.1％、K₂HPO4 0.1％、NaCl0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、FeSO₄·7H₂O 0.001％、酵母膏0.5％、琼脂2.5％、每100mL培养基中加入12mL橄榄油乳化液(橄榄油∶2％的聚乙烯醇(PVA)＝1∶3)和1mL 0.05％罗丹明(Rhodamine)B、pH自然。接种菌株经20℃、2-3天培养，在紫外灯下菌落周围可形成明显的荧光变色圈。本领域技术人员所熟知，产生荧光变色圈意味着菌株可产生脂肪酶，这是一种成熟的技术，在众多外文及中文文献中均有报道，本发明挑取变色圈与菌落直径比最大的菌株作为本发明的实验菌株。

利用经活化筛选出的本发明的实验菌株进行发酵培养实验，获得本发明的低温脂肪酶。在发酵培养过程中，可将斜面菌种直接接种于发酵培养基中，或是将菌种先进行液体增殖培养，再以5％-15％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养。

作为培养基的营养源，可广泛使用通常用于培养的营养源。只要是可作为碳源同化的碳化合物或者是含有该碳化合物的，微生物菌种可利用的、适合于发酵培养产生菌本发明的低温脂肪酶的碳源即可，例如，可使用淀粉、玉米粉、葡萄糖、麦芽汁、蔗糖、水解糖、可用的多糖等。其用量依据其它营养源的选择不同及培养条件的差异而有所不同，本发明中优选葡萄糖为最优碳源，其用量为0.5-1.0％。

作为氮源，只要是可作为氮源同化的氮化合物或者是含有该氮化合物的即可，例如，可用铵盐、硝酸盐、大豆粉、肉类提取物、玉米浸渍液、玉米浆、酵母膏等。其氮源的选择和用量，可依据其它营养源的成分和用量的不同而不同，只要选合于本发明的低温脂肪酶产生菌的培养及酶的产生即可。在本发明中优选玉米浆、豆饼粉作为最佳的氮源，其用量均在0.5-2.0％。

作为无机盐类，可适当添加磷酸氢氨、磷酸二氢钾等的磷酸盐、镁盐、钙盐、锰盐等的盐类。培养条件依培养基的组份多少而不同，但只要是适合于菌体培养产的、产生本发明中的脂肪酶的条件即可。

作为产酶促进剂，可适量添加Tween系的表面活性剂、SDS等，添加量适培养基的不同而定，只要适宜促进培养过程产生本发明的果胶酶即可。

通常，可选择以下的条件进行培养。即，培养温度为10～25℃，最好为15～25℃的范围；培养时间约为48小时，只要在本发明的低温脂肪酶的生产量达到最高时结束培养即可；培养基的pH可在6～8的生产范围，特别是在7左右更适于本发明的脂肪酶的生产。经如上所述的培养，主要在菌体外(培养液中)产生目的产物的低温脂肪酶。

从如上所得的培养液中采集低温脂肪酶，可按照通常用于采集细胞外酶的方法，如硫酸铵盐析、超滤浓缩、冷冻干燥、色谱分离等，由分离、精制而进行。

即，可由下述方法获得本发明的低温脂肪酶：由过滤法或离心分离法从培养液中分离菌体及培养基固形物，得到上清液或滤液，对该些分离液进行或不进行浓缩，添加可溶性盐类，使酶沉淀的盐析法；添加亲水性的有机溶剂，使酶或夹杂物沉淀的有机溶剂沉淀法；使用离子交换树脂等的吸附脱离法；凝胶过滤法；添加稳定辅助剂或不添加稳定辅助剂的喷雾干燥法；单独或多个组合使用冷冻干燥法等的分离或精制方法。

通过本发明如上的阐述，得到后面实施例进一步的验证，得知本发明低温脂肪酶的酶学特性。本发明菌株GL-1产生的低温脂肪酶最适酶解pH为6.5左右，在pH5～8范围内可保持较高的酶活性；在5～45℃范围内均有酶特性，其最适作用温度在25～30℃；该低温脂肪酶具有较高的热稳定性，在30℃下保温80分钟，其酶活性仍可保持80％左右；金属离子对低温脂肪酶的活性具有一定的影响作用，其中K⁺对酶具有激活作用，Zn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Fe²⁺对其活性无显著影响、Cu²⁺、Mn²⁺对酶活性具有抑制作用。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。

本发明的出芽丝孢酵母菌(Trichosporon pullulans)菌株及在微生物分类学上来说与其同等的菌株及其变异菌株，可有效地用于产生本发明的低温脂肪酶。再有，本发明的优点在于，使用所述菌株的制造具有上述性质的低温脂肪酶的方法可有效地产生所述的低温脂肪酶。

附图简要说明：

图1所示为基于本发明的出芽丝孢酵母菌GL-1的26S rDNA序列的进化分析拓扑结构图。

图2所示为以本发明的出芽丝孢酵母菌GL-1产生的低温脂肪酶反应pH和相对酶活性关系的图。

图3所示为以本发明的出芽丝孢酵母菌GL-1产生的低温脂肪酶反应温度和相对酶活性关系的图。

图4所示为以本发明的出芽丝孢酵母菌GL-1产生的低温脂肪酶在各温度下处理残余酶活性的图。

图5所示为以本发明的出芽丝孢酵母菌GL-1产生的低温脂肪酶在各反应pH下处理残余酶活性的图。

图6所示为各种金属离子对本发明的出芽丝孢酵母菌GL-1产生的低温脂肪酶酶活性的影响作用。

图7所示为以ρ-硝基酚为标准品，OD值与ρ-硝基酚含量之间的关系。

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则％皆指重量百分比。

具体实施方式

实施例1：低温脂肪酶产生菌(GL-1)的培养-I

将本发明的低温脂肪酶产生菌GL-1接种于油脂同化平板培养基中，其中(NH₄)₂SO₄ 0.1％；K₂HPO₄ 0.1％；NaCl0.05％；MgSO₄·7H₂O 0.05％；FeSO₄·7H₂O 0.001％；酵母膏0.5％；琼脂2.5％；自然pH；取橄榄油与2％的聚乙烯醇(PVA)以1∶3的比例混合，10000r/min搅拌乳化5min，0.8kg/cm²灭菌30min后取12ml加入到100ml上述培养基中。20℃左右培养5～7天，则在本发明低温脂肪酶产生菌的菌落周围可形成透明圈。

实施例2：低温脂肪酶产生菌(GL-1)的培养-II

将罗丹明Rhodamine B配成0.05％的母液，以1.0％的量加入到实施例1的油脂同化培养基中，配制成罗丹明Rhodamine B显色培养基。将本发明的低温脂肪酶产生菌GL-1接种于上述培养基中，则在本发明低温脂肪酶产生菌的菌落周围会出现桔红色的晕圈，在紫外灯下有红色荧光圈。

实施例3：低温脂肪酶产生菌(GL-1菌株)的发酵培养

将本发明的低温脂肪酶产生菌接入麦芽汁液体种子培养基中，其中麦芽浸粉0.3；酵母膏0.3；蛋白胨0.5；葡萄糖1.0；1.0kg/cm²蒸汽灭菌15分钟。20℃培养1～2天后，以5％接种量接种于如下发酵培养基中。豆饼粉2.0，玉米浆2.0，葡萄糖1.0，K₂HPO₄0.5，NaNO₃0.5，pH7.0，250ml三角瓶中，每瓶装50ml，0.8kg/cm²蒸汽灭菌3O分钟。在20℃、200rpm下振荡培养48h。培养后，离心分离去除菌体，得到低温脂肪酶粗酶液，其发酵酶产量可达20U/mL。从如此所得的脂肪酶液中加入硫酸铵，使其饱和度达到60％，静置沉淀，得到部分的沉淀物，再以通常的方法溶解脱盐后，所得的低温脂肪酶溶液酶活力可达130U/ml。

实施例4：低温脂肪酶活性的测量方法

依据中温(是否可去掉)脂肪酶有关的测定方法，采用比色测定法进行低温脂肪酶活力的测定。以ρ-棕榈酸硝基苯脂(ρ-NPP)为作用底物，以单位体积的单酶液在单位时间内其酶解产物ρ-硝基酚(ρ-nitrophenol)的生成量进行酶活力的计算。其具体方法如下：

溶液A：90mg ρ-棕榈酸硝基苯脂(ρ-NPP)溶于30ml异丙醇中。溶液B：450ml pH7.5的磷酸缓冲液(0.067M)，并含有2g TrtionX-100和0.5g阿拉伯胶。

取2个试管，分别是对照管和样品管。将两试管中各加溶液B 2.85ml及0.1ml底物溶液A(缓慢混合，新鲜配制而成，该溶液至少可稳定2h)，30℃水浴保温5min，然后在对照管中加入已灭活的酶液0.05ml，样品管中加入酶液0.05ml，立即混匀计时，在水浴中准确反应10min后在两管中加3ml 0.5mol/L NaOH溶液终止反应。410nm分光光度计下测定酶催化产生的ρ-nitrophenol的吸收值。

酶活力计算：

以酶反应液OD值处于0.3～3.0的测定值为基础并计算酶活。脂肪酶1个单位的定义是：在pH6.5，30℃条件下，每分钟释放1μmol ρ-硝基酚所需的酶量。标准曲线制作时以ρ-硝基酚为标准品，见图7。测定酶活时应对酶液进行适当的稀释，使OD值在0.2-0.8的线性范围内。

酶活计算公式为：

A＝([A₁-A₀]×K+C₀)×V₁×n/(V₂×t)

A-样品酶活(U/ml)，A₁-样品酶液的吸光度OD值，A₀-应酶液的空白吸光度OD值，K-硝基酚标准曲线的斜率，C₀--对硝基酚标准曲线的截距，n--稀释倍数，V₁-反应液的体积/ml，V₂-酶液的体积/ml，t-反应时间/min。

实施例5：作用pH对低温脂肪酶酶活力的影响

作用pH和最佳pH测定，以ρ-NPP为基质，按前述的活性测试方法进行测定。测定的pH分别为4～8范围内的不同的pH值。以测定酶活力最高的pH下酶活值为对照，设定其相对酶活力为100％，则作用pH与酶活性的关系如图2所示。本发明菌株GL-1产生的低温脂肪酶在30℃下其最适酶解pH为6.5，在pH5～8范围内可保持较高的酶活性。

实施例6：作用温度与低温脂肪酶酶活力的关系

作用温度及最佳温度测定，以ρ-NPP为基质，与前述的活性测定方法相同，在5～40℃的范围内的不同的反应温度下进行测试。以测定酶活力最高的温度下的酶活力值为对照，设定其相对酶活力为100％，则反应温度和相对酶活性的关系如图3所示。在5～45℃的温度范围内，本发明菌株GL-1产生的低温脂肪酶均呈现酶活性，其最佳酶解温度为25～30℃之间。在15～35℃的测定温度范围内具有良好的酶学特性，在15℃下可保持80％左右的相对酶活力、10℃下仍可保持20％以上的相对酶活力。

实施例7：低温脂肪酶热稳定性

将实施例3所得到的低温脂肪酶粗酶液在30℃、pH6.5下保温，然后按上述酶活性测定方法每隔20分钟对其残余酶活力进行测定。以未进行保温处理的酶活力值为对照，设定其相对酶活力为100％，则此时的处理温度和残余活性的关系如图4所示。本发明菌株GL-1所产生的低温脂肪酶在30℃以下具有较好的热稳定性，30℃保温80分钟仍可保持80％左右的相对酶活力，具有较高的热稳定性。

实施例8：低温脂肪酶的pH稳定性

将实施例3所得到的低温脂肪酶粗酶液按1∶1的比例分别与pH2～11的缓冲液混合，在4℃下保温12h，然后将酶液调回到最适作用pH值(pH6.5)，在30℃下测定残余酶活。以pH6.5下的酶活力测定值为对照，设定其相对酶活力为100％，则此时的处理pH和残余活性的关系如图5所示。本发明菌株GL-1所产生的低温脂肪酶在pH3～10的范围内保持稳定。

实施例9：金属离子对低温脂肪酶酶活力的影响作用

金属离子对低温脂肪酶的影响作用按上述酶活性测定法，在pH6.5的磷酸缓冲液中添加Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Na+、K+、Fe2+，使其终浓度达到0.01M。按上述测定方法对酶活性进行测定。以未加入金属离子的为对照，设定其相对酶活力为100％，则金属离子对酶活力的影响作用如图6所示。K+对本发明的低温脂肪酶具有一定的激活作用，Cu2+、Mn2+对酶活性具有不同程度的抑制作用，其余金属离子对低温脂肪酶无明显的激活或抑制作用。