具有增加的琥珀酸产量的突变大肠杆菌菌株

摘要

本发明涉及细菌的突变株，该突变株缺少或包含对应几个关键代谢酶的突变基因，并且，该突变株在无氧条件下产出高产量的琥珀酸。

说明书

发明领域

本发明涉及在代谢工程微生物中生产琥珀酸、苹果酸、延胡索酸和其他羧基酸类的方法。

发明背景

昂贵的特种化合品琥珀酸盐及其衍生物具有广泛的工业应用。琥珀酸作为原材料被用于食品、药物、塑料制品、化妆品和纺织品，并且被用于电镀和废气净化(waste-gasscrubbing)(61)。琥珀酸可以作为一些塑料前体的原料，如1，4-丁二醇(BDO)，四氢呋喃和γ-丁内酯。而且，琥珀酸和BDO可以用作聚酯的单体。如果琥珀酸盐的成本可以被降低，它将作为用于生产其他散装化学品的中间原料而变得非常有用(47)。除了琥珀酸以外，其他4-碳二羧酸，如苹果酸和延胡索酸也具有原料潜力。

从葡萄糖、木糖、山梨糖醇和其他“绿色”可更新原料(在本案中通过发酵过程)生产琥珀酸盐、苹果酸盐和延胡索酸盐是替代从不可更新资源中提取这些酸类的较高能耗方法的一条途径。琥珀酸盐是产丙酸细菌厌氧发酵的中间体，但那些过程产生低产量和浓度。很早就已知道大肠杆菌发酵能产生酸类的混合物。可是，对于每摩尔被发酵的葡萄糖而言，只产生1.2摩尔甲酸，0.1-0.2摩尔乳酸和0.3-0.4摩尔琥珀酸。因此，以发酵方法生产羧酸的努力导致相对大量的生长底物，如葡萄糖，不能被转变成所需的产物。

人们做了许多尝试对大肠杆菌无氧中心代谢途径进行代谢工程设计，以提高琥珀酸的产量和产率(7，8，12，14，15，20，24，32，44，48)。基因工程与生产条件优化的结合也显示提高了琥珀酸的产量。一个实例是一种利用双期(dual phase)发酵生产模式生产琥珀酸的突变大肠杆菌菌株的生长，该模式包括初始的有氧生长期，随后的无氧生产期或/和利用二氧化碳、氢或两种气体的混合物来改变无氧发酵的顶部空间条件(35，49)。

特别地，通过扩增、添加或减少某一特定途径来操纵酶的水平，可以导致所需产物的高产量。已经描述了用于在无氧条件下生产琥珀酸的各种基因改进，这些改进利用了大肠杆菌混合酸发酵途径。一个实例是从大肠杆菌过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepc)(34)。在另一实例中，通过过表达大肠杆菌中天然的延胡索酸还原酶(frd)延胡索酸到琥珀酸的转化被提高(17，53)。某些酶不是大肠杆菌固有的，但能潜在地促进琥珀酸的生产量。通过将埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)中的丙酮酸羧化酶(pyc)转入到大肠杆菌中，琥珀酸的生产量得到提高(14，15，16)。其他代谢工程策略包括使琥珀酸的竞争性途径失活。当苹果酸酶在具有失活的丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)和乳酸脱氢酶(ldh)基因的宿主中过表达时，琥珀酸成为主要的发酵产物(44，20)。在同一突变株(pfl-和ldh-)内的失活的葡萄糖磷酸转移酶体系(ptsG)也显示在大肠杆菌内产出更高的琥珀酸产出量并促进生长(8)。

假设所有的碳通量都经过天然的琥珀酸发酵途径(图1)，无氧条件下来自葡萄糖的琥珀酸的最大理论产量(基于摩尔)限制在1mol/mol。发酵途径将草酰乙酸(OAA)转化为苹果酸、延胡索酸，其次是琥珀酸，该途径每产生1摩尔琥珀酸，需要2摩尔NADH。从发酵途径产出高产量琥珀酸的最大障碍是由于NADH的限制。这是因为1摩尔葡萄糖经糖酵解途径仅能提供2摩尔NADH；而，经由天然的发酵途径形成1摩尔琥珀酸需要2摩尔NADH。无氧生产琥珀酸还受到缓慢的细胞生长和产出量的限制的牵制。

通过操纵代谢途径，代谢工程具有显著提高过程产出量的潜力。特别地，通过特定途径的扩增、添加或减少来调控酶的水平，能够导致所需产物的高产量。本领域所需要的是改进的细菌菌株，和迄今所提供的菌株相比，所述改进的菌株能产出更高水平的琥珀酸和其他羧酸。

发明概述

本发明描述了具有多于两个途径的蛋白质失活以提高在无氧条件下羧酸产出量的细菌，其中，所产生的羧酸是琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、草酰乙酸或乙醛酸。在本发明的一个实施方案中，蛋白ADHE、LDHA、ACKA、PTA、ICLR和ARCA是失活的。在本发明的另一个实施方案中，蛋白的不同组合被失活，包括ADHE、LDHA、ACKA、PTA、ICLR和ARCA。这些蛋白的失活还可以与ACEA、ACEB、ACEK、PEPC、PYC或CITZ的过表达相结合，以进一步增加琥珀酸的产量。

在本发明的一个实施方案中，建立了破坏菌株(disruption strain)，其中adhE、ldhA、iclR、arcA和ack-pta基因均被破坏。在本发明的另一个实施方案中，adhE、ldhA、iclR、arcA和ack-pta基因的不同组合被破坏。突变菌株被命名为SBS330MG、SBS440MG、SBS550MG、SBS660MG和SBS990MG，提供了本发明中的一些实施方案。

此外，还描述了用突变细菌菌株生产羧酸的无氧方法，其中，所述方法包括将上述突变细菌菌株接种培养物，在无氧条件下培养所述菌株，以及从培养基分离羧酸。可以用锥形瓶、生物反应器、补料分批(fed batch)生物反应器或恒化式(chemostat)生物反应器培养细菌菌株来获得羧酸。通过在无氧条件下生产琥珀酸之前在有氧条件下培养细胞能进一步增加羧酸的产量。

此外，还显示了改变细菌中糖酵解通量来分配经由OAA-柠檬酸和OAA-苹果酸途径的羧酸。糖酵解通量的比率可以是10-40％的柠檬酸和90-60％苹果酸，更优选约30％柠檬酸和约70％苹果酸。上述细菌菌株以此种方式分配糖酵解通量。

附图简要说明

并入本说明书并构成本说明书一部分的附图举例说明了本发明，并和所说明的内容一起用来解释了本发明的原理。

图1.基因工程无氧代谢途径。NADH竞争途径：乳酸(LDH)、乙醇(ADH)，以及乙酸途径(ACK-PTA)。乙醛酸旁路开放(ICLR敲除)并且来源于乳酸乳球菌(L.lactis)的异源丙酮酸羧化酶(PYC)过表达。此处所描述的基因工程菌株表示为SBS550MG。

图2.葡萄糖消耗和产物浓度。

图3.产物产量。

图4.累计琥珀酸产量。

图5.用菌株SBS550MG(pHL413)补料分批生产。实心标记对应于第一期测得的代谢物，空心标记对应于复制期测得的代谢物。当指针指示葡萄糖降到20mM时，葡萄糖以脉冲式加入。

发明的详细描述

所述的羧酸可以是盐、酸、碱或衍生物，取决于结构、pH和存在的离子。例如，词语“琥珀酸(succinate)”和“琥珀酸(succinic acid)”在这里可交替使用。琥珀酸也叫丁二酸(C₄H₆O₄)。这里所使用的化学品包括甲酸、乙醛、乳酸、苹果酸、草酰乙酸(OAA)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和丙酮酸。包括Krebs循环(也叫柠檬酸、三羧酸或TCA循环)的细菌代谢途径能够在Lehninger的“生物化学原理(Principles of Biochemistry)”及其他生物化学教科书中找到。

术语“控制性联系(operably associated)”或“控制性相关(operably linked)”指功能上配对的核苷酸序列。

在此所定义的“降低的活性”或“失活”指与适当的对照组菌株相比，蛋白质的活性至少降低75％。优选地，达到活性降低至少80、85、90、95％，在最优选的实施方案中，活性被消除(100％)。可以通过抑制剂、突变、抑制表达或翻译等方法使蛋白失活。

在此所定义的“过表达”或“过表达的”是指与适当的对照组菌株相比，至少150％的蛋白质活性。可以通过突变所述的蛋白生成更具活性的形式，或通过清除抑制剂、加入激活剂等方式使蛋白能抵抗抑制的形式。还可以通过清除阻抑物、向细胞中加入基因的多个拷贝或正向调节内源基因等等也能够实现过表达。

所使用的术语“破坏(disruption)”和“破坏菌株”是指细胞株中天然的基因或启动子被突变、删除、阻断或负向调节，以这样的方式来降低基因的活性。通过基因敲除或除去整个基因组DNA序列，能使基因完全(100％)被破坏(reduced)。利用移码突变、终止密码提前、重要残基点突变、缺失或插入等方式，通过完全阻止活性蛋白的转录和/或翻译，能够使基因产物完全失活(100％)。

在此所用的“重组体”是指来源于或包含基因工程物质。

基因缩写如下：异柠檬酸裂解酶(aceA a.k.a.icl)；苹果酸合酶(aceB)；thy乙醛酸支路操纵子(aceBAK)；异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸化酶(aceK)；乙酸激酶-磷酸转乙酰基酶(ackA-pta)；醇脱氢酶(adhE)；对有氧呼吸调控的调节子A和B(arcAB)；过氧化物敏感性(arg-lac)；醇乙酰基转移酶1和2(atf1和atf2)；推定的尸胺/赖氨酸反向转运体(cadR)；柠檬酸合酶(citZ)；脂肪酸降解调节子(fadR)；延胡索酸还原酶(frd)；果糖调节子(fruR)；延胡索酸酶A，B，或C(fumABC)；异柠檬酸脱氢酶(icd)；异柠檬酸裂合酶(icl)；aceBAK操纵子阻抑物(iclR)；乳酸脱氢酶(ldhA)；苹果酸脱氢酶(mdh)；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepC)；丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)；丙酮酸氧化酶(poxB)；磷酸转移酶系统基因F和G(ptsF和ptsG)；丙酮酸羧化酶(pyc)；鸟苷3’，5’-二焦磷酸合成酶I(relA1)；核糖体蛋白S12(rpsL)；以及琥珀酸脱氢酶(sdh)。Δlac(arg-lac)205(U169)是染色体arg-lac区缺失，该区携带一个或几个使细胞对H₂O₂敏感的基因(51)。PYC能从不同的物种获得，乳酸乳球菌pyc是被表达为一个实施例(AF068759)。

缩写：氨苄西林(Ap)；苯唑西林(Ox)；羧苄青霉素(Cn)；氯霉素(Cm)；卡那霉素(Km)；链霉素(Sm)；四环素(Tc)；萘啶酮酸(Nal)；红霉素(Em)；氨苄西林耐药性(Ap^R)；甲砜氯霉素/氯霉素耐药性(Thi^R/Cm^R)；大环内酯，林可酰胺和链阳性菌素A耐药性(MLS^R)；链霉素耐药性(Sm^R)；卡那霉素耐药性(Km^R)；革兰氏阴性复制起点(ColE1)；革兰氏阳性复制起点(OriII)。常见的限制酶和限制位点可以在NEB(NEW ENGLAND BIOLABS，www.neb.com)和INVITROGEN(www.invitrogen.com).ATCC，AMERICAN TYPE CULTURECOLLECTION^TM(www.atcc.org)找到。

本发明某些实施方案中所用质粒和菌株在表1和表2中列出。MG1655是在F接合中F-λ-的自发突变缺陷，如Guyer等人所报道(18)。用P1噬菌体转导和基于λred重组酶的一步失活法来消除途径(10)。使用本文所引用的以及Sambrook(38)与Ausebel(5)描述的标准生物化学技术来构建质粒和突变大肠杆菌菌株。

表1：质粒

 质粒基因型  参考文献 pTrc99A pDHC29 pDHK29 pUC19 pHL413克隆载体Ap^R克隆载体Cm^R克隆载体Km^R克隆载体Ap^RpTrc99A中的乳酸乳球菌pyc，Ap^R  1  37  37  60  40

 pCPYCl pHL531 pLOI2514 乳酸乳球菌pyc Cm^R pDHK29中的NADH非敏感型citZ，Km^R pCR2.1中的枯草芽孢杆菌(B.subtilis) citZ-TOPO Km^R/Ap^R    54    41    46

表2：菌株

 菌株 基因型  参考文献 ATCC# GJT001  MG1655 MG1655 arcA CD55K YBS121 HL5K SBS100MG SBS110MG SBS330MG SBS440MG SBS990MGC SBS550MG SBS660MGC MC4100(ATC35695)cadR突变 Δlac(arg-lac)U169rpsL150relA1ptsF Sm^R 野生型(F^-λ^-) ΔarcA::Km^R ΔldhA::Km^R Δack-pta::Cm^R ΔiclR::Km^R ΔadhE，Km^R ΔadhEΔldhA，Km^S ΔadhEΔldhAΔiclR，Km^S ΔadhEΔldhAΔiclRΔarcA，Km^S ΔadhEΔldhAΔack-pta::Cm^R ΔadhEΔldhAΔiclRΔack-pta::Cm^R ΔadhEΔldhAΔiclRΔarcAΔack-pta::Cm^R  45   18  23  11  56  28  41  40  41  41  41  41  41   47076^TM

如果合适，每次实验菌株是刚刚用质粒转染的。单一菌落在含有适当的抗生素的培养皿上被重新划线。一个单个的菌落被转入250ml摇瓶中，摇瓶中包含具有适当抗生素的LB培养基50ml，并且在37℃、以250rpm摇动有氧生长所述的单个菌落12个小时。用LB培养基清洗细胞两次，以1％的体积比接种所述的细胞于2L摇瓶内，每个摇瓶内包含400ml具有适当抗生素浓度的LB培养基，并且在37℃、以250rpm摇动有氧生长所述的细胞12个小时。通过离心收获适当量的细胞生物质(～1.4gCDW)，弃上清。细胞被重新悬浮于60ml厌氧LB培养基中(LB肉汤培养基补充有20g/L的葡萄糖，1g/L的NaHCO₃)，并且立即接种于反应器中达到约10OD₆₀₀的浓度。

发酵在完全无氧条件下进行。1L的生物反应器中有0.66L包含适当抗生素的LB培养基的初始体积。在0时间点，如前所述，反应器被接种到约10OD₆₀₀。当接种物足以改变培养物浓度时，之前所述的反应器内葡萄糖和抗生素起始浓度及细胞密度是在计算了接种体的稀释作用后的浓度。在发酵期间内，用1.0M Na₂CO₃将pH保持在7.0，CO₂以0.2L/min的恒定流速喷射经过培养物。温度和振荡分别维持在37℃和250rpm。从反应器中取出用于确定葡萄糖和产物浓度样本，用0.2μm滤器过滤，然后立即用HPLC进行分析。

实施例1：NADH竞争性途径的去除

SBS110MG中醇脱氢酶(adhE)和乳酸脱氢酶(ldhA)的活性被降低，来关注损耗NADH产出醇和乳酸而以琥珀酸为代价(39)。SBS110MG(pTrc99A)消耗了11％的起始葡萄糖，带来低的琥珀酸产量和高的乙酸产量。

实施例2：丙酮酸羧化酶的表达

来自乳酸乳球菌的异源PYC表达(质粒pHL413)，通过将丙酮酸直接转化成OAA，有助于增加OAA库，OAA起着乙醛酸和发酵途径的前体的作用，如图1中所示，两者均能导致琥珀酸的产生。正如所预料，归因于活性的iclR，菌株SBS990MG比SBS330MG(pHL413)和SBS550MG(pHL413)具有更低的ICL和MS活性，然而，基础酶水平似乎足以启动乙醛酸途径。

产琥珀酸大肠杆菌中PYC的表达异源增加了从丙酮酸到OAA的通量。PYC将丙酮酸转向OAA有助于生成琥珀酸。容纳(harboring)编码来自乳酸乳球菌的异源丙酮酸羧化酶的质粒pHL413的SBS110MG，在CO₂气体中培养24小时，从18.7g/L(104mM)葡萄糖生成15.6g/L(132mM)琥珀酸，每摩尔葡萄糖产出1.3摩尔琥珀酸。证明了增加OAA来增加琥珀酸产出量的有效性。

实施例3：激活乙醛酸支路

ICLR的失活通过aceBAK的操纵子的激活使乙酰辅酶A转向琥珀酸的生成，从而降低碳通量通过乙酸并继续乙酰辅酶A的循环。菌株SBS330MG(pHL413)中ACK-PTA被活化，因此，即使该途径已经被基因活化，也只有极少的碳流量被转向乙醛酸。相对于野生型对照组(数据未示出)，这种菌株所显示的较高酶活性证明了乙醛酸途径的活性。具有较高的ICL和MS活性的菌株是SBS330MG(pHL413)和SBS550MG(pHL413)。这些菌株显示两倍以上的野生型菌株的活性。菌株SBS330MG是通过使adh，ldh突变体SBS110MG中的iclR基因失活而创建的中间菌株(intermediate strain)。在ldhA adhE突变体中，乙酰辅酶A转向乙醛酸途径，由此而减少了乙酸排泄。即使当该菌株中的乙醛酸途径在结构上已经被活化，乙酰辅酶A仍然被引导通过乙酸途径。

如图3所示，SBS330MG菌株中每摩尔葡萄糖产出1.1mol琥珀酸，每摩尔葡萄糖0.66mol甲酸，以及每摩尔葡萄糖0.89mol醋酸。虽然SBS330MG(pHL413)产出相当数量的琥珀酸，该菌株也产出了最高水平的甲酸和乙酸。

实施例4：有氧呼吸调节的去除

ARCA蛋白属于双成分(ARCB-ARCA)信号转导系统家族，与其同源的感觉激酶ARCB相呼应，代表整体的调节体系，负向或正向调节许多操纵子的表达，如黄素蛋白族的几个脱氢酶、末端氧化酶、三羧酸循环、乙醛酸支路的酶和用于脂肪酸降解的途径的酶。突变株SBS440MGC包含arcA的突变型，一种编码参与有氧呼吸调节的蛋白的基因。

SBS440MGC菌株中arcA的缺失产出每摩尔葡萄糖1.02mol/mol琥珀酸，每摩尔葡萄糖0.45mol/mol甲酸，以及每摩尔葡萄糖0.75mol/mol醋酸，如图3所示。ARCA的去除没有显著影响葡萄糖的消耗(图2)，但少量降低了总的琥珀酸的产量(图3)。

实施例5：减少乙酸产出量

在菌株SBS990MGC中，在醇脱氢酶(adhE)和乳酸脱氢酶(ldhA)的背景下，乙酸激酶-磷酸转乙酰基酶(ackA-pta)减少，增加了琥珀酸的产出量，减少了经由乙醇和乳酸的产出对NADH的消耗。ack和pta基因缺失消除了形成乙酸的主要途径。虽然突变株SBS990MG中包含adhE、ldhA和ack-pta基因缺失，SBS990MG仍有完整的iclR。有活性的ICLR能减少ACEBAK的表达，但剩余的ACEA和ACEB酶活性可能仍然允许具有残留的乙醛酸支路活性。

SBS990MG中增加的NADH可利用率的实现，在完全无氧条件下，将琥珀酸的产量提高到每摩尔葡萄糖1.6mol/mol(图2和图3)。SBS990MG能达到高产量的琥珀酸。

实施例6：双重琥珀酸合成路线

已经利用生物信息学(in silico)研发和检验了一种具有活化乙醛酸途径的途经设计(9)，并通过基因工程的大肠杆菌在体内实现(41)以增加琥珀酸产量，并且缓解了对NADH可利用率的限制。构建菌株SBS550MG(pHL413)具有双重琥珀酸合成路线，该路线将所需量的NADH转向通过传统发酵途径，并且通过平衡经由该发酵途径和乙醛酸途径(它需要更少的NADH)的碳通量，使碳向琥珀酸的转化最大化(41)。和野生型大肠杆菌菌株每摩尔琥珀酸2摩尔NADH的理论需要量相对照，重新设计的途径显示来自葡萄糖的NADH实验需要量是每摩尔琥珀酸～1.25摩尔NADH。

已经证明ldhA adhE iclR突变体中ack-pta失活是造成乙酰辅酶A引导通过乙醛酸途径的关键。乙酸途径的缺失利于以乙酰辅酶A的形式保存碳分子，而乙酰辅酶A转向生成乙醛酸和琥珀酸。乙醛酸到苹果酸，到延胡索酸，最终到琥珀酸的进一步转化，也有利于减少NADH需要量。该途径从2摩尔乙酰辅酶A和1摩尔OAA，生成2摩尔琥珀酸，只需要1摩尔NADH(41)。

对过表达PYC的菌株SBS550MG的性能进行了检测，结果如图2所示。虽然具有PYC的菌株SBS550MG在无氧条件下能相当好地生长，但在该研究中细胞经受无氧琥珀酸生产期之前，采用有氧条件以迅速积聚生物量。具有和不具有pHL531的菌株SBS550MG消耗了100％的葡萄糖，两个菌株从100mM的葡萄糖产出相似水平的琥珀酸(160mM)。在携带质粒pHL531的菌株中，观察到残余甲酸增加，乙酸水平降低，该菌株中过表达了对NADH不敏感的柠檬酸合酶。在以SBS550MG为基础的菌株的培养物中见到的乙酸水平大大低于SBS110MG(pHL413)的培养物中见到的乙酸水平。SBS550MG(pHL413，pHL531)和SBS550MG(pHL413，pDHK29)的琥珀酸产量非常相似(约每摩尔葡萄糖1.6mol/mol琥珀酸)。

尽管过表达了NADH非敏感型柠檬酸合酶，但1.6mol/mol的高琥珀酸产量保持不变，这一事实也表明天然的柠檬酸合酶体系已足以启动乙醛酸途径。此外，这些结果进一步显示双路线琥珀酸生产体系非常强健；该体系能在OAA节点处理相当多的微扰情况而不会显著改变产量。显然，在可利用的减少等价物和碳原子方面，这些细胞能够在发酵和乙醛酸途径间达到一个平衡分配，达到有效地最大化的琥珀酸产出。

以SBS660MG为基础的菌株的培养物经过24小时仅消耗25-35％的葡萄糖。SBS660MG(pHL413，pHL531)和SBS660MG(pHL413，pDHK29)菌株产出约1.7mol/mol的相似的琥珀酸产量。在所有被研究菌株中，这些产值在最高值之列(表3)。经转化的突变株SBS660MG(pHL413，pHL531)与对照组相比，没有观察到在琥珀酸、乙酸或甲酸产量方面有显著的差别(图3)。arcA缺失增加了每摩尔葡萄糖的琥珀酸产出量，但降低了葡萄糖的消耗量。

实施例7：柠檬酸合酶的表达

图1描述了大肠杆菌突变株，用丙酮酸羧化酶编码质粒pHL413和柠檬酸合酶表达质粒pHL531转染SBS550MG，SBS660MGC和SBS990MGC产生的不同代谢产物。与对照组和SBS110MG(pHL413)相比，SBS330MG(pHL413)的乙酸产量增加。这些结果表明对柠檬酸合酶可能有某些抑制作用，这种抑制作用是由较高的NADH水平造成的并且受益于较低的NAD⁺水平。众所周知，NADH以别构的方式抑制柠檬酸合酶(33，43)，NAD⁺是NADH结合的微弱竞争性抑制剂(13)。在SBS330MG(pHL413)中观察到的柠檬酸合酶绝对体外活性在所有被研究菌株中是最低的。

菌株SBS550MG(pHL413+pDHK29)作为对照组，SBS550MG(pHL413+pHL531)共表达异源的PYC和柠檬酸合酶。具有和没有pHL531的菌株SBS550MG消耗了100％的葡萄糖，两种菌株从100mM葡萄糖产出相似水平的琥珀酸(160mM)。尽管事实是乙酸途径已被敲除，在发酵结束时培养物中仍能检测到低浓度乙酸。用过表达NADH非敏感型柠檬酸合酶的携带质粒pHL531的菌株观察到剩余甲酸增多和乙酸水平降低。

表3：羧酸产量^A

  菌株    琥珀酸  甲酸    乙酸

SBS550MG(pHL413+pDHK29)SBS550MG(pHL413+pHL531)SBS660MG(pHL413+pDHK29)SBS660MG(pHL413+pHL531)SBS990MG(pHL413+pDHK29)SBS990MG(pHL413+pHL531) 1.59±0.01 1.61±0.01 1.72±0.13 1.73±0.18 1.50±0.00 1.58±0.01 0.13±0.03 0.18±0.04 0.11±0.01 0.10±0.06 0.26±0.03 0.15±0.01 0.08±0.01 0.06±0.00 0.09±0.00 0.10±0.03 0.09±0.01 0.06±0.00

^A在24小时无氧生产期期间，产物摩尔数/葡萄糖摩尔数

与SBS660MG(pHL413，pDH29)对照菌株相比，SBS660MG(pHL413，pHL531)菌株中NADH柠檬酸合酶的表达增加了葡萄糖消耗并且增加了约40％的所产生的代谢物。SBS660MG(pHL413，pHL531)和SBS660MG(pHL413，pDHK29)菌株都产出了相似的约1.7mol/mol的琥珀酸产量。这些产值在所有被研究的菌株中位于最高值之列(表3)。SBS990MG(pHL413，pDHK29)菌株产出的琥珀酸水平与SBS550MG(pHL413，pDHK29)菌株产出的琥珀酸水平非常相似。

结果显示双路线琥珀酸生产体系非常强健的；该体系能在OAA节点处理重大的微扰而不显著地改变产量。在可利用的减少等价物和碳原子方面，工程细胞能在发酵和乙醛酸盐途径间达到一个平衡的分配，达到有效地最大化的琥珀酸产出。这些结果进一步支持当adhE，ldhA和ack-pta失活时，乙醛酸途径可能有某种程度激活的假说。

实施例8：NADH通量分析

用在成批培养条件下获得的测得的通量，来估计细胞内的通量和鉴别关键分支点通量的分流比。由不同突变所造成的在OAA节点进入乙醛酸途径和发酵途径的分支点通量的分流比变化的比较，揭示了琥珀酸产量对这些操作的敏感性。

依据质量守恒定律和细胞内中间代谢物准稳态假设(pseudo-steady state hypothesis，PSSH)，构建了一个代谢矩阵。从依据图1所示代谢网络公式化的一组线性方程所得到的化学计量矩阵给出了一个维数为15×15的方矩阵，该方矩阵仅依据测得的代谢物、细胞内代谢物的PSSH平衡和NADH平衡。对NADH平衡，假定NADH的产出量和消耗应当是相等的。氧化还原平衡的推导不考虑任何被生物质同化的碳原子。除野生型外所有突变体的生物量(υ₂)都被假定为零，是在生成能找到最小二乘拟合值的多种因素决定系统时的度量方法。数学表达式、化学计量矩阵和与所述网络中各种物质有关的净转化方程在表4(酶的反应)中给出。

表4：酶的反应

反应    酶1 葡萄糖+PEP6磷酸葡萄糖+丙酮酸    葡萄糖：PTS；酶I，HPr，II^Glc，III^Glc

2 6磷酸葡萄糖生物质3 6磷酸葡萄糖+ATP2×3磷酸甘油醛+ADP  a.6磷酸葡萄糖6磷酸果糖  b.6磷酸果糖+ATP1，6二磷酸果糖+ADP  c.1，6二磷酸果糖磷酸二羟基丙酮+3磷酸甘油醛  d.二羟基丙酮-P3磷酸甘油醛4 3磷酸甘油醛+NAD⁺+P_i+2ADP丙酮酸+  H₂O+NADH+H⁺+2ATP  a.3磷酸甘油醛+NAD⁺+P_i1，3二磷酸甘油酸+  NADH+H⁺  b.1，3二磷酸甘油酸+ADP3磷酸甘油醛+ATP  c.3磷酸甘油酸2磷酸甘油酸  d.2磷酸甘油酸PEP+H₂O  e.PEP+ADP丙酮酸+ATP5 I.PEP+CO₂OAA+P_i  II.Pyr+ATP+CO₂草酰乙酸+ADP+P_i6 丙酮酸+NADH乳酸+NAD⁺7 丙酮酸+HSCoA甲酸+乙酰辅酶A8 甲酸CO₂+H₂9 乙酰辅酶A+P_i+ADP乙酸+HSCoA+ATP  a.乙酰辅酶A+P_i乙酰P+HSCoA  b.乙酰-p+ADP乙酸+ATP1 乙酰辅酶A+2NADH+2H⁺乙醇+HSCoA+0 2 NAD⁺  a.乙酰辅酶A+NADH+H⁺乙醛+  HSCoA+NAD⁺  b.乙醛+NADH+H⁺乙醇+NAD⁺1 2乙酰辅酶A+H₂O+草酰乙酸苹果酸+1 琥珀酸HSCoA+辅酶A  a.乙酰辅酶A+H₂O+草酰乙酸柠檬酸+CoA  b.柠檬酸异柠檬酸  c.异柠檬酸乙醛酸+琥珀酸  d.乙醛酸+乙酰辅酶A苹果酸+HSCoA1 草酰乙酸+NADH延胡索酸+NAD⁺+H₂O2  a.草酰乙酸+NADH苹果酸+NAD⁺  b.苹果酸延胡索酸+H₂O1 延胡索酸+NADH+P_i+ADP琥珀酸+NAD⁺+    6磷酸葡萄糖异构酶  果糖磷酸激酶，PFK  二磷酸果糖醛缩酶  磷酸丙糖异构酶    3磷酸甘油醛脱氢酶   3磷酸甘油酸激酶  磷酸甘油酸变位酶  烯醇化酶  丙酮酸激酶  PEP羧化酶  丙酮酸羧化酶  乳酸脱氢酶  丙酮酸甲酸裂合酶  甲酸氢裂合酶   乙酸磷酸转移酶，PTA  乙酸激酶，ACK；或化学水解作用    醛脱氢酶   醇脱氢酶    柠檬酸合酶  乌头酸水合酶  异柠檬酸裂合酶  苹果酸合酶    苹果酸脱氢酶  延胡索酸酶C  延胡索酸还原酶

 3 ATP

向量r(t)(m×1)，其中m＝15，16或17)表示对不同代谢物的净转化率：

r^T＝[r₁......r₈ 0 0 0 0 0 0 0 0 0]

对MG1655(pHL413)，不考虑H2和生物量的平衡，因此矩阵A减少为15×15的方矩阵，通过方程1得到精确解：

υ(t)＝A^-1r(t)           (1)

对突变株SBS110MG(pHL413)、SBS330MG(pHL413)、SBS550MG(pHLA13)和SBS990MGC(pHL413)，不考虑H2平衡，考虑生物量，其结果给出一个由多种因素决定的系统(m＝16并且n＝15)，该系统利用最小二乘拟合法由下面的方程2来估算：

υ(t)＝(A^TA)^-1A^τr(t)    (2)

对分泌的代谢物浓度变化的时间拟合值被确定在t＝0h和t＝6h或7h之间，并且如下式(4)基于平均细胞密度：

$>>>r>i>>=>>>>C>i>>>(>t>+>\delta t>)>>->>C>i>>>(>t>)>>>>\delta txver>>X>‾>>>>->->->>(>3>)>>>s>$

其中，

$>ver>>X>‾>>=>>>X>>(>t>+>\delta t>)>>->X>>(>t>)>>>>ln>\{>>>X>>(>t>+>\delta t>)>>>>X>>(>t>)>>>>\}>>>->->->>(>4>)>>>s>$

研究发现，琥珀酸产量对在OAA节点的分流比比在PEP/PYR节点的分流比相对更为敏感。为得到最高的琥珀酸产量，最有利的分流比是在OAA的分数分配为0.32到乙醛酸，0.68到菌株SBS550MG(pHL413)和SBS990MG(pHL413)中得到的发酵途径。这两种菌株达到的琥珀酸产量分别是1.6mol/mol和1.7mol/mol。前面已显示ldhA，adhE，ack-pta突变菌株中活化的乙醛酸途径是造成在无氧下达到高琥珀酸产量的原因。与野生型相比，在无氧发酵的起点发现SBS550MG(pHL413)和SBS990MG(pHL413)中NADH和乙酰辅酶A的高细胞内水平，但这些水平很快降低，表明尽管PEP/PYR分支点下游的酶失活，这些菌株仍能处理高糖酵解通量。

菌株SBS550MG(pHL413)的糖酵解通量(υ₁到υ₄)相对于SBS330MG(pHL413)是增加的，但相对于野生型对照菌株是降低的。PFL通量(υ₇)相对于野生型对照菌株也是降低的，造成乙酸和甲酸通量显著减少。这些糖酵解通量证明高的琥珀酸产量取决于在OAA-柠檬酸和OAA-苹果酸之间羧酸产出量的分配。通量分配平衡了NADH消耗量并且导致增加的琥珀酸产出量。在高琥珀酸产出菌株中的分配在10-40％柠檬酸来源的琥珀酸和90-60％苹果酸来源的琥珀酸产出量之间变化(见图1)。

  表5：代谢通量  通量  至：    MG1655    (pHLA13)    SBS110MG    (pHL413)    SBS330MG    (pHL413)    SBS550MG    (pHLA13)    SBS990MG    (pHL413)  υ1  υ2  υ3  υ4  υ5  υ6  υ7  υ8  υ9  υ10  υ11  υ12  υ13  υ_RF  υ_ES  葡萄糖摄取^*  生物量  G-3-P  PEP+丙酮酸  OAA  乳酸^*  细胞内甲酸  H₂  乙酸^*  乙醇^*  乙醛酸琥珀酸  苹果酸  细胞内琥珀酸  残余甲酸^*  分泌的琥珀酸^*  CO₂  琥珀酸产量  (NADH)_U/Gl  (NADH)_S/琥珀酸    3.46    0.07    3.38    6.77    2.90    0.00    3.87    0.42    2.58    0.65    0.32    2.58    2.90    3.45    3.22    -2.48    0.93    1.96    1.70    2.78    0.00    2.83    5.66    2.94    0.00    2.74    0.27    2.35    0.00    0.21    2.74    2.97    2.47    3.19    -2.67    1.15    2.04    1.79    1.28    0.00    1.37    2.77    1.31    0.21    1.27    0.00    1.22    0.00    0.05    1.28    1.35    1.62    1.43    -1.31    1.12    2.17    1.83    2.13    0.00    2.16    4.32    2.57    0.00    1.76    0.77    0.14    0.00    0.82    1.76    2.58    0.99    3.41    -1.80    1.60    2.03    1.27    1.96    0.00    2.08    4.19    2.53    0.00    1.72    0.63    0.12    0.00    0.83    1.72    2.58    1.09    3.44    -1.90    1.75    2.14    1.25

实施例9：补料分批无氧发酵

由于更可控的环境，生物反应器形成更高的生产率。重复进行了一个批次的实验以检测在受控的条件下SBS550(pHL314)产出琥珀酸的效率(图5)。在该实验中，生物反应器起始装载LB，并补加了86mM葡萄糖。在0时间点，反应器被接种至OD值为17。当指针指示葡萄糖降到约20mM时，以脉冲形式加入葡萄糖。起始葡萄糖浓度差别和在各轮中葡萄糖添加的时间的差别，不影响菌株的性能。

如图5所示，菌株在产出琥珀酸方面非常有效。琥珀酸的产出量在每小时12mM到9mM琥珀酸之间，具有1.6mole/mole的极高效产量。该体系仅产生极少量的其他代谢物，如作为副产品的甲酸和乙酸。该体系将有望被进一步优化，把琥珀酸产量提高到1.8、1.9或2.0mole/mole，甚至更高。

所引用的文献都特意被引入作为参考。在此，为方便起见，这些文献被再次列出：

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