包含蛇床子提取物的用于杀灭产孢子微生物的孢子的组合物

摘要

本发明公开了一种含有蛇床子有机酸提取物的组合物，其对包含真菌和细菌的产孢子微生物的孢子具有杀菌效果，并公开了一种使用该组合物杀灭孢子和营养细胞的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于杀灭产孢子微生物的孢子的组合物，其含有蛇床子(TorilidisFructus)的提取物，并涉及一种使用该化合物杀菌的方法。

背景技术

产孢子微生物属于需氧杆菌属和专性厌氧梭菌属，其天然地存在于从土壤里收获的例如蔬菜和香料的农业原料中，其形成高度耐热的孢子内壁，并因此直接或间接地引起加工食品质量的变质并威胁着食品的卫生。

孢子核保持在脱水和干燥的状态下，并通过被称为皮层的肽聚糖层包围。该皮层包围在由大量蛋白质组成的外壳层中。由于其特有的结构和生物化学性质，孢子高度耐热，耐化学试剂，例如抗菌物质或抗生素，耐溶菌酶，耐物理作用，耐UV辐射，耐高压，耐高压脉冲电场等。孢子可以长时间保持休眠以在不利于生长的环境下存活。因此，对于孢子的杀菌条件必须首先考虑以确保加工食品的微生物安全。

此外，由于产孢子微生物天然地存在于来自土壤中的例如蔬菜和香料的食品原料中，其成为一种难题，在将蒸煮产品填充入例如罐头，袋子和盘子的各种容器类型中的杀菌中它们是重要的危险因素。就是说，产孢子微生物是由冷点产生的二次污染物，在此点无法实现高于4的充分的热处理，并且例如针孔的包装材料问题，由此成为主要的杀菌目标。

因此，为了确保加工食品的卫生和货架期，研究并开发一种抑制萌发并杀灭产孢子微生物的方法是很重要的。

由于不形成孢子的病原体对热没有耐受性并对化学处理有低耐受性，它们被充分的抑制生长或通过低于100℃的温度热处理杀灭或通过例如有机酸，乙醇和细菌素的商品化的杀菌剂处理杀灭。相反地，由于孢子的结构，化学和生态学特性使其不容易被杀灭。因此，耐热性孢子通常使用基于121℃的高温，1-1.5kg/cm²的高压加热几分钟到几十分钟的蒸煮方法被杀灭。然而，这种高温处理明显地损害包括风味，外观和质地的感官质量，并破坏许多营养素，因此影响了高质量加工食品产品的开发。另一种商业杀菌方法包括间接杀菌，其基于在65℃的适度温度下5-6小时内诱导孢子萌发，以将孢子转变为营养细胞并进行杀菌。这种方法的优点在于允许耐热孢子在低于100℃的温度下杀菌而质量没有下降，但具有一些缺点，包括当其使用于工业生产时的费时和在夏天要承担微生物污染的高风险的事实。同样，可以使用抑制孢子萌发的方法，其使用乳酸钠，溶血卵磷脂，聚脂肪酸酯，L-苯基丙氨酸，精油，甘氨酸，L-丝氨酸等。然而，由于使用食品添加剂的这些方法仅仅具有抑制孢子萌发的作用并没有杀灭作用，潜在的风险因素仍然存在。

此外，对于各种杀菌剂组合物也进行了研究。

根据Alkhayat，Huhtanen，Ueda，等，例如丁香，豆蔻，白胡椒和黑胡椒，月桂和肉豆蔻等香料的热水和乙醇提取物在125ug/ml的最小抑制浓度(MIC)下已经对肉毒杆菌A和B型的孢子产生了抑制作用。根据Hara等，例如单宁酸，多酚，茶黄素和儿茶酚的茶叶提取物有效抑制孢子的萌发。同样，咖啡酸和精蛋白是结合到鱼精子核DNA上的高度碱性(highly-basic)的蛋白质(肽)，其有效杀灭孢子和抑制孢子萌发。精蛋白通过破坏细胞壁和质膜杀灭杆菌的营养细胞，并通过抑制DNA，RNA和蛋白质合成及ATP水平的呼吸抑制对杆菌的孢子具有生长抑制作用。同样，可以通过精蛋白和热的协同作用很好地刺激孢子死亡。此外，已知的其它天然杀菌剂材料对孢子萌发有抑制作用并对孢子有杀菌作用，其它的天然杀菌剂材料包括下述：多熔素，其通过作为表面活性剂影响孢子结构而具有生长抑制作用；肽和包括氨基酸的蛋白质，例如细菌素，乳酸链球菌肽和pediocines，其不直接影响休眠的孢子，但在孢子萌发的早期溶胀阶段通过穿透孢子的薄壁影响萌发孢子的核，从而抑制繁殖；及乙醇，其在孢子萌发或孢子形成过程中具有生长抑制作用。然而，大多数杀菌剂对孢子具有生长抑制作用而不是对休眠孢子的直接杀菌作用，或仅仅显示出在孢子萌发或孢子形成期间的生长抑制作用。同样，具有直接杀菌作用的物质显示出大约10¹的令人不满意的孢子杀灭效果。

下面回顾了相关国内和国外文献。韩国专利申请号1992-18019公开了一种对孢子萌发有抑制作用的组合物，其由属于蓖麻类的一种植物种类的脱脂淀粉和属于黄连类的另一个植物种类的根组成的混合物的提取物，并陈述黄连素是在孢子萌发抑制中的关键物质。韩国专利中请号1996-7000557公开一种用于杀灭或抑制酵母或产孢子微生物生长的方法和组合物，其通过在过氧化物和氯化物或溴化物的存在下，以卤化过氧化物酶和至少一种杀菌活性增效剂接触微生物。该专利描述了杀菌活性增效剂包含一些α-氨基酸，并优选具有包含氢，未被取代的或羟基-或氨基-取代的，直链或支链的具有1-6个碳原子的烷基基团，或未被取代或羟基-或氨基-取代的，具有7-12个碳原子的芳基烷基基团结构的化合物。该专利同时描述该杀菌活性增效剂包含a-氨基酸，所述a-氨基酸选自包含甘氨酸和丙氨酸的L-或D-对映体，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，赖氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸，和其烷基酯的组。日本专利申请号1995-72164公开了一种用于抑制耐热孢子的萌发和繁殖的双甘油脂肪酸单酯组合物，该耐热孢子在饮料处理中产生一些问题，该组合物包括例如月桂酸，肉豆蔻酸和棕榈酸的脂肪酸和单酯。日本专利申请号1993-301163公开了一种使用包含脂肪酸的组合物诱导抑制孢子萌发的方法，该脂肪酸包括甘油单硬脂酸酯和异磷脂酰胆碱。上述发明主要目的是抑制孢子的生长，并且在这些发明中所述的大多数杀菌剂材料被认为是合成食品添加剂而不是天然的杀菌剂材料。

基于这种背景，对具有完全杀灭孢子作用而没有副作用的天然杀菌剂进行了集中和透彻的研究，在包含草药，中草药，热带水果和蔬菜的一百种可食用的植物材料中发现蛇床子的提取物对枯草杆菌的孢子具有很强的杀菌作用，从而形成了本发明。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种用于杀灭产孢子微生物的孢子的组合物，其包含蛇床子的有机溶剂提取物。

本发明的另一个目的是提供一种杀灭产孢子微生物的孢子的方法，其基于使用该组合物对孢子进行处理。

附图简述

结合附图通过下面的详细说明将更清楚地理解本发明的上述及其它目的，特征和其它优点，其中：

图1显示蛇床子的乙醇提取物对枯草杆菌孢子的杀菌作用；

图2显示制备蛇床子的乙醇提取物的过程；

图3显示蛇床子的乙醇提取物对枯草杆菌孢子的杀菌作用取决于其浓度；

图4显示随着时间变化蛇床子的乙醇提取物对枯草杆菌孢子的杀菌作用；

图5显示由蛇床子的乙醇提取物制备己烷提取物和水提取物的过程；

图6显示乙酸冰片酯和乙酸香叶酯的化学结构和杀菌机理，其是蛇床子的乙醇提取物的主要有效成分；

图7显示枯草杆菌孢子的显微观察，其不用任何提取物处理，或用由蛇床子的乙醇提取物的己烷提取物或水提取物处理；和

图8显示枯草杆菌孢子的显微观察，其不用任何提取物处理，或用蛇床子的乙醇提取物或用由蛇床子的乙醇提取物的己烷提取物或水提取物处理。

发明详述

一方面，本发明涉及一种用于杀灭产孢子微生物的孢子的组合物，其包含蛇床子的有机溶剂提取物。

在此使用的术语“提取物”是从植物中分离的活性成分，是指具有杀菌和对产孢子微生物的孢子和营养细胞有杀灭活性的物质。提取物使用例如乙醇的有机溶剂通过萃取过程制备。该提取物包含有机溶剂提取物，其干粉，和使用其制备的所有配方。本发明的提取物是蛇床子提取物。

在本发明中，“蛇床子”指属于伞形科(Family Umbelliferae)，小窃衣光叶水菊(Torilis japonica Decandolle)和蛇床(Cnidium monnieri(L.)Cussion)植物的干燥的果实，并包含所有蛇床子的野生型，杂交和突变型。

蛇床子在中草药中已经使用了很长时间，用于治疗包含痒，皮肤伤口，湿疹和疖的各种皮肤疾病。同样，已知蛇床子对滴虫阴道炎具有一定的治疗作用。除了在中草药中使用治疗皮肤病之外，蛇床子最近作为杀虫剂使用。Nurayama等报导蛇床子具有收敛和消炎作用(Shokubutsu Kenkyn Zasshi，3，181，1926)。Itokawa等报导蛇床子通过倍半萜(sesquiterpene)的作用实现镇静作用(Shoyakugaku Zasshi，37，223，1983)。Shindo报导蛇床子提取物具有大于80％的补体抑制作用(Wakakanyaku Symposium，16，76，1983)。韩国专利申请号2000-0006823公开了一种包含蛇床子提取物用于减轻皮肤骚痒的组合物。韩国专利申请号1995-013750公开了抗风湿，消炎和止痛的药。

蛇床子的主要成分包括L-莰烯，佛手内酯，β-桉油醇，二氢山芹醇，圆当归素，白芷素，异茴芹内酯和anthotoxol。蛇床子也包含大约1.3％的精油。

虽然传统上在中草药中蛇床子是作为皮肤病的治疗剂而被使用的，但它对孢子的杀菌作用还不是已知的。本发明的蛇床子提取物特征在于杀灭上述产孢子微生物和孢子的营养细胞，该孢子可以在例如高温，酸，碱，干燥，化学试剂和辐射等恶劣环境下存活。本发明人通过测量OD值和全部细菌细胞数量，分析100种植物乙醇提取物对枯草杆菌孢子的杀菌效果。结果发现蛇床子提取物具有将枯草杆菌孢子减少到10³-10⁴CFU/ml(99.9-99.99％失活)的优秀的杀菌效果。该杀菌效果比传统大约10¹孢子的杀灭效果高100倍以上。此外，本发明的蛇床子提取物的特征在于通过诱导孢子皮层的破裂损伤来诱导孢子死亡，而不是简单地抑制耐热杆菌属孢子的萌发。

在此使用的术语“产孢子微生物”指产生孢子的所有微生物，并包含真菌和细菌。本发明的蛇床子提取物对所有产孢子微生物的营养细胞和孢子具有优秀的杀菌效果，并且特别地对产孢子细菌的营养细胞和孢子具有优秀的杀菌效果。产孢子细菌的实施例包含杆菌属的细菌，其包含纳豆菌(Bacillus natto)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，Bacillus stearothermopjilus，和凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)；和梭菌属(Clostridium)的细菌，其包含丁酸梭菌(Clostridium botulinum)，丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，梭状芽孢杆菌(Clostridum sporgenes)，和魏氏梭菌(Clostridium welchii)。

在本发明中，蛇床子是用有机溶剂提取的。得到的提取溶液可以立即使用，但优选地可以在过滤和干燥后使用。

本发明的提取物通过包含研磨蛇床子，以溶剂提取它，过滤提取物和干燥该滤液的过程制备。

蛇床子可以用例如甲醇，乙醇，异丙醇，丁醇，乙烯，丙酮，乙醚，氯仿，乙酸乙酯，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，或二甲基亚砜(DMSO)的有机溶剂，在草药的有效成分不被破坏的条件下，或在这种破坏最小化的条件下，在室温或稍高的温度下提取。优选地，在20℃-30℃下提取大约12至大约48小时。由于草药的有效成分的提取程度和损失可能根据使用的有机酸而变化，因此应该选择适当的有机酸。过滤是从该提取物中去除悬浮的固体颗粒的步骤。固体颗粒的去除可以通过经过棉花，尼龙或类似物实现，或通过冷冻过滤，或离心实现，但本发明不被限制在这些方法中。滤液的干燥可以通过冷冻干燥，真空干燥，热空气干燥，喷雾干燥，压力干燥，泡沫干燥，高频干燥，和红外线干燥实现，但本发明不被限制在这些方法中。该过程还可以在干燥步骤前包含浓缩滤液的步骤。如果需要，该过程还可以包含研磨最终干燥提取物的步骤。

在本发明的详细实施例中，蛇床子用乙醇在25℃下进行24小时搅拌提取，并通过Whatman滤纸以过滤掉不溶于水的物质。该滤液在44℃下的真空中浓缩并冷冻干燥以获得蛇床子的提取物。

根据本过程制备的蛇床子的有机溶剂提取物包含乙酸冰片酯和乙酸香叶酯。

用己烷提取蛇床子的乙醇提取物并鉴定得到的己烷提取物中具有对孢子杀菌有杀菌活性的有效成分。结果，其中成分包含松萜，甲基·异丙基苯，1，8萜二烯，蛇床子素，莰烯，乙酸冰片酯和乙酸香叶酯，乙酸冰片酯和乙酸香叶酯成分具有疏水和亲水基团并因此可以作用表面活性剂，对产孢子微生物的营养细胞和孢子显示出主要的杀菌效果。

两种主要的有效成分乙酸冰片酯和乙酸香叶酯通过直接破坏由大量蛋白质组成的孢子最外层的皮层的表面结构杀死孢子。这些成分都具有亲水的羟基(OH)，酯基(RCOOR)和羧基(RCOOH)及疏水的甲基(CH₃)，由于这种类似表面活性剂的结构，这些成分的一个分子同时结合到营养细胞的细胞壁和细胞膜的亲水和疏水基上，使营养细胞改变并损伤，并且也同时结合到孢子皮层的亲水和疏水基上，使蛋白质成分改变，从而引起芽孢外被的破裂损伤，从而最终杀灭营养细胞和孢子。

此外，根据本方法制备的蛇床子的有机溶剂提取物包含丙氨酸，甘露醇和木糖醇。

当将蛇床子的乙醇提取物的水提取物添加到孢子悬浮液中时，孢子萌发的最初阶段由萌发刺激物启动。萌发刺激物包含在蛇床子的乙醇提取物中，它们是丙氨酸，甘露醇和木糖醇。

目前已知的萌发刺激物包含具有例如L-丙氨酸，L-氨基丁酸，氨基异丁酸，L-缬氨酸，L-异亮氨酸，L-半胱氨酸和L-谷氨酸盐的疏水烷基基团的氨基酸，焦糖，和L-天冬酰胺，其与L-丙氨酸有不同的诱导萌发机理。此外，例如葡萄糖，甘露糖，木糖，鼠李糖和蔗糖的醛糖，和醛糖的脱氧衍生物，2-脱氧葡萄糖，和醛糖的内酯衍生物，葡萄糖-1，4-内酯和半乳糖-1，4-内酯，甘露醇，山梨醇，木糖醇，等等，它们都是已知的基于碳水化合物的萌发诱导剂。此外，钠离子，钾离子和磷酸盐离子已知通过L-丙氨酸触发很大程度上刺激萌发，但它们本身不作为萌发刺激物。GC-MS分析显示，根据本发明的蛇床子乙醇提取物包含大量的丙氨酸，甘露醇和木糖醇。

孢子萌发是包含如下阶段的过程：阶段1，萌发刺激物结合到孢子受体；阶段2，触发萌发的最初阶段；阶段3，水渗透进入脱水的孢子核，因而发生耐热损失，并且吡啶二羧酸和钙离子从孢子核释放出来；阶段4，此时这种核心的再水化引起孢子皮层的水解；阶段5，此时由于孢子核心的膨胀，该核的中心区域形成裂缝；和阶段6，此时释放核细胞，完成该萌发过程。扫描电子显微镜观察发现，包含在蛇床子的乙醇提取物的水提取物中的孢子萌发刺激物在孢子萌发的阶段1和阶段2产生作用。同样，由于蛇床子的乙醇提取物的水提取物不包含除萌发刺激物外的特殊营养物，因此在阶段4不会导致皮层水解，但仅仅引起芽孢外被的局部损伤，也就是说，通过产生裂缝形成通道允许己烷提取物的杀菌成分扩散进入芽孢外被。也就是说，丙氨酸，甘露醇和木糖醇仅仅具有导致芽孢外被改变的萌发刺激作用，而不会影响涉及孢子DNA从孢子核心释放出来和将孢子转变成营养细胞的阶段。

根据本发明的蛇床子的有机溶剂提取物显示对于孢子杀菌的增效作用，其由丙氨酸，甘露醇和木糖醇的萌发刺激物和作为表面活性剂的乙酸冰片酯和乙酸香叶酯的天然杀菌物质的协同作用产生。当孢子萌发的最初阶段通过萌发刺激物激活时，在该芽孢外被层表面形成裂缝。随后，作为表面活性剂的天然杀菌物质乙酸冰片酯和乙酸香叶酯通过所形成的裂缝渗透进入该孢子并破坏该孢子皮层和核心的成分和结构，最终导致该孢子的死亡。这种杀灭孢子的效果比单独使用己烷提取物更有效。也就是说，蛇床子的有机溶剂提取物，优选乙醇提取物，具有比杀灭孢子的效果大约是10¹的传统杀菌材料高100倍的优秀的杀灭孢子的效果，通过乙酸冰片酯和乙酸香叶酯成分介导的直接杀菌机制提供大约10¹的杀菌效果，和通过包括丙氨酸，甘露醇和木糖醇的萌发诱导剂介导的间接杀菌机制提供大约10²的杀菌效果。此外，由于本发明的蛇床子提取物允许在食品加工中在低温没有热处理下杀灭孢子，其不会引起营养物的破坏或质量变质。

另一方面，本发明涉及一种产孢子微生物的孢子杀菌的方法，其基于用该组合物对孢子进行处理。

该组合物在有效量中使用，但该处理方法不被具体限制。

通过下面的实施例可以更好的理解本发明，该实施例是为了说明本发明，并不是为了限制本发明。

实施例1：植物提取物的制备

参见图2，植物提取物根据下述程序从包含蛇床子的植物材料中制备。

洗涤和研磨

包含蛇床子的植物材料用纯水洗涤以去除存在于该植物材料表面的污染物，如粉尘和其它杂质。然后洗涤过的植物材料使用研磨机分别精细地研磨，并测量每个研磨产物的含水量。

乙醇提取物

将75％的可食用乙醇添加到粉末状蛇床子和其它粉末状材料中，最终浓度为0.1％，在室温(25℃)下搅拌24小时混合。

过滤

与乙醇混合完成后，每种植物材料通过Whatman滤纸NO.2过滤。剩下的颗粒再次经过乙醇提取步骤并随后过滤。该一次和二次滤液混合在一起并用于下一步骤中。

通过溶剂蒸发浓缩

为浓缩该混合的滤液，在真空中44℃下蒸发溶剂。

冷冻干燥

冷冻干燥经真空浓缩的蛇床子乙醇提取物提供具有低含水量的浆状，并用于产孢子微生物的营养细胞和孢子的杀菌试验。

己烷提取物的制备

蛇床子的乙醇提取物与100％的己烷混合，在室温(25℃)下搅拌24小时。回收上清夜用于产孢子微生物的营养细胞和孢子的杀菌试验。

水提取物的制备

包含蛇床子的植物材料的乙醇提取物分别用水混合，在室温(25℃)下搅拌24小时。回收上清液并用于产孢子微生物的营养细胞和孢子的杀菌试验。

实施例2：杆菌孢子的制备

选择枯草杆菌(Bacillus subtilis)孢子用于产孢子微生物的杀菌试验。特别是，使用枯草杆菌ATCC 6633，其天然并丰富地存在于食品例如混合有红胡椒的浓豆浆，酱，红胡椒粉，香料，干制蔬菜等等中。

继代培养枯草杆菌ATCC 6633的营养细胞，在胰酶大豆琼脂(TSA)平板上划线接种，在30℃下培养48小时。然后该平板在5℃的低温下存放并用作种子培养。通过显微镜观察鉴定种子培养没有形态学异常后，将其涂布在含硫酸镁(NAMS)的营养琼脂平板上，在30℃下培养48小时。在产生10¹⁰-10¹²的孢子后，平板用生理盐水洗涤，并且该孢子用白金圈刮除并转移到无菌试管。然后该孢子在4℃，12000rpm下离心两分钟，并再一次进行该种离心。显微镜观察确定孢子的状态，该颗粒经开关超声波处理5分钟仅使营养细胞受到破坏，然后并再次离心。通过Dorner方法进一步确认孢子形成，并且该孢子在-20℃下存放直到使用于杀菌试验。

实施例3：蛇床子提取物对孢子的杀菌效果的评估

为了寻找对孢子具有杀菌作用的天然物质，使用共有100种已知的具有杀菌活性的植物材料，其中包括包含多香果，罗勒，黑胡椒，香菜，芹菜，桂皮，丁香，胡荽，孜然芹，茴香，和马郁兰的36种草本香料；包含韭，艾蒿，红胡椒，青椒(grossum greenpimentos)，豆瓣菜，橄榄，萝卜芽，番茄，马铃薯，生姜，绿茶，葡萄，金色奇异果(golden kiwis)，桃，葡萄柚，和柠檬的27种蔬菜和热带水果；在传统中药中使用的37种药材，其含有连翘，当归，木瓜，木通，升麻，金银花，黄连，和蛇床子。杀菌植物材料用75％的乙醇提取，在真空中浓缩，并冷冻干燥以形成含水的或粉末状的杀菌材料。然后，筛选该乙醇提取物以确定对产孢子微生物的孢子和营养细胞的杀菌有效的杀菌植物材料。通过600nm下的光密度分析并通过在营养琼脂平板上生长的活细胞的总数计数对典型产孢子微生物的枯草杆菌孢子进行杀菌试验。

光密度分析是一种通过对在胰酶大豆肉汤(TSB)中37℃下培养18小时的营养细胞和孢子在600nm下的OD值测定来间接分析营养细胞和孢子生长程度的方法。首先通过光密度分析将认为在杀菌中有效的植物材料进行筛选作为候选者。然后，通过活细胞计数法对候选者进一步评估它们的杀菌效果。具体地，将孢子悬浮液与生理盐水和天然杀菌材料(1％的最终浓度)混合。该混合物在30℃下搅拌3小时，然后在12000rpm下离心。将认为含有添加的杀菌材料的上清夜去除后，在Ependorf试管中剩余的颗粒用蒸馏水覆盖并再次离心以消除残留的杀菌材料。重复该洗涤步骤三次以获得仅仅用天然杀菌材料处理的孢子。这样做是为了评估天然杀菌材料对纯孢子样品的杀菌效果。如果该杀菌物质没有完全去除，残留的杀菌物质可能对由总活细胞计数得到的孢子中产生的营养细胞显示出它们的杀菌效果，从而就使得它难以评估对于孢子的准确杀菌效果。在这点上，该杀菌材料通过水洗涤完全去除，并且该孢子颗粒再悬浮在0.85％的生理盐水中，涂抹在TAS平板上，并在37℃下培养24小时和48小时。然后计数活细胞总数以确定天然杀菌材料对孢子和营养细胞的杀灭效果。此外，该杀菌效果也在天然杀菌材料的不同浓度下检测，以确定最佳的浓度和营养细胞和最小生长抑制浓度(MICs)，用于杀灭孢子的有效浓度。

每种候选者杀菌材料以相对孢子悬浮液1％的浓度添加到孢子悬浮液中，在30℃下培养3小时，并对杀菌和生长抑制效果进行评估。结果，发现蛇床子的乙醇提取物显示出对营养细胞和孢子的10³最高杀菌效果(图1)。此外，蛇床子的乙醇提取物，中药材，栀子和牛蒡子胖大海，及草本香料，胡荽(Coriandum sativum)，显示出大约10¹CFU/ml的减少枯草杆菌孢子的杀菌效果。发现剩余的96种植物材料没有杀菌效果或有较小的杀菌效果，其中观察到的差异不明显。

相关文献和专利公开检索导致发现：与大多数具有大约10¹的杀菌和生长抑制效果的天然杀菌材料相比，本发明的乙醇提取物具有大约100倍或者更高的优秀的杀菌效果。

实施例4：根据蛇床子的来源和种类评价其对孢子的杀菌效果

为了确定不同来源和种类的蛇床子对枯草杆菌孢子的杀菌效果，根据实施例1中的相同方法处理产于韩国和中国的小窃衣光叶水菊(Torilis japonica Decandolle)和蛇床(Cnidium monnieri(L.)Cussion)并对其杀菌效果进行相互比较。结果，在不同来源和种类的蛇床子之间没有观察到太大的差异，蛇床子主要显示出对枯草杆菌孢子的10²至10³的杀菌效果。同时，它们都显示出10％的相似产率。这些结果显示所有种类的蛇床子都可用于杀灭孢子。

实施例5：根据蛇床子提取物的浓度和时间评价其对孢子的杀菌效果

为了研究蛇床子的乙醇提取物的浓度对枯草杆菌孢子的杀菌作用，蛇床子的乙醇提取物以相对孢子悬浮液的0.01％，0.05％，0.1％，0.5％和1.0％的浓度添加到孢子悬浮液中。蛇床子的乙醇提取物在0.1％的浓度下显示出10²的孢子减少(99％失活)，并在0.5％和1.0％浓度下显示出10³-10⁴的孢子减少(99.9-99.99％失活)。考虑感官和包含风味、生产成本和销售价格的经济因素后最佳的最小生长抑制浓度发现是0.1％，和0.5％-1.0％浓度(图3)。

为了研究蛇床子的乙醇提取物随时间变化对枯草杆菌孢子的杀菌作用，孢子悬浮液用蛇床子乙醇提取物处理，并在所给时间点0.5小时，1小时，2小时，3小时和6小时测定杀菌效果。蛇床子的乙醇提取物在30分钟后显示10²孢子减少(99％失活)的有效杀菌效果，并在1小时后显示10³-10⁴的孢子减少(99.9％-99.99％)的最高杀菌效果。在处理大约1小时后观察到优秀的杀菌和生长抑制效果，由杀菌物质的直接杀菌效果和萌发刺激物质的间接杀菌效果产生具有10³或更多的孢子减少(图4)。

实施例6：蛇床子的乙醇提取物的上层相和下层相对孢子杀菌效果的评估

检测蛇床子乙醇提取物的上层相和下层相对枯草杆菌孢子的杀菌效果。发现下层相几乎没有杀菌效果。相反地，上层相显示出10²的孢子减少，这相似于使用蛇床子全部乙醇提取物的孢子减少效果。这些结果表明蛇床子的乙醇提取物的杀菌效果由上层相的杀菌成分产生。

实施例7：蛇床子乙醇提取物的己烷提取物的制备

为了确定对产孢子微生物起杀菌活性的主要成分，用己烷提取蛇床子的乙醇提取物(图5)。文献检索和使用试验设备的分析结果发现，用己烷提取的包含疏水基团的杀菌成分包含松萜，甲基·异丙基苯，1，8萜二烯，蛇床子素，莰烯，乙酸冰片酯和乙酸香叶酯，乙酸冰片酯和乙酸香叶酯，其由于具有疏水和亲水基团的结构上的特点可以用作表面活性剂，是对产孢子微生物起杀菌活性的主要成分。图6显示两种成分的化学结构。

例子8：蛇床子乙醇提取物的水提取物的制备

为了确定蛇床子乙醇提取物的杀菌机理，蛇床子的乙醇提取物用水提取，并且分析水提取物的成分。

水提取物使用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)进行成分分析。发现水提取物包含大量丙氨酸，甘露醇和木糖醇，它们是已知的萌发刺激物。这些分析结果表明当枯草杆菌孢子用水提取物处理时，萌发刺激物通过诱导孢子萌发引起外层的破裂损伤，该外层是高度耐化学杀菌物质的，并且蛇床子乙醇提取物中的杀菌成分乙酸冰片酯和乙酸香叶酯的作为表面活性剂通过形成的裂缝渗透进入该孢子，最终破坏该孢子核。图7显示枯草杆菌孢子的显微镜观察图。该孢子未用任何提取物处理，或用蛇床子乙醇提取物的己烷提取物或水提取物在30℃下处理3小时，并在5小时后显微镜下观察。当包含在孢子悬浮液中的孢子在TSB营养基中培养时，发现孢子萌发并生长成营养细胞。当孢子用己烷提取物处理时，没有观察到萌发的孢子，表明由于芽孢外被受到破坏而发生局部直接杀菌。当孢子用水提取物处理时，孢子萌发的最初阶段由萌发刺激物启动。由于通过水提取物产生了最初阶段的萌发，该孢子变得对杀菌成分有较少的耐受性，并且在这种情况下，己烷提取物的杀菌成分效果加倍。图8显示枯草杆菌孢子的扫描电子显微镜观察，用或不用蛇床子提取物对其进行处理。当枯草杆菌孢子用蛇床子乙醇提取物处理时，孢子结构被破坏，并且孢核消失，表明孢子被杀灭。己烷提取物的处理引起芽孢外被的局部损伤。水提取物的处理通过萌发初期阶段的诱导引起孢子结构的改变。

工业实用性

根据本发明用于杀灭产孢子微生物的孢子和营养细胞的包含蛇床子有机溶剂提取物的组合物显示对产孢子微生物孢子和营养细胞的优秀的杀菌效果，并因此具有在低温无须热处理下能够有效杀灭孢子以作为天然杀菌材料的多种商业应用。