胱天蛋白酶－2抑制剂及其生物学用途

摘要

本发明涉及新的选择性胱天蛋白酶－2抑制剂，它能识别胱天蛋白酶－2，并且防止和阻断其活性，所述抑制剂基于以下主链：2－喹啉基羰基－L－缬氨酰－L－天冬氨酰(甲酯)－L－缬氨酰－L－丙氨酰－L－天冬氨酰(甲酯)2，6－二氟苯酯(SEQ 1)及其衍生物，SEQ 1相当于结构式(Ia)或(Ib)。将所述抑制剂用于预防和治疗与胱天蛋白酶－2相关的疾病。

说明书

本发明涉及胱天蛋白酶-2抑制剂及其生物学用途，特别是用于治疗局部和全面脑缺血的用途。

I.发明领域

本发明属于医学生物学和化学领域，并且涉及新型化合物和药物组合物，其能抑制促进细胞凋亡的(pro-apoptotic)胱天蛋白酶-2(Nedd-2；Ich-1)，以治疗与胱天蛋白酶-2活性相关的疾病和损伤。更确切地：

(a)本发明涉及用于阻断、预防或治疗细胞死亡，特别是体内脑细胞死亡的手段、方法和产品。

(b)本发明涉及以下发现：胱天蛋白酶-2是在体外和在体内病理学状态中抑制神经元细胞死亡(特别是细胞凋亡)的上游主要关卡，所述病理学状态包括脑缺氧-缺血(H-I)损伤和中风样状态，其导致了脑损伤(在神经元或其他非神经元细胞中)：例如，MCAO(大脑中动脉闭塞)，全面(由于在心搏停止或心血管损伤期间的血流量减少或缺氧造成)或局部的、短暂或永久的、成年人或新生儿的H-I，有或没有缺氧和/或低血糖的缺血，有或没有再灌注的H-I。

(c)本发明涉及以下发现：选择性胱天蛋白酶-2抑制剂(例如，Qco-VDVAD-dfp)能防止或减少体内脑细胞死亡。

(d)本发明涉及以下发现：选择性胱天蛋白酶-2抑制剂(例如，Qco-VDVAD-dfp)能在体内病理学状态中防止或减少脑细胞死亡，所述体内病理学状态包括局部短暂新生儿H-I之后的缺血性损伤。

(e)本发明涉及以下发现：选择性胱天蛋白酶-2抑制剂(例如，Qco-VDVAD-dfp)能在体内病理学状态中防止或减少脑细胞死亡，所述体内病理学状态包括在心搏停止或心血管损伤期间的血流量减少或缺氧之后的成年人全脑缺血。

(f)本发明涉及特异的新的胱天蛋白酶-2抑制剂的新用途，包括局部(例如，脑室内，海马内...)输送或全身性(腹膜内，静脉内...)施用，以便减少病理学状态期间的脑细胞死亡，在所述病理学状态中，血流量和氧气压力受到干扰，即，脑的(短暂或永久性)局部或全面缺血。

II.支持本发明的数据

本发明涉及用于阻断、预防或治疗细胞死亡，特别是神经元细胞死亡的手段、方法和产品。

在胚胎发生期间出现神经元细胞死亡，以除去多余的神经元，从而确保适当的突触前和突触后连接，和使得能够形成功能性成体大脑。除了与正常衰老相关的有丝分裂后死亡之外，环境或遗传突变因素可以在急性损伤期间在成年人中诱导神经元死亡(例如，缺氧-缺血，中风，脊髓损伤，创伤)或慢性神经变性疾病。与这些病症相关的细胞死亡可能通过三种不同的机制发生，表现出坏死、自体吞噬或细胞凋亡的形态学和生物化学特征。生理学和病理学神经元死亡通常与缺陷的细胞凋亡调控和信号传导途径相关，上述变化在哺乳动物细胞内导致了主动的细胞自杀机制，可以划分成半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(胱天蛋白酶)-依赖型与胱天蛋白酶-独立型途径。

神经元细胞凋亡是主动的细胞自杀机制，它可以划分成一系列连续的阶段，包括开始、决定、执行和降解。这一连串的事件是由特殊机制的激活驱动的，涉及半胱氨酸-依赖型天冬氨酸特异性蛋白酶(胱天蛋白酶)的激活和可能起着决定性(或放大器)调节性细胞器作用的线粒体。实际上，线粒体改变包括线粒体内膜电化学梯度(Δψ_m)的消失，和产生细胞凋亡的因子的释放，如细胞色素c、Smac/Diablo和细胞凋亡诱导因子。一旦从线粒体中释放，这些效应子就会启动胱天蛋白酶-依赖型和/或胱天蛋白酶-独立型细胞质和细胞核分解。因此，线粒体因子与胱天蛋白酶组合，共同引起了细胞凋亡的降解阶段，导致细胞收缩、细胞核凝聚、细胞凋亡体散发和″吃了我″信号的出现，如在吞噬作用之前磷脂酰丝氨酸易位到细胞质膜的外部小叶中。

线粒体、胱天蛋白酶和其他事件在体外或体内神经元细胞凋亡期间的分别的作用仍然有待阐明，特别是相对缺血性或中风-样损伤而言。

正如所指出的，本发明人提供了能够在体外或在细胞中抑制胱天蛋白酶-2活性的有用的手段和分子，通过使用特异的体外胱天蛋白酶测定法和在神经元培养中的血清剥夺作为与体内缺血相关的实验模型。

本发明的新的选择性胱天蛋白酶-2抑制剂能识别胱天蛋白酶-2，并且防止和阻断其活性，所述抑制剂基于以下主链：2-喹啉基羰基-L-缬氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)-L-缬氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)2，6-二氟苯酯(SEQ1)

一种优选的分子相当于SEQ1。

其他优选的分子包括特别是在表1-14中所示的结构II至XIX。

本发明的另一个目的是提供能抑制促进细胞凋亡的胱天蛋白酶-2活性并且诱导细胞保护作用的产品(分子或制剂)。

本发明的另一个目的是提供治疗与胱天蛋白酶-2相关的疾病和损伤的产品和药物组合物以及方法。

本发明人业已开发了药理学特异性肽，优选基于五肽的分子，但不排除其他分子，用于直接抑制胱天蛋白酶-2活性，以便减弱由胱天蛋白酶-2介导的体外和体内细胞死亡。

这样的抑制剂能够防止或阻断细胞死亡中的胱天蛋白酶-2活性。所述细胞是神经元，或神经元细胞，或非神经元细胞。

上面定义的抑制剂可用于体内抑制胱天蛋白酶-2活性，以提供神经保护或脑保护作用。它们还可以用于体内抑制胱天蛋白酶-2活性，以提供细胞保护作用。

根据一个方面，本发明涉及在(全面或局部)缺血性损伤之后在脑中防止细胞死亡的方法。

正如由所述例子所表明的，本发明提供了用于阻断或预防或治疗细胞死亡，特别是在受损伤的(缺血的)脑中阻断或预防或治疗细胞死亡的手段、方法和产品。

正如所指出的，本发明人证实了特异性胱天蛋白酶-2抑制剂(单一腹膜内注射剂量)能在新生儿短暂缺氧-缺血脑损伤中诱导显著的梗塞减少。当在缺血发作之前或之后施用胱天蛋白酶-2抑制剂时获得了梗塞体积的减少。由所述抑制剂提供的细胞保护作用不是由温度(低温或高温)调控作用介导的，但是，体内胱天蛋白酶-2活性或胱天蛋白酶-2加工在注射所述抑制剂之后终止。

正如所指出的，本发明人证实了胱天蛋白酶-2抑制剂(单一剂量)的专一性脑室内(ICV)施用，导致了甲酚紫(Cresyl-Violet)强度染色的部分增强，在受损伤的细胞中没有摄取入Fluoro Jade B，细胞核形态学的改善或保持(Hoechst 33342)以及经抑制剂处理的大鼠行为的显著改善(缺血后重新进食；在关于自主活动性和反应性的实验中有较高的得分)。由所述抑制剂提供的细胞保护和行为效果不是通过温度(低温和高温)调控作用介导的。

根据另一方面，本发明还涉及能够防止胱天蛋白酶-2活性的分子，以及可用于治疗与胱天蛋白酶-2相关的疾病和损伤的药物组合物。

在对于胱天蛋白酶-2抑制的条件下将合成的分子导入人或动物中。所述导入步骤包括作为合适载体的分子的化学修饰或通过注射进行。

因此，本发明的另一个目的是提供包含特异性胱天蛋白酶-2抑制剂的药物组合物。

本发明的药物组合物包含治疗有效量的上述至少一种胱天蛋白酶-2抑制剂，以及药学上可接受的载体。

抑制剂的施用是通过(但不局限于)口、鼻、局部(脑室内、海马内或其他脑内输送，用于机械输送的仪器的脑内植入，例如用化合物或药物组合物浸渍过的Gelfoam)或全身性(腹膜内，静脉内...)途径，或脑内输送或作为气雾剂来施行的，以便减少体内脑细胞死亡。

本发明还涉及将所述胱天蛋白酶-2抑制剂用于生产用于预防或治疗与胱天蛋白酶-2活性相关的病理学的药物的用途。

本发明的药物组合物特别可用于预防、减轻和治疗具有细胞死亡的病理学，特别是在H-I损伤和中风-样状态脑损伤中：例如，全面或局部的、短暂或永久的、成年人或新生儿的H-I(有或没有缺氧/低血糖的缺血)，其根源在脑或心脏水平上，有或没有再灌注，或MCAO(大脑中动脉闭塞)。

本发明的药物组合物特别可用于：

-预防和/或治疗在慢性变性疾病例如神经变性疾病期间的细胞凋亡，包括阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、帕金森病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓延髓萎缩、朊病毒病、痴呆，或

-预防和/或治疗视网膜周细胞细胞凋亡、视网膜神经元细胞凋亡、青光眼、由于局部缺血导致的视网膜损伤、糖尿病性视网膜病，或

-预防和/或治疗癫痫，或

-预防和/或治疗脊髓损伤期间的细胞凋亡，或预防和/或治疗由于创伤性脑损伤、视网膜缺血造成的细胞凋亡，或

-预防和/或治疗在脑局部缺血的病理学状态期间的细胞凋亡，或

-提供脑保护作用，或

-预防和/或治疗与自身免疫性疾病和移植排斥相关的由细胞毒性T细胞和天然杀伤细胞介导的细胞凋亡，或

-预防和/或治疗心脏细胞的细胞死亡，包括心力衰竭、心肌病、心脏的病毒感染或细菌感染、心肌缺血、心肌梗死、和心肌缺血、冠状动脉旁路移植，或

-预防和/或治疗线粒体药物毒性，例如，由于化疗或HIV治疗而引起的，

-预防和/或治疗病毒感染或细菌感染期间的细胞死亡，或

-预防和/或治疗炎症或炎性疾病，炎性肠病，败血症和败血症性休克，或

-预防从滤泡到卵母细胞阶段、从卵母细胞到成熟卵子阶段和精子的细胞死亡(例如，冷冻和移植卵巢组织、人工受精的方法)，或

-在化疗之后保存女性和男性的生育能力，或

-保存雌性和雄性动物的生育能力，或预防和/或治疗黄斑变性和青光眼，或预防和/或治疗急性肝炎、慢性活动型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎，或

-预防和/或治疗脱发，所述脱发是由于男性型秃发、辐射、化疗或情绪应激而引起的，或

-治疗或缓解皮肤损伤(由于暴露于大剂量辐射、热、灼烧、化学品、阳光和自身免疫性疾病)，或

-预防骨髓异常增生综合征(MDS)中的骨髓细胞的细胞死亡，或

-预防和/或治疗胰腺炎，或

-预防和/或治疗呼吸综合征，或

-预防和/或治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣、肾小球肾炎、动脉粥样硬化和移植物抗宿主病，或

-预防和/或治疗与细胞凋亡增强相关的疾病状态，或

-预防植物性生物体(例如：植物、花、藻菌植物(蘑菇，海藻)...)中的细胞死亡。

本文所使用的术语“治疗”表示获得有益的或所需的结果(包括临床结果)的方法。有益的或所需的临床结果可以包括，但不局限于，减轻或缓解一个或多个症状或病状，减轻疾病程度，稳定(即不再恶化)疾病状态，防止疾病扩散，推迟或延缓疾病发展，缓解或减轻疾病状态，以及平息(部分或全部)，无论是可检测的或不可检测的。“治疗”还可以表示与如果不接受治疗所预期的存活时间相比延长了存活时间。

本发明还涉及治疗与细胞死亡相关的病理学(特别是缺血和中风损伤)的方法，包括施用治疗有效剂量的如上文所述的药物组合物。

在下面结合附图给出的数据中提供了本发明的确切的特征和优点，所述数据为：

III.胱天蛋白酶-2的肽和假肽抑制剂

1.Qco-VDVAD-dfp

Qco-VDVAD-dfp(SEQ1)是假肽(MW：827)，它能在体外选择性地抑制人重组胱天蛋白酶-2(IC₅₀＝80nM)，但不能抑制其他半胱氨酸-蛋白酶。它组合了五肽VDVAD(在天冬氨酸残基上被O-甲基(OMe)取代过的L-缬氨酰-L-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰)部分、喹啉基羰基和2，6-二氟苯酯主链。它的结构式是Ia/Ib，相应于喹啉核上有取代过的VD(OMe)VAD(OMe)-Oph的情形：例如，2-喹啉基羰基-L-缬氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)-L-缬氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)2，6-二氟苯酯(II，n＝0)。

2-喹啉基羰基-L-缬氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)-L-缬氨酰-

L-丙氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)2，6-二氟苯酯＝SEQ1

2.氨基酸侧链和官能团的修饰

本发明的其他新的选择性胱天蛋白酶-2抑制剂是基于下面的结构III的：

其中

(i)每一个氨基酸的绝对构型是L或D；

(ii)R¹和R²是氢原子，氘原子，C_1-20脂族基团，取代过的或未取代过的芳基，环烷基，萘基，取代过的萘基，2-苯并唑基，取代过的2-唑基，(CH₂)_n环烷基，(CH₂)_n苯基，(CH₂)_n取代过的苯基，(CH₂)_n(1-或2-萘基)，(CH₂)_n杂芳基，CH₂N₂，CH₂Y，OH，OR，NH₂，NHR，NR₂，SR，COR，CO₂R，CONR₂，CH₂OCOR，CH₂O-CO芳基，CH₂O-C(O)取代过的芳基(例如：2，6-二甲基苯甲酰氧基甲基)，CH₂O-C(O)取代过的芳基，CH₂O-C(O)杂芳基，CH₂O-C(O)取代过的杂芳基或CH₂OPOR₂；

(iii)R³，R⁴，R⁵和R⁶是二十种氨基酸(半胱氨酸除外)之一的侧链。例如，所述五肽还可以是Leu-Asp-Glu-Ser-Asp的类似物。R³，R⁴，R⁵和R⁶还可以是C_1-20脂族基团，环烷基，萘基，取代过的萘基，2-苯并唑基，取代过的2-唑基，(CH₂)_n环烷基，(CH₂)_n苯基，(CH₂)_n取代过的苯基，(CH₂)_n(1-或2-萘基)，(CH₂)_n杂芳基，CH₂N₂，(CH₂)_nZ，CH₂OCOR，CH₂OCO(芳基)，CH₂OCO(取代过的芳基)，CH₂OCO(杂芳基)，CH₂OCO(取代过的杂芳基)或CH₂OPOR₂；

(iv)R⁷是氢原子，R⁸是R，U，CO(CH₂)_nNH(U)，CO(CH₂)_nS(U)；

(v)U是(未)取代过的(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基，C_1-20直链或支链烷基，(CH₂)_n环烷基，(CH₂)_n苯基，(CH₂)_n取代过的苯基，(CH₂)_n(1-或2-萘基)，(CH₂)_n杂芳基，或标记基团，如荧光团标记或可用于电子显微术的标记；特别是生物素，二硝基苯基(DNP)，碘乙酰胺，DTNB，COR(例如，2-喹啉基羰基)，COOR，CO(CH₂)_nNH(Z)，吖啶衍生物(红色，黄色，橙色...)，荧光素衍生物(荧光素，FITC，FAM(羧基荧光素)，5-(和-6)-羧基萘并荧光素，羧基荧光素，BCECF，萘荧光素(naptofluorescein)...)，Oregon Green(2′，7′-二氟荧光素)染料(Oregon Green488，OregonGreen514...)，BODIPY(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸)染料(BODIPY FL，BODIPY TMR，BODIPY TR，BODIPY 630/650，BODIPY 630/665...)，Bimane，香豆素衍生物(氨甲基香豆素(AMC)，AMCA，氨基香豆素，二乙基氨基香豆素，羟甲基香豆素；羟基香豆素，甲氧基香豆素，AFC，...)，花青苷衍生物(藻蓝素，别藻蓝素(APC)，CY3.18，CY5.18，Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，Cy7...)，赤藓素/藻红素衍生物(R-藻红素(PE)，B-藻红素...)，APC/PE-Cy缀合物(PE-Cy5缀合物，PE-Cy7缀合物，APC-Cy7缀合物...)，钙黄绿素衍生物(钙黄绿素，SNAFL钙黄绿素...)，DANS，DANSA，Cascade Blue，萤光黄，NBD，Red 613，FluorX，若丹明衍生物(若丹明123，若丹明110，若丹明B，若丹明6A，若丹明6G，TRITC，X-若丹明，硫代若丹明(sulphorhodamin)，若丹明Red-X，Lissamine^TM若丹明B，DHR，若丹明Green...)，PerCP，Texas Red，TruRed，Alexa Fluo(Alexa Fluor 350，Alexa Fluor 430，AlexaFluor 488，Alexa Fluor 532，Alexa Fluor 546，Alexa Fluor 555，Alexa Fluor 568，Alexa Fluor 594，Alexa Fluor 633，Alexa Fluor647，Alexa Fluor 660，Alexa Fluor 680，Alexa Fluor 700，AlexaFluor 750...)，Q-DOTs^TM衍生物(655，605，585，525，...)，SNARF，Zenon^TM衍生物(Zenon^TM Alexa Fluor350，Zenon^TM AlexaFluor488，Zenon^TM Alexa Fluor555，Zenon^TM Alexa Fluor594，Zenon^TM Alexa Fluor647，Zenon^TM别藻蓝素，Zenon^TM生物素-XX，Zenon^TM R-藻红素，...)；NBD，Texas Red，QSY染料(QSY7，QSY9，QSY35，QSY21)，Hoechst(33342，33258)，DAPI，色霉素A3，光神霉素，SYTOX(蓝色，绿色，橙色)，Ethdium，溴化乙锭，7-AAD，TOTO染料，YOYO染料，TO-PRO染料，BOBO染料，JO-PRO染料，LO-PRO染料，PO-PRO染料，YO-PRO染料，噻唑橙，碘化丙啶(PI)，LDS 751，Indo染料(Indo-1...)，Fluo染料(Fluo-3...)，DCFH，pNA，SYBR green II，SyPro(Orange，Ruby)，EDANS，IR800，DiI，DiO，DiD，SNARF衍生物，Fura染料，QUIN染料，NANOGOLD颗粒，NANOGOLD马来酰亚胺，AlexaFluor FluoroNANOGOLD，AlexaFluorFluoroNANOGOLD链霉抗生物素蛋白，孔雀石绿，Dabcyl，Dabsyl，Cascade yellow，丹磺酰，Dapoxyl，PyMPO，芘，苯并二唑衍生物，(链霉抗生物素蛋白-/中性抗生物素蛋白-)生物素-标记的荧光微球，链霉抗生物素蛋白的CMNB-笼化的荧光素缀合物，calcofluor white，nile red，Y66F，Y66H，EBFP，GFP野生型，QFP突变体H9/P4/P9/P11/W，GFPuv，ECFP，Y66W，S65A，S65C，S65L，S65T，EGFP，EYFP，ECFP，DsRed1，DsRed2，NANOGOLD颗粒，链霉抗生物素蛋白-Nanogold，Monomaleido Nanogold，单-硫代-NHS-Nanogold，单氨基Nanogold，带正电荷/负电荷的Nanogold(NN，NHSN，NHSNA，NHSNS)，非-功能化的Nanogold，Monomaleido Nanogold，单-硫代-NHS-Nanogold，单氨基Nanogold，非-功能性Nanogold，Nanogold-缀合物，Nanogold-链霉抗生物素蛋白，脂质-Nanogold(棕榈酰Nanogold，DPPE Nanogold，棕榈酰Undeoagold，DPPEUndecagold)，Ni-NTA-Nanogold，Alexa Fluor488FluoroNanogold，Alexa Fluor594 FluoroNanogold，荧光素FluoroNanogold，HRP底物-Nanogold。

(vi)R⁷和R⁸还可以与插入其间的氮一起形成杂环，如取代过的或未取代过的四氢喹啉，四氢异喹啉，二氢吖啶，苯氮杂(benzazepine)，吡咯烷，吗啉，thiomortholine，哌嗪，哌啶，二氢吡啶，苯并咪唑，咪唑，咪唑啉，吡咯，吡咯烷，吡咯啉，吡唑，吡唑啉，吡唑烷，三唑，哌啶，吗啉，硫代吗啉，哌嗪，咔唑，吩噻嗪，吩嗪，二氢吩嗪，二氢噌啉，二氢喹喔啉，二氢萘啶，四氢萘啶，二氢吖啶，吲哚，异吲哚，二氢吲哚，吲哚啉，吲唑，嘌呤，9，10-二氢菲啶，5H-二苯并[b，f]氮杂，10，11-二氢-5H-二苯并[b，f]氮杂，β-咔啉，吡啶并[4，3-b]吲哚，2，3，9-三氮杂芴(2，3，9-triazofluorene)，9-硫杂-2，10-二氮杂蒽，噻吩并[3，2b]吡咯，二氢菲；

(vii)R是氢原子，C_1-20脂族基团，芳基，取代过的芳基(例如：4-硝基苯基或香豆素衍生物)，杂芳基(例如，2-吡啶)，取代过的杂芳基，环烷基，萘基，取代过的萘基，(CH₂)_n环烷基，(CH₂)_n苯基，(CH₂)_n取代过的苯基(例如：2，6-二卤苯基)，(CH₂)_n(1-或2-萘基)，(CH₂)_n杂芳基或(未)取代过的(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基，芴甲基；

(viii)Y是带负电荷的离去基团，包括卤素，如F、Cl、Br或I，芳基或烷基磺酰氧基，三氟甲烷磺酰氧基，OR，SR，COOR，OP(O)R₂，其中R是脂族基团，芳基，芳烷基，碳环基团，烷基碳环基团，或杂环基团；

(ix)Z是卤素(F、Cl、Br或I)，CN，OH，OR，NH₂，NHR，NR₂，SR，COR，CO₂R，CONR₂；

(x)n是0-20。

在本文中，将采用以下定义，除非另有说明。缩写Q和OPH分别表示喹啉基羰基和2，6-二氟苯氧基。在本文中，术语“脂族”表示直链或支链C_1-20烃，它是完全饱和的或它包含一个或多个不饱和单位。术语“烷基”单独使用或者作为较大部分的一部分使用，都表示包含一至二十个碳原子的直链或支链。术语“芳基”表示具有五至十四个原子的单环或多环芳族环基团，如苯基、萘基或蒽基。术语“杂环基团”表示饱和的或不饱和的多环或单环系统，其包含一个或多个杂原子，并且环的大小为三至九，例如呋喃基，噻吩基，吡咯基，吡咯啉基，吡咯烷基，二氧戊环基，唑基，噻唑基，咪唑基，咪唑啉基，咪唑烷基，吡唑基，吡唑啉基，吡唑烷基，异唑基，异噻唑基，二唑基，二烷基，吗啉基，二噻烷基，硫代吗啉基，哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，三嗪基，三噻烷基，吲嗪基，吲哚基，异吲哚基，吲哚啉基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，吲唑基，苯并咪唑基，苯噻唑基(benzthiazolyl)，嘌呤基，喹嗪基，喹啉基，异喹啉基，噌啉基，酞嗪基，喹唑啉基，喹喔啉基，1，8-萘啶基，蝶啶基，奎宁环基，咔唑基，吖啶基，吩嗪基，吩噻嗪基，或吩嗪基。“杂芳基”表示芳香族杂环。术语“碳环基团”表示不饱和的单环或多环碳环系统，其具有三至十四个碳，它可以与芳基或杂环基团稠合。脂族基团、烷基、芳基、杂芳基(例如：喹啉)、杂环基团或碳环基团单独使用或作为较大部分的一部分使用，表示取代过的或未取代过的基团。在表示取代过的基团时，这些基团可以包含一个或多个取代基。这些取代基可以是卤素(F，Cl，Br，I)，OH，U，CO(CH₂)_nNH(U)，CO(CH₂)_nS(U)，OR，SR，NH₂，NHR，NR₂，OCOR，OP(O)R₂，其中，R是脂族基团，芳基或取代过的基团，芳烷基，碳环基团，烷基碳环基团，杂环基团或放射性同位素(例如：I¹²⁵，H³，S³⁵，C¹⁴，P³³，P³²，Cr⁵¹，Ca⁴⁵，Fe⁵⁹，Ni⁶³，Ba¹³³，Cs¹³⁷，Eu¹⁵²，Ra²²⁶，Xe¹³³，锝⁹⁹，铊²⁰¹)。FITC表示异硫氰酸荧光素。

3.肽电子等排体或生物电子等排体

(a)本发明还涉及结构式IV.1-IV.7的carba类似物(表1)，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的。

表1.肽VDVAD的carba类似物(化合物IV.1-IV.7)

(b)本发明还涉及结构式V.1-V.7的酮亚甲基类似物(表2)，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的。

表2.五肽VDVAD的酮亚甲基类似物(化合物V.1-V.7)

(c)本发明还涉及通用结构式VI和VII的缩肽(depsi-peptides)类似物，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)X是O或NH，并且至少一个X是氧原子；

(iii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的；

(iv)R⁹是氢原子，(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基，C_1-20直链或支链烷基，(CH₂)_n环烷基，(CH₂)_n苯基，(CH₂)_n取代过的苯基，(CH₂)_n(1-或2-萘基)，(CH₂)_n杂芳基，OCOR或OCNHR。

(d)本发明还涉及结构式VIII.1-VIII.7的羟基亚乙基类似物(表3)，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的。

表3.VDVAD的羟基亚乙基类似物(化合物VIII.1-VIII.7)

(e)本发明还涉及结构式IX.1-IX.6的还原的五肽类似物(表4)，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的。

表4.VDVAD的还原的类似物(化合物IX.1-IX.6)

(f)本发明还涉及结构式X.1-X.7的不饱和的类似物(表5)，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的。

表5.VDVAD的不饱和的类似物(化合物X.1-X.7)

  No.  结构

(g)本发明还涉及结构式XI.1-XI.9的β-肽，γ-肽，脲，和氨基甲酸酯类似物(表6)，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)X是CH₂，NH，O；

(iii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的。

表6.不饱和的类似物XI.1-XI.9

4.VDVAD五肽的受约束的类似物

本发明还涉及表7-14所示的VDVAD五肽的受约束的类似物。在这些化合物中，芳基、杂芳基或杂环基团表示取代过的或未取代过的基团。在表示取代过的基团时，这些基团可以包含一个或多个取代基。这些取代基可以是卤素(F，Cl，Br，I)，OH，U，CO(CH₂)_nNH(U)，CO(CH₂)_nS(U)，OR，SR，NH₂，NHR，NR₂，OCOR，OP(O)R₂，其中，R和U是如上文所述的。

(a)本发明还涉及3-氨基吡啶-2(1H)-酮类，3-氨基吡嗪-2(1H)-酮类，5-氨基嘧啶-4(3H)-酮类，哒嗪-3(2H)-酮类，4-氨基哒嗪-3(2H)-酮类，5-氨基-1，2，4-三嗪-6(1H)-酮类，5-氨基-1，2，3-三嗪-4(3H)-酮类和6-氨基-1，2，3，4-四嗪-5(4H)-酮类，XII.1-XII.15(表7)，作为五肽VDVAD的受约束的类似物，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)W，X和Y是CH，C或N；

(iii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的。

表7.VDVAD的受约束的类似物(化合物XII.1-XII.15)

(b)本发明还涉及3-氨基哌啶-2-酮类，3-氨基哌嗪-2-酮类，5-氨基-四氢嘧啶-4(1H)-酮类，4-氨基哌嗪-3-酮类，6-氨基-1，2，4-三嗪-5-酮类，5-氨基-1，2，4-三嗪-6-酮类，5-氨基-1，2，3-三嗪-4-酮类和6-氨基-1，2，3，4-四嗪-5-酮类，XIII.1-XIII.15(表8)，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)W，X和Y是CH₂，NH，O或S；

(iii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的。

表8.VDVAD的受约束的类似物(化合物XIII.1-XIII.15)

  No.  结构

(c)本发明的化合物还包括3-氨基-3，4-二氢喹啉-2(1H)-酮类，XIV.1-XIV.15(表9)，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的。

表9.VDVAD的受约束的类似物(化合物XIV.1-XIV.15)

(d)本发明还涉及4-氨基-1，2-二氢异喹啉-3(4H)-酮类，XV.1-XV.15(表10)，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的。

表10.VDVAD的受约束的类似物(化合物XV.1-XV.15)

(e)本发明还涉及1，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酰胺类，XVI.1-XVI.15(表11)，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的。

表11.受约束的VDVAD类似物(化合物XVI.1-XVI.15)

(f)本发明还涉及4-氨基-1，2，4，5-四氢苯并[c]氮杂-3-酮类，XVII.1-XVII.15，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的。

表12.受约束的VDVAD类似物(化合物XVII.1-XVII.15)

(g)本发明涉及1，2，3，4-四氢化萘类，XVIII.1-XVIII.15，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的。

表13.受约束的氨基酸XVIII.1-XVIII.15

(h)本发明还涉及2，3-二氢-1H-茚类，XIX.1-XIX.15(表14)，其中

(i)每一个氨基酸或其电子等排体的绝对构型是L或D；

(ii)n，R，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，U，Y和Z是如上文所述的。

表14.受约束的VDVAD类似物(化合物XIX.1-XIX.15)

所述胱天蛋白酶-2-抑制剂有利地是通过实施例中所举例说明的合成途径获得的。具有在流程1-3中所给出的结构的衍生物可以由本领域技术人员通过使用化学合成的经典方法获得。

下面将结合图1-11提供本发明的其他特征和优点，这些附图分别为：

-图1：Qco-VDVAD-dpf的体外特异性和效力；

-图2：制剂的稳定性：HPLC测定。Qco-VDVAD-dfp；

-图3：由Qco-VDVAD-dfp选择性抑制胱天蛋白酶-2，可强有力地防止经历缺血性脑损伤的大鼠新生幼体的细胞死亡和脑梗死；

-图4：在新生儿缺血性脑损伤期间，Q-VDVAD-OPH对胱天蛋白酶-2活性和胱天蛋白酶-2加工的体内抑制作用；

-图5：在缺血性大鼠(4VO)模型的海马和皮层中的细胞死亡；

-图6：缺血对CA3、齿状回(dentus gyrus)(DG)和皮层(COR)的影响；

-图7：在缺血之后72小时对细胞死亡的定量；

-图8：Qco-VDVAD-dfp在非缺血性大鼠中无毒性；

-图9：在年幼成年大鼠的海马中缺血(4VO)之后72小时，Qco-VDVAD-dfp的神经保护作用；

-图10：在缺血之后72小时，Qco-VDVAD-dfp的定量的效用；和

-图11：生理学和行为测试。

5.Qco-VDVAD-dfp是选择性胱天蛋白酶-2抑制剂

5.1实验部分

5.1.1体外胱天蛋白酶活性分析。将人重组胱天蛋白酶1-10(25U；QuantiZyme^TM Assay System，BIOMOL，Plymouth，Pennsylvania，USA)在37℃下，与Qco-VDVAD-dfp一起在分析缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，100mM NaCl，0.1％CHAPS，10mM DTT，1mM EDTA，10％甘油)中预温育30分钟，并且与相应的产生荧光的胱天蛋白酶底物(500μM；BIOMOL)混合：Ac-YVAD-AMC(胱天蛋白酶-1)，Ac-VDVAD-AMC(胱天蛋白酶-2)，Ac-DEVD-AMC(胱天蛋白酶-3/7)，Ac-WEHD-AMC(胱天蛋白酶-4/5)，Ac-VEID-AMC(胱天蛋白酶-6)，Ac-IETD-AMC(胱天蛋白酶-8)，Ac-LEHD-AMC(胱天蛋白酶-9)，或Ac-IETD-AMC(胱天蛋白酶-10)。在荧光微量培养板读数器(TECAN，Genios；发射510nm，激发405nm)上评估底物的切割，并且根据剂量-反应S形曲线测定出IC₅₀值。每一种胱天蛋白酶的比活性用相应的特异性抑制剂(1-2μM，BIOMOL和MPBioMedicals)进行内部控制。其他体外分析是在CEREP进行的，或对于基于需钙蛋白酶和粒酶的测试用CEREP方案进行。

IC₅₀测定是通过在100μl分析缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，100mM NaCl，0.1％CHAPS，10mM DTT，1mM EDTA，10％甘油)中温育浓度逐渐提高的Qco-VDVAD-dfp与重组胱天蛋白酶-2而测定的。在37℃下温育30分钟之后，在荧光微量培养板读数器上测量重组胱天蛋白酶-2(125U)对50μM VDVAD-AMC的切割，通过在405nm的激发波长的情况下监测510nm处的荧光发射来进行。

5.1.2原代皮层神经元的分离、培养，和细胞凋亡的诱导

原代皮层神经元是从E14 SWISS小鼠胚胎(Janvier)培养的。通过颈脱位法处死小鼠，并且通过剖腹产取出胚胎。提取大脑皮质，并用1000μl尖头(Eppendorf)在L15培养基(Gibco BRL)中对组织进行机械研磨，然后除去碎片，并且以850rpm的速度将细胞悬浮液离心10分钟。神经元以在补充了1％谷氨酰胺、5％马血清(HS，Eurobio)和2.5％胎牛血清(FCS，Eurobio)的Eagle′s基础培养基(Eurobio)中的高密度(7×10⁵活细胞/cm²)置于6或24孔平板(Sarstedt)中2天，或置于4-孔-Lab-Tek分室的盖玻片(Nalge Nunc Internationnal)上2天，事先用1mg/ml聚氮丙啶(Sigma)进行包被。在DIV3，每天更换培养基，并且将神经元保持在含有180mg/l葡萄糖、5％HS和1％FCS、和3μM胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(Sigma)以及1μM 5-甲基-10，11-二氢-5H-二苯并环庚烯-5，10-亚胺马来酸盐(MK-801，Sigma)的N5完全培养基中。用抗-微管相关蛋白2的单克隆抗体(MAP-2，Sigma)和抗-胶质细胞原纤维酸性蛋白的多克隆抗体(GFAP，Dako)控制培养物的纯度(＞95％)。在24-孔平板上培养神经元直至6DIV，并且进行血清剥夺。简而言之，在N5完全培养基中培养的神经元用缺少血清的N5快速洗涤3次，并且在不含血清的N5培养基中，在没有或有Qco-VDVAD-dfp的条件下培养24小时。

5.1.3细胞凋亡分析。分析是使用配备有100W水银短弧光灯和X40N PLAN L物镜或水浸X 100N PLAN物镜的荧光显微术(FM)(DM IRB倒置荧光显微镜，Leica，Rueil-malmaison，France)对先前染色的贴壁神经元进行的。通常，定量研究是通过FM对于大约200-600个细胞/视野而进行的，每个实验中对5-10个随机选择的视野进行评分，并且将流式细胞术(FC)用于较大的样品通量。细胞凋亡的FC分析是在对染色的神经元进行胰蛋白酶消化之后进行的，通过使用装备有15mW空气冷却的488nm氩激光器的3-色FACSCalibur细胞计数器(BectonDickinson)。激活的胱天蛋白酶-2的检测使用特异的FAM-缀合的肽(称为FLICA：CaspaTag^TM荧光素胱天蛋白酶活性试剂盒，Q-Biogen，Illkirch，France；ApoFluor^TM胱天蛋白酶检测试剂盒，MPBioMedicals)：FAM-VDVAD-fmk。通过7-AAD(Sigma)整合来评估生存力丧失。

5.1.4制剂研究。将化合物Qco-VDVAD-dfp(SEQ1)溶于Tween 20或Pluronc F-68赋形剂中。在室温下在整整7天，或在冷冻/融化包含多种10-100％的赋形剂的水溶液之后，使用HPLC(Varian ProStar 410，装备有Nucleosile C₁₈(8μm，3.9×150mm)，在214nm处检测)追踪测定稳定性。

5.2结果

Qco-VDVAD-dfp是选择性胱天蛋白酶-2抑制剂(IC₅₀＝65-80nM)，对其他胱天蛋白酶或者至少32种其他相关的蛋白酶或参与信号转导和神经元代谢、一氧化氮途径或前列腺素代谢的酶没有交叉反应性(图1)。Qco-VDVAD-dfp是能渗透入细胞的，因为它在皮层神经元培养物中的血清剥夺期间能防止胱天蛋白酶-2活性。另外，在该实验性胱天蛋白酶-2依赖性细胞死亡范例中，Qco-VDVAD-dfp在24小时能防止神经元死亡(图1)。另外，Qco-VDVAD-dfp适合于施用给动物或人类，因为它在基于Tween 20或Pluronic-F68的混合物中具有高溶解度。在室温下放置7天或者在冷冻/融化之后没有发现Qco-VDVAD-dfp降解(图2)。

通过以下附图说明了上述数据：

图1.Qco-VDVAD-dpf的体外特异性和效力。(a)Qco-VDVAD-dfp对一组人重组胱天蛋白酶(1-10；50U)的体外特异性。用0.1μM的Qco-VDVAD-dfp进行体外切割试验(n＝3；柱状图表示胱天蛋白酶活性％±SD)。(b)针对重组人胱天蛋白酶-2：65-80nM(n＝3，不同的批次)，测定IC₅₀(能阻止50％的由人重组C2(125U)对于Ac-VDVAD-AMC的切割的浓度)的范围。(c)Qco-VDVAD-dfp对24h-血清剥夺(SD)的神经元的细胞保护作用。Qco-VDVAD-dfp能在24小时防止胱天蛋白酶-2活性和细胞死亡(n＝3)。(d)Qco-VDVAD-dfp(1μM)的抑制特性，是在32个其他与蛋白酶、信号转导和神经元代谢、一氧化氮途径或前列腺素代谢相关的体外药理学分析中测定的(n-2)。

图2.制剂的稳定性：HPLC测定。Qco-VDVAD-dfp(5×10^-3M，在含有20％的Tween 20的生理学缓冲液中)在室温下在7天之后都不会降解。

IV.在局部脑缺血之后，Qco-VDVAD-dfp在大鼠中的作用

介绍

中风是发达国家导致成年人死亡的第三种最常见的病因，并且是在儿童中造成死亡和慢性神经病态的重要原因。很多儿童中风发生在在围产期，即将出生之前或出生之后一个月内。母亲的缺血性中风风险在接近分娩时同样会增加，并且在即将生产前2天和生产后1天的发病率比在怀孕早期或在非怀孕状态下的发病率高34倍。在母亲和婴儿中对于缺血性中风以及对于在非脑部位形成血栓的易损性的提高，有可能与分娩激活了凝血机制相关，这可能是为了降低在这一关键时刻的出血风险而形成的进化适应机制。

围产期缺血性中风是在生产时刻左右的脑血管事件，具有局部动脉梗塞的病理学或放射学征象。大部分围产期中风出现在大脑中动脉(MCA)范围内。左半球损伤更为突出，其原因是血液动力学差异，所述血液动力学差异来自动脉导管未闭，或牵涉左颈总动脉的更直接的途径。脑梗死的分布随着妊娠年龄而略有不同，早产婴儿倾向于具有涉及MCA的皮层支或豆状核纹状体支的多灶性损伤，而足月婴儿倾向于具有主干的闭塞。

1.实验模型

1.1短暂单侧局部缺血模型

新生的Wistar大鼠(母畜+9只幼崽/胎)是从Janvier(LeGenest-St-Isle，France)获得的，此时所述幼崽为3-4天大。所述幼崽与它们的母畜一起圈养，采用12:12小时的光照-黑暗周期，可以自由地取食和饮水。动物实验是按照法国和欧共体有关实验动物管理和使用的指南进行的。缺血是按照以前所披露的方法(Renolleau等人，1998)用7天大的大鼠(17-21g)进行的。通过腹膜内注射水合氯醛(350mg/kg)对大鼠幼崽进行麻醉。将麻醉的大鼠后背向下放置，并且在颈部形成中央切口，以便暴露出左颈总动脉。然后将大鼠右侧向下放置，并且在耳朵和眼睛之间形成斜的皮肤切口。在切除颞肌之后，将颅骨从额缝中取出，达到低于颧弓的水平。然后，就在其出现在嗅裂上之后暴露出来的左侧大脑中动脉凝结(coagulate)在低于大脑静脉的水平上。在该过程之后，放置夹子以封闭左颈总动脉。然后将大鼠放置在保温箱中，以避免体温过低。50分钟之后，去掉夹子。借助于显微镜证实颈动脉血流恢复。然后缝合颈部和颅部皮肤切口。在手术过程中，将体温保持在37-38℃。将幼崽转移到保温箱(32℃)中，直到恢复，然后送回到它们的母畜那里。

在缺血发作之前5-15分钟或缺血之后1小时，通过腹膜内施用Qco-VDVAD-dfp，施用剂量为0.001-10mg/kg。对照动物接受等体积的含有10％DMSO的0.9％盐水(n＝15)，要求该媒介物(vehicle)可溶解胱天蛋白酶抑制剂(媒介物-处理组)。在缺血期间或杀死之前的大鼠死亡率在Qco-VDVAD-dfp和媒介物-处理组之间没有差别(＜4％)。在再灌注之后48小时杀死大鼠，并且取出脑。由不了解动物处理的观察者用肉眼对梗塞损伤(苍白区)进行评分。在放大镜下观察没有明显的缺血性苍白区的脑。放弃那些没有表现出明显MCA闭塞的脑。

选择从前纹状体到后海马的十六个切片(相应于Paxinos′大鼠脑图册的图版9-27)，以0.5-mm的相等的间隔获得。使用图像分析仪(NIH图像软件)在甲酚紫-染色的切片上测量损伤面积，并且将各个冠状切片(coronal section)之间的距离用于计算梗塞体积。对脑切片进行处理，以便进行DNA链分解(TUNEL测定)，使用原位荧光素细胞死亡检测试剂盒(Roche，Meylan，France)并按照生产商的说明进行。

对于Tunnel分析来说，然后将脑在4％缓冲的甲醛中固定2天。在恒冷切片机上切出五十微米的冠状脑切片，并且收集在明胶包被的载玻片上。

按以下方法进行统计学分析。假设β风险为0.2，α风险为0.05，那么估计在每一组中需要15-16只动物以检测两组之间50％的梗塞体积减少。因为在该实验中比较了三组动物，所以这些值只是参考性质的。将具有六只动物一组的预定列表用于对这三组中的动物进行随机化。让不了解处理条件的研究人员进行所有测量。评估平均值之间的差异，方法是进行Kruskall-Wallis的非参数多重比较检验，然后对非参数值进行Newman-Keul′s检验。我们认为差异的显著水平为5％(P＜0.05)。

1.2通过Western印迹分析来检测脑裂解液中的体外VDVAD-AMC切割和胱天蛋白酶-2切割

蛋白质提取和Western印迹分析

大脑半球在补充了完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Meylan，France)的10mM Hepes，5mM MgCl₂，42mM KCl，1mM DTT，0.5％CHAPS中通过在冰上进行手工磨浆(potter)而裂解。匀浆物以10000g的速度在4℃下离心10分钟，然后保持漂浮。通过BCA测试确定蛋白质浓度。在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质(50μg)，并转移到PVDF膜(Amersham)上。使用ECL(Amersham Pharmacia Biotech)显示免疫染色。以1∶1000的稀释度使用抗小鼠胱天蛋白酶-2的单克隆抗体(52kDa；11B4，Alexis Biochemicals)；将肌动蛋白(42kDa；Sigma；抗体以1∶5000的比例稀释)用作相等的加样对照。

在100μl分析缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，100mM NaCl，0.1％CHAPS，10mM DTT，1mM EDTA，10％甘油)中评估胱天蛋白酶-2活性(100μg蛋白大脑样品)。重组胱天蛋白酶-2对50μM VDVAD-AMC的切割是在37℃下温育2小时之后在荧光微量培养板读数器上测量的，通过在405nm的激发波长的情况下监测510nm处的荧光发射来进行。为了抑制VDVADase活性，在存在胱天蛋白酶-2的条件下，将抑制剂(2μM)在37℃下进行预温育30分钟，然后再进行与50μM VDVAD-AMC的温育(30分钟，37℃)。在单独使用VDVAD-AMC时没有观察到明显的荧光背景。

2.结果

在该短暂单侧局部缺血模型中，大鼠幼崽经历永久性左侧大脑中动脉闭塞，其与具有再灌注的左颈总动脉的短暂闭塞相关。然后在48小时之后分析大脑，在该时间点上梗塞是稳定化的，没有明显的水肿(不超过1.5％)。缺血诱导出了55.0±3.4mm³的梗塞体积，表示在受损伤的同侧半球中的22.1±1.4％的损害。梗塞体积看上去是正态分布的(15％-26％)(图3)。在缺血发作之前，给大鼠幼崽施用单一剂量的Qco-VDVAD-dfp(5mg/kg；i.p.)。该单一剂量诱导了梗塞体积的非常显著的74％的减少(5.7±2.3％，p＜0.01，(中间值＝0.5)，与对照组(V＝22.1±1.4％，中间值＝21)相比，在Newman-Keul′s检验中)(图3)。有趣的是，在12只研究过的动物中，4只经Qco-VDVAD-dfp处理的动物表现出中等保护作用(V＝16.5±1.32％)，和8只动物表现出完全保护作用或非常明显更小的梗塞(中间值＝0.5％)，只能在大脑中动脉的水平(相应于图版12和13的水平)上可以看到，而在背侧和海马的水平(图版21)上看不到，相对于缺血性对照动物(图3)。

在MCAO之后1小时(相当于再灌注开始)给大鼠幼崽施用单一剂量的Qco-VDVAD-dfp(0.1mg/kg；i.p.)。该单一剂量诱导了梗塞体积的非常显著的44％的减少(9.95±2.8％，p＜0.01，与对照组(V＝22.64±1.6％)相比，在Newman-Keul′s检验中)(图3)。

另外，在经Qco-VDVAD-dfp处理的动物中，末端转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)显著减弱(图3)。

由Qco-VDVAD-dfp提供的保护作用不是由体温调控介导的(图3)。

最后，Qco-VDVAD-dfp在体内能很好地靶定胱天蛋白酶-2：它能在缺血性大鼠幼崽大脑中有效地抑制胱天蛋白酶-2活性以及胱天蛋白酶-2加工(图4)。

我们证实，胱天蛋白酶-2是与新生儿中风中的良好神经保护预后相关的靶标，因为胱天蛋白酶-2的体内失活导致了在短暂局部缺血期间脑梗塞体积的大量减少。我们认为，胱天蛋白酶-2可能是体内预防在分娩和围产期中风时的缺氧-缺血性脑病的正确靶标，所述预防是人类新生儿的主要卫生保健。

通过以下附图说明了以上数据：

图3：由Qco-VDVAD-dfp选择性抑制胱天蛋白酶-2，可强有力地防止经历缺血性脑损伤的大鼠新生幼体的细胞死亡和脑梗死。(a，左图)在经媒介物处理的大鼠(n＝17)和经Qco-VDVAD-dfp处理的大鼠(i.p.，5mg/kg；n＝12)中，在缺血之后48小时的平均梗塞体积(平均值±SEM)。当在缺血发作之前5-15分钟施用时，Qco-VDVAD-dfp诱导了74％的减少(***＝p＜0.001，Kruskall-Wallis检验)；(a，右图)Qco-VDVAD-dfp处理提供了2个组，其表现出高的/总的(高度)或低的保护作用(4)。对单个的梗塞体积数据进行作图。粗的和细的水平线条分别表示组中间值和平均值。(b)代表性的甲酚紫-染色的冠状切片来自再灌注之后48小时的动物，位于背侧海马(图版21，Paxinos′大鼠脑图册)和前连合(图版12)的水平上。点划线标明梗塞区域。箭头标明在经Qco-VDVAD-dfp处理的动物中没有梗塞。线条表示130μm。(c，左图)在经媒介物处理的大鼠(n＝22)和经Qco-VDVAD-dfp处理的大鼠(i.p.，0.1mg/kg；n＝19)中，在缺血之后48小时的平均梗塞体积(平均值±SEM)。当在缺血发作之后1小时施用时，Qco-VDVAD-dfp诱导了44％的减少(***＝p＜0.001，Kruskall-Wallis检验)。(c，右图)对单个的梗塞体积数据进行作图。粗的和细的水平线条分别表示组中间值和平均值。(d)在经媒介物和经Qco-VDVAD-dfp处理过的动物的同侧皮层中的细胞死亡。在原位3′OH末端DNA标记之后的代表性的荧光显微照片(来自图版12)(线条：100μm)。(e)在施用Qco-VDVAD-dfp之前和之后测量体温(缺血之前和之后)。

图4：用5mg/kg(i.p.)的Qco-VDVAD-dfp处理缺血性大鼠幼崽。24小时之后处死动物。将脑匀浆物进行胱天蛋白酶-2活性测定和Western印迹分析。IL：同侧的受损伤的半球，CL：对侧的未受损伤的半球。(a)在经媒介物处理的大鼠中对在经Qco-VDVAD-dfp处理的大鼠中测定的胱天蛋白酶-2活性。(b)胱天蛋白酶-2加工的Western印迹分析，在来自经媒介物处理的大鼠对来自经Qco-VDVAD-dfp处理的大鼠的脑匀浆物中。

V.在全脑缺血之后，Qco-VDVAD-dfp在大鼠中的作用

全脑缺血是在心搏停止或心血管障碍之后可以引起的病状，并且它会导致血流量减少和缺氧。损伤出现在选择性地易受损的大脑区域，并且神经元可能由于在这样的全脑缺血期间的细胞凋亡而受到损害。全面缺血还导致了能量代谢物的广泛和全面的丧失，以及扩散的脑水肿和全面损伤。与损伤生长相关的机制可能尤其包括半胱氨酸-蛋白酶(胱天蛋白酶)激活，兴奋性中毒，梗塞周围去极化，乳酸中毒(lactacidosis)，微循环紊乱，和流动-代谢解偶联等。如果在全面缺血期间某些(执行者)胱天蛋白酶可能被激活，人们无法评论胱天蛋白酶-2在这样的病理学状态中的作用。最近，我们已经开发出了新的选择性胱天蛋白酶-2抑制剂(2-喹啉基羰基-L-缬氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)-L-缬氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰(甲酯)2，6-二氟苯酯，称为Qco-VDVAD-dfp，它在新生儿脑缺血期间提供了强效的体内神经保护作用。在本文中，我们研究了它的针对在心搏停止之后出现的脑损伤的细胞保护介导的作用，以及行为相关的优点。因此，我们用年幼成年大鼠在全面和短暂脑缺血(4VO，4血管闭塞)的体内实验模型中测试了Qco-VDVAD-dfp的作用，基于Pulsinelli的方法(1979)。

1.实验模型

1.1VO模型

全脑缺血是通过4-血管闭塞(four-vessel occlusion)(4VO)诱导的，按照Pulsinelli的衍生方法(Pulsinelli等人，1982；Pulsinelli和Buchman，1988)在年幼成年大鼠(雄性Wistar，10-12周龄，320g+/-10g；Janvier)中进行。第一天，将麻醉的大鼠的头放入立体定位的耳棒中，并且向下倾斜与水平方向形成30°角。在颈椎水平上形成中线切口之后，在显微镜下暴露两个脊椎动脉，然后通过电烙针进行凝结，其穿过在第一颈椎骨水平上的翼孔(alarforamina)。24小时后暴露两个颈总动脉，并夹住20-30分钟(在很好地对两个脊椎动脉进行电烙之后，大鼠陷入昏迷)。然后除去夹住颈动脉的夹子，以便使血流再灌注。在缺血(颈动脉闭塞)的第一个五分钟内在左侧脑室的水平上施用媒介物和Qco-VDVAD-dfp(II，n＝0)。然后将大鼠放置在它们的笼子中，可以随意饮水和进食。

1.2细胞保护作用的评估

在72小时评价了易受损伤的细胞的选择性损失和Qco-VDVAD-dfp的作用(脑室内(ICV)施用)。处死大鼠，并且用低聚甲醛通过经心灌注来固定脑。用甲酚紫对大脑前部(frontal brain)切片(25μm)进行染色，或用Hoechst 33342和Fluorojade B进行共同染色，以便评估海马和皮层中的细胞死亡。甲酚紫是粉红色染料，它能标记活细胞中的细胞质体(cytoplamic body)Nissl(内质网结构)和细胞核，因此在死亡的细胞中产生苍白色的染色或没有染色。Fluoro Jade B(绿色荧光)摄取只有在具有可渗透的质膜的细胞中是可能的，因此死亡细胞才更具有这样的特征。Hoechst 33342(蓝色荧光)能标记所有细胞的细胞核，并且使得能够在细胞死亡期间的细胞核形态学变化。

在套管的水平上以及在左侧大脑半球中的套管(前后轴)之后650μm和780μm的水平上计数细胞。在三个连续切片上计数细胞，在海马(CA1，CA3，齿状回)和皮层这样的水平上进行。在白光下观察甲酚紫染色的切片(Nikon Eclipse E 800M显微镜，装备有x40和x20物镜和LEICA IM50软件)。Fluoro Jade B和Hoechst染色的切片在LeicaDMIRB倒置荧光显微镜下观察，该显微镜上装备有x40物镜和LEICAIM1000/Qfluorobase软件(BP 340-80激发过滤器与LP 425发射过滤器组合用于Hoechst；BP 480/40激发过滤器与BP 515-560发射过滤器组合用于Fluoro Jade B)。

1.3行为增益(gain)的评估

在第1天于手术过程中测量体温(从麻醉到手术过程的步骤1(脊椎电烙术和套管拿起(putting up))和步骤2(颈动脉的分离))。还在第2天于缺血开始之后0、10、20分钟测量体温。在缺血之后24、48、72小时以及在第5天为了进行灌注的最终麻醉之前测量体温。进行行为研究(进食、自主活动性和反应性)，并且通过评分进行评估。进食：在第5天观察胃内容物。

如果重新进食＝1；如果不重新进食＝0。

自主活动性：动物在它们的笼子中的一般行为(活动对不活动阶段的改变以及对于捕捉的反应)。

活泼＝1；更活泼或更不活泼＝0.5；不活泼或活泼性差＝0。

反应性：动物对噪音敏感并且有反应，和向噪音的来源移动。

如果好奇＝1；如果相对好奇＝0.5；如果不很好奇＝0。

2.结果

图5-7表示，细胞死亡出现在缺血之后72小时的成年大鼠的海马的CA1水平上(以及少数出现在皮层中)：90-100％的细胞已经丧失了它们的甲酚紫标记，并且具有异常的细胞形态学，40-60％表现出细胞核改变，40-50％在缺血性大脑的CA1(CA1a、b和c亚区)中保留了FluoroJade B。在CA3、DG(齿状回)中(还在CA2和CA4中，数据未示出)没有发现细胞死亡的迹象。缺血还受小胶质细胞的存在的控制，所述小胶质细胞呈现出棒状(驻留的小胶质细胞)或镰刀状(迁移的小胶质细胞，在血脑屏障破裂之后侵入大脑)。

图8表示，在用60-600ng的Qco-VDVAD-dfp处理的非缺血性大鼠(icv)中没有细胞死亡(低于基础阈值：10％)，无论在海马或皮层中的观察水平如何：没有甲酚紫阴性细胞，没有异常的细胞核，无Fluoro Jade B整合。因此，在60-600ng的剂量下，Qco-VDVAD-dfp没有局部毒性。

图9-10表示Qco-VDVAD-dfp在缺血性大脑中的CA1水平上的细胞保护作用。与缺血性大鼠形成鲜明对比的是，经Qco-VDVAD-dfp处理过的动物具有较少的异常细胞核(细胞核更大并且较少收缩)，和具有少数整合了Fluorojade B的细胞(占10-20％，而不是50-60％)。因此，彩色切片看上去更像是非缺血性切片。另外，甲酚紫染色强度部分恢复到非缺血性动物的水平，但是没有细胞形态学的总体恢复。

Qco-VDVAD-dfp的作用不取决于温度的调控作用(图11)。

Qco-VDVAD-dfp对缺血性处理的大鼠的一般行为具有有益的作用，因为这些大鼠比未处理过的大鼠具有更好的得分：它们更活泼，对噪音更具有反应性，并且它们能够自我进食(图11)。

通过以下附图说明了以上数据：

图5：在缺血性大鼠(4VO)模型的海马和皮层中的细胞死亡。A：在缺血之后72小时的成年大鼠的海马(CA1，CA3，DG)和皮层中的细胞死亡。通过4血管闭塞(4VO；n＝5)诱导全面和短暂脑缺血。用DMSO(在这里，7.255％；0.7255％，未示出)处理大鼠(icv)。用甲酚紫对切片进行染色。B：缺血之后72小时的成年大鼠的海马(CA1)中的细胞死亡。通过4血管闭塞(4VO；n＝5)诱导全面和短暂脑缺血。用DMSO(7.255％)处理大鼠(icv)。用Hoechst 33432(蓝色细胞核)和Fluoro Jade B(绿色细胞核和细胞质)对细胞进行染色。C：高放大倍数的Hoechst和Fluoro Jade B荧光显微照片(尺寸分别增加了2和6倍)。D：作为缺血的标记的小胶质细胞激活。小胶质细胞具有棒状(驻留的小胶质细胞)或镰刀状(迁移的小胶质细胞，在血脑屏障破裂之后侵入大脑)。

图6：缺血对CA3、齿状回(DG)和皮层(COR)的影响。在成年大鼠中缺血之后72小时在海马(CA3，DG)和皮层(COR)中的细胞死亡。通过4血管闭塞(4VO；n＝5)诱导全面和短暂脑缺血。用DMSO(在这里，7.255％；0.7255％，未示出)处理大鼠(icv)。用Fluoro JadeB/Hoechst在CA1水平上对切片进行共同染色(n＝5)。

图7：在缺血之后72小时对细胞死亡进行定量。在成年大鼠中缺血之后72小时在海马(CA1，CA3，DG)和皮层(COR)中的细胞死亡。通过4血管闭塞(4VO；n＝5)诱导全面和短暂脑缺血。用DMSO(在这里，7.255％；0.7255％，未示出)处理大鼠(icv)(n＝5)。A：在DMSO或TRP6注射点(1)、注射点之后650μm(2)或注射点之后780μm(3)的水平上对甲酚紫阳性细胞进行定量。B：异常细胞核的定量，通过在缺血性和非缺血性大脑的海马(CA1_a，b，c，CA3，DG)和皮层(COR)中的Hoechst染色进行评估。C：在缺血性和非缺血性大脑的海马(CA1_a，b，c，CA3，DG)和皮层(COR)中对Fluoro Jade B阳性细胞进行定量。

图8：Qco-VDVAD-dfp在非缺血性大鼠中的无毒性。在icv施用DMSO(在这里，7.255％；0.7255％，未示出)或Qco-VDVAD-dfp(60或600ng)(n＝5)之后72小时，在非缺血性大鼠的海马(CA1，CA3，DG)和皮层(COR)中的细胞死亡。A：在存在剂量逐渐加大的TRP6的条件下，在DMSO或Qco-VDVAD-dfp注射点(1)、注射点之后650μm(2)或注射点之后780μm(3)的水平上对甲酚紫阳性细胞进行定量。B：异常细胞核的定量，通过在经媒介物处理的或经Qco-VDVAD-dfp处理的大鼠的海马(CA1_a，b，c，CA3，DG)和皮层(COR)中的Hoechst染色进行评估。C：在缺血性和非缺血性大脑的海马(CA1_a，b，c，CA3，DG)和皮层(COR)中对Fluoro Jade B阳性细胞进行定量。

图9：在缺血(4VO)之后72小时，在年幼成年大鼠的海马中Qco-VDVAD-dfp的神经保护作用。A：显微照片(x400)，表示CA1以及它的亚区(CA1a，CA1b，CA1c)，使用的是经媒介物处理的(DMSO0.7255％)或经Qco-VDVAD-dfp处理的(60ng)缺血性大鼠对非缺血性动物(经媒介物处理的)。用甲酚紫(上部的线)、Hoechst(左侧栏中的蓝色细胞核)或Fluoro Jade B(右侧栏中的绿色荧光)对切片进行染色)。B：高放大倍数(6倍)的Hoechst和Fluoro Jade B荧光显微照片。

图10：在缺血之后72小时，Qco-VDVAD-dfp的定量的效用。在缺血之后72小时，在成年大鼠的海马(CA1，CA3，DG)和皮层(COR)中的细胞死亡。通过4血管闭塞(4VO；n＝5)诱导全面和短暂脑缺血。用DMSO(在这里，7.255％；0.7255％，未示出)或Qco-VDVAD-dfp(60或600ng)(n＝5)处理大鼠(icv)。A：在存在剂量逐渐加大的TRP6的条件下，在DMSO或Qco-VDVAD-dfp注射点(1)、注射点之后650μm(2)或注射点之后780μm(3)的水平上对甲酚紫阳性细胞进行定量。B：异常细胞核的定量，通过在经媒介物处理的或经Qco-VDVAD-dfp处理的大鼠的海马(CA1_a，b，c，CA3，DG)和皮层(COR)中的Hoechst染色进行评估。C：在缺血性和非缺血性大脑的海马(CA1_a，b，c，CA3，DG)和皮层(COR)中对Fluoro Jade B阳性细胞进行定量。

图11：生理学和行为测试。A：生理学研究。在第1天，从麻醉到手术过程的步骤1(脊椎电烙术和套管拿起)和步骤2(颈动脉的分离)测量体温；在第2天于缺血开始之后0、10、20分钟测量体温；在缺血之后24、48、72小时以及在第5天为了进行灌注的最终麻醉之前测量体温。B：行为研究：每组的参数平均值。进食：在第5天观察胃内容物，如果重新进食＝1，如果不重新进食＝0；自主活动性：动物在它们的笼子中的一般行为(活动对不活动阶段的改变以及对于捕捉的反应)，活泼＝1，更活泼或更不活泼＝0.5，不活泼或活泼性差＝0；反应性：动物对噪音敏感并且有反应，和向噪音的来源移动，如果好奇＝1；如果相对好奇＝0.5；如果不很好奇＝0。C：行为研究：总体评分(每组总得分之和)。

实施例：获得结构II的胱天蛋白酶-2抑制剂

用于合成的主要步骤概括在流程1-3中。

(a)THF，NMM，-15℃.(b)EtOCOCl.(b)CH₂N₂.(c)Et₂O/THF，HBr/ArOH.(d)DMF，KF，2，6-二氟苯酚.(e)TFA，DCM.

                                  流程1

(a)DCC，HOBt，DIEA，DCM.(b)TFA/DCM(1∶1)，raflmc，3h.

                                  流程2

(a)DCM，DIEA，Boc-Val-OH，DCC，HOBt.(b)DCM/TFA(1∶1).1h.(c)DCM，DIEA，Boc-Asp(OMe)-OH，BOP，HOBt.(d)DCM，DIEA，Qco-Val-OH，BOP，HOBt.

(e)MeOH，cat.H₂，Pd/C，rt，1-2天.(t)DCM，DIEA，TFA.H-Asp(OMe)-CH₂-O-(2，6-二氟苯基)，BOP，HOBt.

                                  流程3

参考文献

Pulsinelli WA，Waldman S，Rawlinson D，Plum F，Moderatehyperglycemia augments ischemic brain damage：aneuropathologic study in the rat.Neurology.1982，32，：1239-1246.

Pulsinelli W.A.，Buchman A.M.(1988).The Four-vesselOcclusion Rat Model：Method for Complete Occlusion of vertebralarteries and control of collateral circulation.Stroke.19，913-914.

Renolleau，S.，D.Aggoun-Zouaoui，Y.Ben-Ari，and C.Charriaut-Marlangue.1998.A model of transient unilateralfocal ischemia with reperfusion in the P7 neonatal rat：morphological changes indicative of apoptosis.Stroke 29：1454-1461.