用于鉴定RHO激酶(ROK)调节物的高通量酶联免疫吸附测定(HT－ELISA)

摘要

本发明涉及通过生物素化的肽测量ROK(Rho激酶)蛋白活性的检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及通过生物素化的肽测量ROK(Rho激酶)蛋白活性的检测方法。

发明内容

本发明涉及用于鉴定调节(刺激、减弱、维持)ROK蛋白活性的化合物的检测方法，其中

a]提供能够被ROK蛋白磷酸化的肽；

b]提供ROK蛋白；

c]提供抗体，此抗体能够识别来自a]的被磷酸化的肽；

d]提供化合物；

e]在能够使该肽发生磷酸化的条件下，孵育来自a]的肽与来自b]的ROK蛋白以及来自d]的化合物；

f]按照e]的孵育完成之后，使用来自c]的抗体检测该肽的磷酸化；

g]可以将来自f]的结果与另一实验结果进行比较，所述另一实验中对来自a]的肽与来自b]的ROK蛋白而不含d]所给的化合物进行孵育。

可以以酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RadioImmun Assay，RIA)的形式容易地实现这样的检测。

至于如前所述测定步骤a]的肽可以由15至25个氨基酸之间的大小组成。此肽可以包含如下氨基酸序列或由其组成：GGGGAKRRRLSSLRASTS。可以以化学修饰的形式(如生物素化或连接于DNA或抗体)使用测定步骤a]的该肽。

如前所述测定步骤b]的ROK蛋白可以包含人蛋白质的氨基酸序列，或者可以从人生物材料衍生或取得。可以通过不同技术(例如通过对生物材料的操作或包括重组特性的加工步骤)来制备这样的ROK蛋白。可以例如将如前面公开的本发明的检测方法用于高通量筛选调节ROK蛋白活性的化合物。

本发明还涉及成套药盒，其包括

a]能够被ROK蛋白磷酸化的肽；

b]ROK蛋白；

c]能够识别来自a]的被磷酸化的肽的抗体；

d]可能的第二抗体，其能够识别来自c]的抗体，和/或连接于标记系统(如碱性磷酸酶、β-葡糖醛酸酶、过氧化物酶、其它酶)；

e]可能的试剂、缓冲液和/或用于实现来自a]的肽磷酸化的设备和/或ELISA装置。

以上提到的成套药盒的步骤a]的肽由15至25个氨基酸之间的大小组成。该肽可以包含以下氨基酸序列或由组成：GGGGAKRRRLSSLRASTS。根据测定步骤a]的肽可以以化学修饰的形式(如生物素化、或连接于DNA或抗体)使用。如前所述测定步骤b]的ROK蛋白可以包含人蛋白质的氨基酸序列，或者可以从人生物材料衍生或取得。可以通过不同技术(例如通过生物材料的操作或包括重组特性的加工步骤)来制备这样的ROK蛋白。

本发明还涉及如前面提到的成套药盒的制备方法，其中

a]提供能够被ROK蛋白磷酸化的肽；

b]提供ROK蛋白；

c]提供抗体，此抗体能够识别来自a]的被磷酸化的肽；

d]提供可能的第二抗体，其能够识别来自c]的抗体和/或连接于标记系统(如碱性磷酸酶、β-葡糖醛酸酶、过氧化物酶、其它酶)；

e]可能的试剂、缓冲液和/或用于实现来自a]的肽磷酸化的设备，和/或ELISA装置。

f]来自a]至e]的组分被相应地包装并与说明书组合，所述说明书涉及成套药盒的其它组分以及ROK蛋白检测的操作步骤。

如前所述的成套药盒可以例如用于确定ROK蛋白的活性，或用于鉴定调节ROK蛋白活性的化合物，或用于高通量筛选。

此发明还涉及肽，所述肽包含如下氨基酸序列或由其组成：GGGGAKRRRLSSLRASTS。可以对这样的肽进行化学修饰，例如生物素化。本发明还涉及这样的肽用于测量ROK蛋白活性的用途。

本发明的化合物应该意指通过化学合成产生或从天然来源分离的任何有机化合物和/或碳水化合物。这样的化合物的分子量可以在50至50 000道尔顿之间。

认为本发明的蛋白质在处于其行使活性的生物学环境(特别是活细胞部分)中时是有功能的。能够通过例如测定检测到这样的活性。转运蛋白是有功能的，例如当此转运蛋白将化合物，特别是该转运蛋白的生物学底物从细胞外转移到细胞内区室时(反之亦然)。离子转运蛋白的生物学底物由例如单价和/或二价离子或其它离子组成。葡萄糖转运蛋白的底物是例如葡萄糖。多种药物抗性蛋白的底物是例如单独的药物或缀合于谷胱甘肽或葡糖酸盐的药物。

本发明中的蛋白质操作可以由本领域技术人员使用依据Hohn Wiley和Sons出版的《现代蛋白质科学操作手册》(编者：John E.Coligan、Ben M.Dunn、Hidde L、Ploegh、David W.Speicher、Paul T.Wingfield；0-471-11184-8-Looseleaf；0-471-14098-8-CDROM)的操作手册完成。

关于分子生物学技术的操作(如克隆、细胞转化、测序、启动子修饰、蛋白质表达或其它)可以由本领域技术人员使用依据JohnWiley和Sons出版的《现代分子生物学手册》(编者：Fred M.Ausubel、Roger Brent、Robert E.Kingston、David D.Moore、J.G.Seidman、John A.Smith、Kevin Struhl；0-471-50338-X-Looseleaf；0-471-306614CDROM)的操作手册完成。

生物材料意指含有遗传信息并能够自我增殖或在生物系统中增殖的任何材料。重组的生物材料是指通过重组技术改变或修饰而产生的任何生物材料。在John Wiley和Sons出版的《现代分子生物学手册》(ISBN：0471-50338-X-Looseleaf or0-471-30661-4-CD-ROM)中定义了重组技术。

生物细胞的操作可以由本领域的技术人员使用依据JohnWiley和Sons出版的《现代细胞生物学手册》(编者：Juan S.Bonifacino、Mary Dasso、Jennifer Lippincott-Schwartz、Joe B.Harford、Kenneth M.Yamada；0-471-24108-3-Looseleaf；0-471-24105-9-CDROM)的操作手册完成。

具体实施方式

实施例

Rho激酶(ROK)代表高度确认的心血管疾病的靶标。因此，对特异性ROK抑制剂的研究是心血管领域工作的许多团队的焦点。在此，我们描述了对ELISA的改进，使其对ROK活性具有特异性。ROK-ELISA检测被ROK磷酸化的肽量。ROK抑制剂抑制ROK活性并且因此减少ROK介导的肽磷酸化的量。在中度通量的96孔板以及在高通量的384孔板发展了ROK-ELISA技术。

方案：

母液：

生物素化的S6肽：在25mM PH 8.0的Tris缓冲液中以1ml的等分试样保存于-20℃(5mg/ml)。

重组的有活性的ROK：以10μl的等分试样保存于-20℃(1mg/ml)。

ATP 100mM Sigma Cat#A-6419 Lo#29H7051-20℃终止溶液 3N HCL 盐酸标准液(Sigma)室温MgCL₂ 1M MgCl₂(Sigma)室温BSA 10％ Sigma-20℃DTT 1M Sigma-20℃ODP-过氧化物酶底物 Sigma2-8℃Superblock缓冲液 +0.2％吐温20 Superblock(封闭缓 冲液以TBS配制； Pierce Cat#37535)， 吐温202-8℃洗涤缓冲液(PBS) PBS(1×) +0.2％吐温20 PBS w/o CaCl₂和 MgCl₂，Gibco# 2006-01、吐温202-8℃反应缓冲液 25mM Tris pH7.4； 0.02％BSA；2mM DTT现用现配

1)在链霉素抗生物素蛋白包被的孔中向每孔加入0.5ng生物素化的S6肽，于室温包被2小时或过夜

2)每孔加入100μlPBS洗去过量的S6肽，洗3次

3)在含有MgCl₂的反应缓冲液中将10×ATP溶液配制为期望浓度，冰上操作

4)在反应缓冲液中稀释ROK至终浓度：每孔10ng，冰上操作

5)将10×底物溶液配制为期望的浓度

ROK-ELISA 96孔板

总体积＝100μl

1)用80μl的ROK使抑制剂(10μl的10×浓缩液)以期望的终浓度预孵育10分钟

2)加入10μl的10×ATP溶液至期望的终浓度

3)在30℃孵育该板一小时

4)用100μl的500mM EDTA溶液终止激酶反应

5)移去所有孔的上清液

6)每孔加入100μl的单克隆磷酸化特异性第一抗体(1∶1000)，室温孵育15分钟

7)每孔加入100μl的第二抗体(1∶2000)，室温孵育1小时

8)移去上清液，每孔加入200μl PBS，洗5次

9)向所有的孔加入100μl的底物溶液，并且在室温孵育10分钟

10)向所有的孔每孔加入100μl终止溶液

11)于492nm测量OD值

ROK-ELISA 384孔板

总体积＝10μl

1)用8μl的ROK使抑制剂(1μl的10×浓缩液)以期望的终浓度预孵育10分钟

2)加入1μl的10×ATP浓缩液至期望终浓度

3)将该板于30℃孵育1小时

4)用10μl的500mM EDTA溶液终止激酶反应

5)移去所有孔的上清液

6)每孔加人10μl的单克隆磷酸化特异性第一抗体(1∶1000)，并于室温孵育15分钟

7)每孔加入100μl的第二抗体(1∶2000)，室温孵育1小时

8)移去上清液，每孔加入30μl PBS，洗涤5次

9)向所有的孔每孔加入10μl底物溶液，室温孵育10分钟

10)向所有的孔每孔加入10μl终止溶液

11)于492nm测量OD值。

材料

ROK(ROKα/ROCK-II(活性重组体11-550个氨基酸或更长)、生物素化的S6肽(生物素-GGGGARRRLSSLRASTS)、链霉抗生物素蛋白包被的96孔板或384孔板(如，Roche StreptaWell，High Bind(transparent)1989685/198967，Roche Diagnostics，Mannheim)、来自Transduction Labs的磷酸化特异性的单克隆抗体(克隆22a，BD Biosciences，Heidelberg)、羊-抗-小鼠IgG-HRP200μg/0.5ml(Santa Cruz Cat#sc-2005)

附图说明

图1：描述了根据SEQ ID NO.1的氨基酸序列

图2：代表ROK ELISA的典型布局

H行1-6孔作为激酶反应的对照孔。H行1-3孔没有激酶而含有ATP，并且呈现最低信号。H行4-6孔含有激酶及ATP，并且呈现最大信号。H行7-12孔作为参照化合物的浓度关系。使用所有其它的孔以获得目的化合物的浓度关系。请注意在E行1-7孔为灰色，其表明高度有效的抑制剂在所使用的全部浓度范围内抑制ROK介导的底物磷酸化。对于用单个点确定的IC50评估，可以在96孔板同时检测14种化合物和一个参照化合物。

图3和图4A和B表示来自ROK ELISA的结果(抑制百分率和IC50计算)。

                            序列表

<110>塞诺菲-安万特德国有限公司

<120>用于鉴定RHO激酶(ROK)调节物的高通量酶联免疫吸附测定(HT-ELISA)

<130>DEAV2004/0080

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>18

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工序列

<400>1

Gly Gly Gly Gly Ala Lys Arg Arg Arg Leu Ser Ser Leu Arg Ala Ser

1               5                   10                  15

Thr Ser