提高臭曲霉ZU－G1发酵生产的α－半乳糖苷酶稳定性的保护剂及其应用

摘要

本发明公开了一种提高、改进臭曲霉ZU－G1液体发酵生产的α－半乳糖苷酶稳定性的保护剂，重量份组成为：甘露醇18～36；棉籽糖76～126；海藻糖38～95。使用时向每100ml臭曲霉ZU－G1液体发酵生产的α－半乳糖苷酶的粗酶液中加入保护剂130～260mg。采用本发明保护剂，使得臭曲霉ZU－G1液体发酵生产的α－半乳糖苷酶在30℃～60℃酶活保留率提高11.6％～21.7％，耐酸性从pH4.0下降到pH3.0，在pH3.0的环境中任保留52％的活性，提高了α－半乳糖苷酶的最大作用效率，拓宽了该酶在酸性环境中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种提高、改进臭曲霉ZU-G1液体发酵生产的α-半乳糖苷酶稳定性的保护剂及其应用。

背景技术

豆制品及其功能性成分具有良好的营养价值和保健功能，且物美价廉，所以是各档次餐桌上必不可少的食物，然而豆类所含的低聚糖却不易被人体消化吸收，它们在肠道被细菌发酵，食用后会引起嗝气、腹胀、腹痛等人体不适症状。近年来的研究发现，α-半乳糖苷酶可以很好的解决这个问题，α-半乳糖苷酶可将低聚糖中的水苏糖、棉籽糖、蜜二糖等水解，产生单糖，利于人体吸收和利用。

中国发明专利申请200610050135.4中公开了一种臭曲霉(Aspergillus foetidus)ZU-G1 CGMCC No.1628，可以用于生产α-半乳糖苷酶。该专利申请中也详细描述了臭曲霉ZU-G1发酵生产α-半乳糖苷酶的方法。

但酶在具体应用的过程中会出现保存期短，或者酶活性降低，这是因为酶活力很大程度上依赖于酶分子构象的稳定性，酶分子的构象和催化部位的微环境的变化均影响到酶的催化活力，周围温度和pH会导致酶的空间结构破坏从而丧失其原有的生物活性。酶在纯的溶液中比在不纯的溶液中更易变性。α-半乳糖苷酶的结构与其热稳定性有直接相关性，周围环境会影响实际应用过程中作用效率。

国内外研究者已对α-半乳糖苷酶的生产、应用等技术问题进行了初步研究与探索，但对该酶稳定性的研究报道较少，缺乏液体α-半乳糖苷酶制剂有效应用的理论依据。

发明内容

本发明提供一种提高臭曲霉ZU-G1液体发酵生产的α-半乳糖苷酶热稳定性和pH耐受性的保护剂。

一种提高臭曲霉ZU-G1α-半乳糖苷酶稳定性的保护剂，重量份组成为：

甘露醇              18～36

棉籽糖              76～126

海藻糖              38～95

所述的保护剂，优选重量份组成为：

甘露醇              25～30

棉籽糖              90～110

海藻糖              60～70

所述的保护剂，最优选重量份组成为：

甘露醇               27

棉籽糖               101

海藻糖               66

优选重量份组成的保护剂在高温和酸性条件下，酶活的保留效果也更佳。

本发明中由海藻糖、甘露醇和棉籽糖构成了能提高和延长臭曲霉ZU-G1发酵生产α-半乳糖苷酶热稳定性的保护剂，所用的保护剂无毒、来源广，易于大规模使用。

本发明还提供了所述的保护剂在提高臭曲霉ZU-G1α-半乳糖苷酶稳定性中的应用，向每100ml臭曲霉ZU-G1α-半乳糖苷酶的粗酶液中加入所述保护剂132～257mg，优选加入所述的保护剂175～210mg。

最优选加入所述的保护剂194mg，此时保护剂中含甘露醇27mg、棉籽糖101mg和海藻糖66mg。

所述的粗酶液为按照中国发明专利申请200610050135.4中公开的方法得到的α-半乳糖苷酶发酵液，经过离心分离、盐析、透析等常规处理后得到的α-半乳糖苷酶粗酶液。

采用本发明的保护剂，使得臭曲霉ZU-G1液体发酵生产的α-半乳糖苷酶在30℃～60℃酶活保留率提高11.6％～21.7％，耐酸性从pH4.0下降到pH3.0，在pH3.0的环境中仍保留52％的活性，提高了α-半乳糖苷酶的最大作用效率，拓宽了该酶在酸性环境中的应用。采用本发明的方法处理、保存的酶使用安全，可作为食品级及饲料级的添加剂。

具体实施方式

实施例1臭曲霉ZU-G1液体发酵生产α-半乳糖苷酶粗酶液

按照中国发明专利申请200610050135.4中公开的方法，发酵培养基30ml盛于250ml三角瓶中，接入1ml臭曲霉ZU-G1孢子(浓度为1×10⁶个/ml)，在转速为200rpm的摇床上28℃培养96h小时后获得的α-半乳糖苷酶发酵液。发酵液用冷冻离心机离心15min，转速为8000rpm，收集上清液并对其用硫酸铵分级盐析(硫酸铵饱和度20％-70％)，然后收集沉淀，用少量pH5.0的0.2mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解，装入透析袋，蒸馏水透析数小时(4℃)，直至透析袋外液检测不到硫酸根离子为止，透析袋内的即为α-半乳糖苷酶粗酶液。

实施例2～10

在实施例1中得到的粗酶液(酶活大约100U/ml)中加入本发明的保护剂；每100ml粗酶液中甘露醇、海藻糖和棉籽糖的使用比例见表1，粗酶液加入本发明的保护剂后于60℃水浴1h，立即冰浴，稀释100倍后测定其酶活力。其中海藻糖由上海源聚生物科技有限公司生产；甘露醇由广东台山化工厂生产，棉籽糖由美国Amresco公司生产。

表1

实施例  海藻糖  (mg/100ml  粗酶液)  甘露糖  (mg/100ml  粗酶液)  棉籽糖  (mg/100ml  粗酶液)  酶活保留率^*  (％)    2    37.8     18.22    75.6    67.95    3    37.8     27.33    100.8    72.71    4    37.8     36.44    126    64.19

    5    66.15     18.22    100.8    70.39    6    66.15     27.33    126    71.31    7    66.15     36.44    75.6    65.41    8    94.5     18.22    126    66.99    9    94.5     27.33    75.6    67.14    10    94.5     36.44    100.8    67.34

经方差分析表明：保护剂的最佳配方为：甘露醇与粗酶液的重量体积比为27.33mg/100ml，海藻糖与粗酶液的重量体积比为66.15mg/100ml，棉籽糖与粗酶液的重量体积比为100.8mg/100ml。

实施例11  不同温度条件下使用本发明保护剂提高α-半乳糖苷酶热稳定性的实验

以4℃放置的未作热处理未加保护剂的酶活保留率计为100％，将加入保护剂的臭曲霉ZU-G1液体发酵生产的α-半乳糖苷酶与未加保护剂的对照组在不同的温度下热处理不同的时间后所得的酶活保留率做了对比，本实验中每100ml的粗酶液中加入27mg甘露醇、66mg海藻糖和101mg棉籽糖。具体结果见表2所示。

表2

  温度  ℃    保温30分钟    保温60分钟  对照组  酶活保  留率  (％)  本发明  酶活保  留率  (％)酶活保留提高率(％)  对照组  酶活保  留率  (％)  本发明  酶活保  留率  (％)酶活保留提高率(％)    30    77.0    91.4    18.7    75.1    87.6    16.6    40    75.0    89.5    19.3    71.5    83.5    16.8    50    73.2    89.1    21.7    69.0    80.7    16.9    60    65.6    73.2    11.6    61.1    69.8    14.2

粗酶液加入本发明的保护剂于60℃水浴1h后立即冰浴，稀释100倍后测定其酶活力。实验表明：在30℃～60℃，本发明方法处理后的α-半乳糖苷酶的酶活保留率提高11.6％～21.7％。

实施例12  不同pH值对α-半乳糖苷酶稳定性影响的实验

以4℃放置的未作热处理未加保护剂的酶活保留率计为100％，利用加有保护剂的臭曲霉ZU-G1液体发酵生产的α-半乳糖苷酶粗酶液与未加保护剂的参照组在不同pH下，28℃放置24h后所得的酶活保留率做了对比实验，本实验中每100ml的粗酶液中加入27mg甘露醇、66mg海藻糖和101mg棉籽糖。具体结果见表3所示。

表3

    pH    酶活保留率(％)  本发明  对照组    3    52    -    4    75    65    5    71    79

-没有检测到酶活

实验表明：对照组以pH5.0的酶活保留率最高，在pH3.0时检测不到酶活；而添加保护剂组以pH4.0的酶活保留率最高，在pH3.0时酶活保留率仍然较高(52％)，这利于该酶在酸性环境中的应用。

实施例13  α-半乳糖苷酶的贮存寿命计算

运用加速试验计算了臭曲霉ZU-G1液体发酵生产的α-半乳糖苷酶的贮存寿命，即在28℃、36.2℃和45℃时，酶活性损失50％需要的时间分别为：

对照组为：40.9天、23.3天和7.79天；

本发明为：89.5天、38.4天和8.4天。

说明本发明能延长臭曲霉ZU-G1液体发酵生产的α-半乳糖苷酶的贮存期，贮藏温度越低越利于酶的保存。