组织特异性表达启动子PD54O及其在水稻改良中的应用

摘要

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及包含水稻组织特异表达启动子PD54O的DNA片段的分离克隆、功能验证及应用。所述的PD54O启动子在水稻叶和叶鞘中表达，在胚和胚乳中不表达。用PD54O调控抗虫基因Bt的表达，转基因水稻植株可抵抗螟虫的侵袭，但是在作为食品的种子中不表达Bt蛋白。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及一种DNA片段的分离克隆、功能验证和应用。所述的DNA片段包含一个编码水稻光系统II 10 kD蛋白的基因D54O的启动子，它能够在水稻的绿色组织中表达，且在胚和胚乳中不表达。将该片段与报告基因GUS连接后直接转入植物体，转基因植株中的报告基因仅在叶和叶鞘等绿色组织中表达。将该片段与抗虫的Bt基因融合后转入水稻，遗传转化植株在田间自然发虫的条件下表现出对虫害的抗性。

背景技术

水稻是世界上主要的粮食作物之一，全世界有超过20亿的人口以水稻为主食，而虫害是造成水稻减产的主要原因之一。在现代农业中，使用化学杀虫剂是减少虫害的重要方法，为减少虫害损失起到了巨大作用。但是，化学杀虫剂的使用会不可避免的造成环境污染以及威胁人类健康。

在人们对食物的安全性和环保性日益重视的今天，减少甚至杜绝化学杀虫剂的使用是农业生产的新要求。转基因抗虫作物就可以很好地做到这一点。这是一种新的抗病虫害技术，从1996年开始在世界范围内大规模应用。这些转基因作物可以表达一种细菌Bacillus thuringiensis(Bt)来源的杀虫蛋白。这种细菌作为一种生物杀虫剂在农业生产上已经使用了60多年的历史了。Bt作物在农业上的使用可以大幅度的减少杀虫剂的使用量，这不仅直接降低了种植者的种植成本，而且对保护人类的健康和生态环境都有积极的意义。

日本的研究者石渡于1901年在感病的家蚕体液中分离到了Bt细菌。1915年，Berliner重新分离到了这种菌株，并命名为“Bacillus thuringiensis n.sp.”。1938年，第一种商品化的Bt杀虫剂(商品名Sporeine)在法国上市。在上世纪50年代，Bt杀虫剂在美国开始大规模推广(Martin和Travers，1989)。1987年，获得了第一批Bt转基因植物，包括烟草，番茄等作物(Barton et al.，1987；Fischhoffet al.，1987；Vaeck et al.，1987)。1995年，转Bt作物首次在美国和加拿大实现了商品化种植。2004年，全球Bt作物的种植面积达到了2240万公顷(James，2004)。

在1997年，中国批准了第一个转基因植物——耐贮藏番茄的商品化生产。同年，中国批准了转基因Bt棉(Bollgard棉，美国Monsanto公司)在河北省的种植，正式成为了种植转Bt作物的国家之一(Shelton et al.，2002)。在水稻的应用上，Wunn等在1996年首次获得了转Bt基因的籼稻。1999年，首次报道了获得了双价的Bt水稻，使用的两个Bt基因分别是Cry1Ac和Cry2A(Maqbool et al.，1999)。2000年，首次报道了对Bt水稻进行的田间评价(Tu et al.，2000)。到目前为止，已经有大量的转Bt水稻的试验被报道(Fujimoto et al.，1993；Nayak et al.，1996；Wuun et al.，1996；Ghareyazie et al.，1997；Wu et al.，1997；Cheng et al.，1998；Alam et al.，1999；Tu et al.，2000；Ye et al.，2001；Khanna et al.，2002；Wang et al.2002；Wu et al.，2002；Ramesh et al.；2004)。

这些抗虫害的基因虽然已经克隆出来，有些还已应用与生产实践，取得了良好的效果，但是，随之而来的转基因安全性问题已越来越受人关注。因为抗病虫害的功能基因必须通过转基因发挥其功能，而目前的转化体系存在一些不足，很重要的一点便是转化载体中的启动子大多是组成型表达的。这不仅造成了植物体的负担，使植物表达额外的蛋白，造成了浪费，严重的还造成了植物体生理和代谢的紊乱，致其死亡(Karlowski etal.，2003；Ehsani et al.，2003；Miyao et al.，2003)；更重要的是外源基因在果实或人类食用的器官的表达量很丰富，由此引发了转基因安全性的担忧。而另一方面，Bt蛋白在植物体内的高剂量表达对害虫造成较高的选择压力，有可能促使害虫产生变异，很快获得对Bt蛋白的耐受性。Tabashnik等(1990)报道了在田间发现了对Bt蛋白产生抗性的小菜蛾(diamond moth，Plutella xylostella)，这是第一例的在自然条件下发现的对Bt杀虫蛋白产生抗性的昆虫。

为了解决以上问题，一些改进措施已经开始运用，如标记基因的消除技术(陈颖等，2001)和植物来源的特异性启动子的应用。启动子是一段对基因的表达起调控作用的DNA片段。特异性的启动子分为两类，一是受诱导表达的特异启动子，还有组织特异性表达的启动子。诱导性的启动子对外界的某些物质，如病原物，化学物质或逆境做出反应，启动基因表达。组织特异性的启动子则驱动基因在特定的组织中表达。植物来源的启动子不会造成基因的逃逸，而特异性的启动子又避免了基因过量表达对植物体的伤害，同时也可以避免外源基因在人们食用的部位表达，解除人们对食品安全性问题的顾虑。而且组织特异性的表达减少了Bt蛋白的表达量，避免了高浓度的抗虫蛋白对害虫的高选择压力。因此，分离和克隆不同特异性的启动子，以此驱动外源基因的表达，是转基因作物中外源基因表达的最佳途径。

发明内容

本发明的第一个目的是分离克隆水稻品种农垦58中携带的一个编码类光系统II的10 kD蛋白的基因D54O启动子区的DNA片段，利用这个启动子一方面驱动抗虫基因在水稻植株中表达，增强其抗虫性；另一方面在胚和胚乳中不表达该抗虫基因，以此增强稻米的安全性。这个启动子被命名为P_D54O。

本发明的第二个目的是将所克隆的启动子在培育转基因水稻中的应用。该转基因水稻在特异组织中表达抗虫基因，使其抗虫性增强。

本发明涉及分离和应用一种包含D54O基因启动子的DNA片段(P_D54O)，该片段包含调控在叶和叶鞘等绿色组织中表达而在胚和胚乳中不表达的调控元件。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO.1所示序列的亚片段。

可以采用已经克隆的P_D54O启动子作探针，从基因组文库中筛选到本发明的启动子或同源启动子。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组扩增到本发明的启动子以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含P_D54O启动子的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因植物。

本发明为增强植物转基因的安全性提供了一种新的方法。这些方法包括将该片段和需要的功能基因连接转入植物，由于该启动子不在胚和胚乳中表达，避免了转基因水稻可能产生的食品安全问题。

将克隆的启动子连接抗虫基因转入植物，可以避免植物过量表达目标基因造成的不利影响，这是传统的组成型启动子在转基因的过程中无法做到的

本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的抗虫的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的启动子或基于该启动子的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子，可以用有性杂交的方式将本发明的启动子转入其它的植株。

在本发明的实施例部分，申请人阐述了分离、验证和应用P_D54O启动子的过程以及该启动子的特点。

附图说明

序列表SEQ ID No：1.本发明分离克隆的P_D54O启动子序列。

图1.本发明鉴定和分离克隆水稻组织特异表达启动子P_D54O以及验证其功能的流程图。

图2.cDNA芯片上每个方格中cDNA克隆的排列方式。字母排列成的方框表示cDNA芯片上一个方格，每个方格中有8个位点。每个克隆占据两个位点。A、B、C和D分别代表不同cDNA克隆。

图3.利用cDNA芯片检测不同组织差异表达的cDNA克隆。箭头表示在左右对比的图像中差异表达的cDNA克隆。1和2分别为两次重复试验A：探针来自水稻灌浆期的胚和胚乳的RNA；B：探针来自水稻根、叶片、叶鞘和茎RNA的混合物。

图4.RNA杂交分析D54O基因的表达谱。分别从水稻根、叶片、叶鞘、花期茎和灌浆期穗组织中抽提RNA。由图可以看出，D54O基因在水稻叶和叶鞘中表达，在根、茎和穗中不表达。

图5.D54O基因启动子(P_D54O)的基本结构。预测的启动子包括从-2134到+41的共2175bp的区段。+1是预测的翻译起始位点；-113是预测的CAAT框控制转录起始的频率。

图6.遗传转化载体pCAMBIA1381的结构。

图7.用D54O基因启动子P_D54O驱动报告基因GUS表达。P_D54O包含D54O基因的-2134至+41区段。+1是预测的D54O基因的翻译起始位点。

图8.转基因水稻植株的GUS基因表达模式。组织染色的结果表明，P_D54O调控的GUS基因在水稻叶、叶舌、幼嫩的颖壳和叶鞘中可以检测到表达(蓝色示GUS活性)，但是在水稻根、茎、胚乳和成熟的颖壳中检测不到表达。a，叶鞘；b，叶舌；c，根；d，成熟颖壳；e，幼嫩颖壳；f，叶；g，茎；h，胚和胚乳。

图9.在PD54O-Cry1Ac质粒载体中P_D54O启动子调控抗虫基因Cry1Ac的表达。

图10.携带P_D54O-Cry1Ac的转基因水稻植株在成熟的胚和胚乳中检测不到Bt蛋白。利用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫快速检测试纸条(购自北京银土地生物技术公司)检测混合的转基因水稻植株胚和胚乳样品，在样品中检测不到Bt蛋白的表达。1，阳性对照；2和3，胚和胚乳的混合样品。

图11.携带P_D54O-Cry1Ac的转基因水稻植株的抗虫效果。转基因水稻植株在田间自然条件感染三化螟后，未转基因的对照水稻植株(A)出现严重的虫害，而转基因水稻植株(B)较好地抵抗了螟虫的侵染。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，图1描述了鉴定和分离克隆P_D54O启动子的流程。根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：分离克隆P_D54O启动子

1.利用cDNA芯片技术鉴定水稻中的组织特异表达基因

本发明利用中国普遍推广应用的一个水稻品种明恢63(Oryza sativa ssp.indica)的全生育期平衡化cDNA文库进行cDNA芯片分析。该文库由水稻不同生长时期和不同生理状态下的15种不同组织的cDNA组成(Chu等，2003)。芯片的制作和分析采用已发表的方法(Zhou等，2002)。为了保证杂交结果的可靠性，在cDNA芯片上每个cDNA克隆有两个位点，它们位于同一方格的对称位置(图2)。

本发明利用来自水稻叶片、叶鞘、茎、根和胚及胚乳中的总RNA分别反转录成cDNA并标记放射性同位素作探针，分别与cDNA芯片杂交：通过分析不同探针杂交的同一cDNA位点的杂交信号的变化，鉴定出在胚和胚乳中特异不表达，而在其它组织中表达的基因(图3)。其中有一基因经序列检索分析表明编码一个水稻光系统中的10 kD蛋白，我们将其命名为D54O。

为进一步确定该基因的表达情况，在明恢63的叶、叶鞘、茎、根及穗中取样抽提RNA，用D54O基因的cDNA做探针，进行RNA杂交分析。RNA杂交方法同已经发表的方法(Zhou等，2002)。分析表明该基因仅在叶和叶鞘中表达(图4)，这与cDNA芯片杂交的结果一致。

2.从水稻品种农垦58中分离克隆包含P_D54O启动子的亚克隆片段

本发明以上述cDNA克隆做探针，从水稻品种农垦58(一个中国常用品种)的BAC文库中筛选到一个阳性克隆119H12。用HindIII限制性内切酶消化这个BAC克隆，然后做DNA杂交分析；分析方法同已经发表的方法(Chen等，2002)；杂交探针是D54O基因的cDNA。确定一个包含该基因的约6.5 kb的片段。用HindIII消化BAC克隆119H12，将酶切片段与HindIII处理的pUC19载体(购自美国Amersham Biosciences公司)连接，电转化(Sambrook和Russell，2001)大肠杆菌DH10B(购自美国Invitrogen公司)，制备亚克隆。经扩增检测，获得插入片段为6.5 kb包含D54O基因启动子片段的阳性亚克隆。

3.测序分析克隆119H12的6.5kb片段的亚克隆

本发明采用Shotgun的方法进行测序(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。根据此方法，首先将该片段用超声波(23300Hz，作用2秒)打断，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离大约1kb的DNA片段，纯化后用T4-DNA聚合酶补平末端；将这些片段与限制性内切酶Sma I处理的pUC18载体(购自美国Amersham Biosciences公司)连接，电转化大肠杆菌DH10B，挑克隆检测插入片段大小。选择插入片段在1kb左右的克隆进行测序。

采用M13-R和M13-F通用引物(购自宝生物工程(大连)有限公司)、美国PerkinElmer公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)、根据试剂盒的使用说明书所介绍的双脱氧核苷酸末端终止法分别从每个亚克隆的两端测序。共计对17个亚克隆进行了测序。使用Sequencher 4.1软件(美国Gene Codes Corporation)拼接序列。用该软件自动去除末端测序较差的序列和pUC18载体序列。在重叠序列长度大于40bp、重叠序列的一致性大于95％的条件下进行序列拼接，得到一段长6204bp的序列。目标基因区段的每一个碱基都参照重叠在该位点的多个Shotgun片段的序列来确定。

4.P_D54O启动子的分离和结构分析

将测序得到的序列分别用玉米和用拟南芥做参考模型采用GenScan软件(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)进行基因结构预测分析，两者预测的目标基因编码区结构和位置完全相同，分析结果表明该亚克隆包含一个完整的基因，即D54O基因。采用一系列启动子分析软件，如Softberry网站(http://www.softberry.com)的TSSP软件、PROSCAN软件(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan)、PLACE(A Database ofPlant Cis-acting Regulatory DNA Elements)中的Signal Scan分析工具(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)、TESS软件(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/gene-search.html)、Match 1.0软件(http://www.gene-regulation.com/cgi-bin/pub/programs/match/bin/match.cgi)、以及AliBata2.1软件(http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibata2/index.html)等分析D54O基因启动子的结构。发现启动子区段包含在-2134到+41的2175bp片段内，在-113bp的位置含有调控转录频率的CAAT盒(图5)。

实施例2：P_D54O启动子的功能验证

1.遗传转化载体的构建

所用pCAMBIA1381载体(图6)是国际上常用的植物农杆菌介导的遗传转化载体pCAMBIA1301(Sun等，2004)的系列载体。该载体携带无启动子的报告基因GUS，由澳大利亚CAMBIA实验室(Centerfor the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture)惠赠。

根据序列的分析结果，选取限制性内切酶SmaI和SphI，消化119H12的6.5kb片段的亚克隆，得到约2.1kb的启动子片段，该片段包含了从-2134到+41的区域(相对与翻译起始密码子ATG为+1)，命名为P_D54O。得到的片段用T4 DNA聚合酶抹平酶切片段末端；同时用平端的限制性内切酶SmaI酶切遗传转化载体pCAMBIA1381；酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，纯化酶切产物；然后用去磷酸化酶Alk对纯化的酶切产物进行去磷酸化处理；用包含P_D54O启动子的酶切片段和去磷酸化的pCAMBIA1381载体做连接反应，使其驱动报告基因GUS(β-葡萄糖醛酸酶基因)的表达(图7)。获得的重组质粒被命名为D54O。将D54O质粒电转化(Sambrook和Russell，2001)进入农杆菌菌株EHA105(Sun等，2004)。

2.P_D54O启动子的功能验证

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，1994)将EHA105菌株携带的D54O导入水稻品种牡丹江8(Oryza sativa ssp.japonica)。本发明共获得转化水稻植株36株。在T₀代植株中，对不同的组织进行GUS染色检测(Jefferson and Bevan，1987)，发现GUS活性仅在叶、叶舌和叶鞘中检测到；而在茎、根中无法检测到；在穗发育的初期，颖壳中GUS呈阳性，而在灌浆期开始渐渐减弱，直至消失。在胚和胚乳中全生育期都没有检测出GUS的活性(图8)。这些结果说明P_D54O是绿色组织特异表达启动子，是在胚和胚乳中特异不表达的启动子。

实施例3：P_D54O启动子的应用

1.P_D54O与抗虫基因Bt的融合载体的构建及转化

为了检验P_D54O启动子在水稻抗虫中的应用价值，本发明将前述pCAMBIA1381载体中的报告基因GUS用Bt抗虫基因Cry1Ac(Cheng等，1998)替代，采用实施例2所述的方法将P_D54O启动子与携带Cry1Ac基因的pCAMBIA1381载体连接。获得的重组质粒被命名为P_D54O-Cry1Ac(图9)。将P_D54O-Cry1Ac质粒电转化(Sambrook和Russell，2001)进入农杆菌菌株EHA105(Sun等，2004)。

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，1994)将EHA105菌株携带的P_D54O-Cry1Ac质粒导入水稻品种牡丹江8中，获得20株阳性独立转化植株。利用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫快速检测试纸条(购自北京银土地生物技术公司)和厂商(北京银土地生物技术公司)提供的分析方法检测转基因植株的胚和胚乳样品，没有检测到抗虫蛋白Cry1Ac(图10)。

2.携带P_D54O-Cry1Ac转基因植株的抗虫表现

本发明在大田中对转基因植株的抗虫性进行了检测。大田的抗虫试验在一块不施任何农药而自然发虫的田地中进行。在试验中，转基因植株表现出对螟虫较好的抗性，有效地抵抗了螟虫对水稻的侵害。在转基因的受体材料牡丹江8(对照)的大部分叶片已经枯黄、卷曲的情况下，转基因植株未见明显虫害(图11)。统计结果显示，总共20株转基因水稻中，有7株未见明显虫害，8株仅一片叶被虫害(虫害的叶片卷曲，褪绿)，4株有2片虫害的病叶，仅1株有3片叶遭到虫害，总体结果较好，显示出了良好的转基因抗虫应用前景。

采用“三夹板”ELISA的方法(EnvironLogix，Portland，USA)分析转基因植株叶片中Bt蛋白Cry1Ac的表达量。Bt蛋白的测定采用EnvironLogix公司(EnvironLogix，Portland，USA)的Bt蛋白ELISA检测试剂盒EnvironLogix kits APP003。检测的方法如下：首先从田间采集新鲜的水稻材料，每个材料取大约20mg并精确称重。用500μl检测试剂盒提供的蛋白抽提液在研钵中将材料磨成浆。然后转移到1.5ml的离心管中静置5min，10,000r/min离心2min。最后，用新的1.5ml离心管取上清。在测量Bt蛋白浓度前，用相应的抽提液将样品稀释50倍。按照试剂盒的说明书对稀释后的样品进行测定和计算。检测的结果表明转基因植株抗虫的效果与植株中抗虫基因的表达量密切相关，如果植株体内的Bt蛋白可以达到3μg/g鲜组织重以上的表达量则抗虫的效果良好，植株上虫害的叶片少于等于1片；而低于此浓度的植株则表现为一定程度的虫害。与此同时，转基因植株抗虫的效果与基因的拷贝数无关，在高拷贝的植株中表达量不一定比低拷贝数的植株高，因此抗虫的效果也不一定更好(表1)。

以上结果表明，P_D54O启动子确实可以抑制Bt蛋白在胚和胚乳中的表达，而且抗虫的效果和Bt蛋白的表达量呈正相关。

表1.转基因植株(P_D54O：Cry1Ac-)的Cry1Ac基因拷贝数、Cry1Ac表达量及抗虫效果

 植株号  拷贝数  Bt蛋白表达量(μg/g  鲜组织重，叶片)病害的叶片数 牡丹江8(对照)    8 P_D54O：Cry1Ac-1    1    4.82    0 P_D54O：Cry1Ac-3    1    2.13    2 P_D54O：Cry1Ac-4    2    5.57    0 P_D54O：Cry1Ac-7    2    3.26    1 P_D54O：Cry1Ac-10    3    2.54    3 P_D54O：Cry1Ac-14    4    3.02    1

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序列表

<110>华中农业大学

<120>组织特异表达启动子PD540及其在水稻改良中的应用

<130>

<141>2007-01-19

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2175

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(2175)

<223>

<400>1

gcatgcagtt gccactggtg caacgtaata gttggagtct cctttgtaaa tagaggatac     60

gagattctga atttttgtag caaatagtca atgatttttt cacccttgtg tagatgagtg    120

gcattcgcat gttctgtatt cttgaggata aatttcaacg gttttcttct gaaatgcaga    180

atatgtggtc ttgttggtaa actgttgtct tggactagtc catgctatgc aattttgagc    240

aattcgcatc tggttgtaaa ccgatatatt ctatgggttg tgtttacgaa cgtgactatt    300

gttgagataa tatgatgtca ttatctttgt ttatcttctg tggttcgaac caaacattac    360

taacagaact actccgtgat atgttatttg tgaaagcaat attcatagtt gcaaacataa    420

gctagtgaga tgcacagtaa ctagttatca aaacgaaaaa gaggctagct gactctgctc    480

gtcatgcatg atatgtatga atttttgtag gttactactg atatcagttc atcgatgctg    540

catcatgcat gaactgcagg ttactactga tattgttttg ggcattagca ggtttcagaa    600

ttgaactttc gactgttgct gcgcgcacac aaaataacct tcactgcaaa aatttagtat    660

gacgtatttg caactactgg taaactcata ttgtcacgtt agcattatcc gagacaaatc    720

tatgcttttc aggttaataa gctaaatatt tcagaaaacg tataataata acagttactc    780

cggtgatttt ggaaatttga ctacggtgac gacttgttat cttgatcgaa atgagcgccg    840

tatgaatccc ttcttcggac ttttgagttt acagagcagc tgctgatgga agcaaacctg    900

aggtaaatac tgaggagctt tgctctattg gggatttggg ggtggggtac atatccaagg    960

aggtccagac aactggattt gatctatttc tcctaaaata tactctctcc ggttccatat   1020

taattgatgt tttggacaag gttgaggtca aatttttata acttagacta tcaataactt   1080

tagaaatatt tagtttaaag aaactataac aacatatata gatttgtctt ttaaaatatt   1140

ataataaaag taaacataga tttatttatt atatatatta taatagaaaa ataaggtcaa   1200

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gtaagttgtt tgtgctttta ttattattat ttttaagaaa aagaagaaaa tttatgctag   1320

ccatggattt cagtctcctt gctggatagg ataattgcca gtggctgaaa ttacccagtc   1380

agaaagaaaa taacttacct tatcttgtat tgtcacaggc tcagaattta tctatttccc   1440

cccttgatag taataataat accatctttg gcagagaaac ccagattctt accttctgaa   1500

gtcccctcat tcctgatttg gagtaaatat ttgagtagca tctgaatgtg atgccctagc   1560

tagtgaccat atattaacat tcagttcttt tagataatgg attaaaacct ggcctctata   1620

tccaaactcg gatgtacatg gccaaattaa catccagttc ttcatccacc ttcatatcag   1680

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aaaatcccca gaggataacg ttctggcact gccatatcag gaccggacca tacgcggcgc   1920

gccacgtggc gcgccggcgg tcacacctgt gctggtgcac cctggcatta tccccatcca   1980

ccatcctgtg ggtgactggc caccaaaggt ttttggcgcc acaattatat tgagctgcca   2040

ttgcttctca cctctgcttt gcatccatcc atccatcaga gatcaggtag aacagtgaga   2100

gtgaggtgca gaaaaatttg agctgaagct gaggatggca acatccatga tcacctcgcc   2160

gctggtggcg ccggc                                                    2175