法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2010-11-24
授权
授权
2007-10-03
实质审查的生效
实质审查的生效
2007-08-08
公开
公开
本申请是2000年9月5日申请的，申请号为CN00125042.6的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物工程和医学领域。更具体地，本发明涉及利用人DSPP基因及其编码产物诊断和治疗牙本质生成不全II型的方法，以及含有DSPP基因和/或蛋白的药物组合物。
背景技术
牙齿发育期间和成熟牙齿内的牙本质由于成牙本质细胞生成，牙本质发生时，成牙本质细胞形成牙本质小管，位于小管内的牙本质细胞突使得牙本质成为一个活的组织。牙本质形成的最初阶段成牙本质细胞进行牙本质基质成分的合成、分泌和重吸收。蛋白质合成发生于细胞体内，胞吐作用和胞吞作用主要发生于细胞突内。最先形成的是未矿化的罩牙本质基质，主要为细胞分泌胶原和非胶原成分，成束的胶原纤维集合形成球状结构。由于新的纤维不断增加，胶原变的越来越紧密，最后这些前期胶原纤维转化为胶原纤维。这就形成了以胶原性基质为特征的前期牙本质，随后矿化晶体在离细胞一定距离处逐渐沉积最终形成牙本质。
完全成熟的牙本质无机矿化物质含量比骨略高，占重量的65％，基本上是羟基磷灰石晶体形式。有机质占20％，主要是胶原蛋白和非胶原蛋白(non-collagenousproteins，NCPs)，其中胶原为羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)板状晶体(plate likecrystalline)的沉积提供支架。
牙本质中的胶原主要是I型胶原，其中10％～15％是I型胶原三聚体。I型胶原占胶原成分的97％。与其他结缔组织不同，牙本质之中缺乏III型胶原。牙本质中还含有V型和VI胶原，但含量较少。牙本质非胶原蛋白含量较少，但种类繁多。根据蛋白质的来源不同，将牙本质非胶原蛋白分为牙本质特异性蛋白、矿化组织特异性蛋白、非特异性蛋白、血清来源蛋白(也称牙本质亲和性蛋白)四大类。牙本质特异性蛋白是指唯一由成牙本质细胞合成和分泌，只在牙本质中存在和发现的蛋白。矿化组织特异性蛋白是指既在牙本质中又在牙骨质和骨中存在和发现，由这三种矿化组织中的细胞合成、分泌的蛋白。非特异性蛋白是指既在牙本质中存在，又在其他组织包括软组织中存在，既由成牙本质细胞又由其他类型细胞合成、分泌的蛋白。血清来源蛋白是指由身体其他细胞(主要是肝细胞)合成并分泌进入血清的蛋白，这些蛋白虽不由成牙本质细胞合成，但对牙本质有高度亲和力，可由血液循环进入牙本质中，又称为牙本质亲和性蛋白。蛋白多糖(proteoglycans，PGS)是牙本质中另一类主要的非胶原蛋白质。它是由许多的多糖侧链与一个核心蛋白共价结合形成的大分子。其侧链由重复的二糖链单位组成，每一个单位由一个糖醛酸和一个N-乙酰氨基乙糖组成。蛋白多糖在牙本质发生中的功能之一就是可能影响甚至控制前期牙本质中胶原骨架的组织化。固定在固态支架上的牙本质蛋白多糖在体外生理PH和离子条件下以及在体内均能诱导羟基磷灰石的形成。相反，液态的蛋白多糖却在体外抑制矿物质形成。蛋白多糖与钙离子的结合是诱导羟基磷灰石形成的先决条件。
牙本质生成不全(dentinogenesis imperfecta DGI)是一种常染色体显性遗传病，发病率为1/8000，临床上将其分为3型(2)(注：括号内的数字表示文献的编号)，I型，牙本质生成不全，又名DGI-I，患者除牙本质生成不全外，常伴有成骨发育不全的症状，其病因为广泛的I型胶原基因突变(3)；II型，DGI-II，又名遗传性乳光牙本质(hereditary opalescent dentin)，外显率近100％，其病因与牙本质的矿化不良有关(4)；III型，DGI-III，又名白兰地型牙本质生成不全(dentinogenesis imperfecta，Brandywine type)或称为隔离群遗传性乳光牙本质(isolate hereditary opalescentdentin)，为孤立发生于美国马里兰州华盛顿DC的3个隔离民族群中特殊的遗传性乳光牙本质，该病由Witkop 1956年最初报道(5)，国内未见报道。DGI-III有明显的遗传异质性，其病因与矿化不良相关。由于DGI-I的致病基因已发现，DGI-III只见于美国马里兰州的隔离居民群，因此DGI-II是牙体牙髓病学研究的重点。
DGI-II的临床表现及病理改变。该病由于矿化失调、紊乱，导致牙本质中胚层发育不良，患者乳、恒牙列皆可受累，但乳牙列病损更为严重。牙齿的颜色呈浅蓝色至黄褐色改变，矿化不良的牙本质较软，牙冠易于磨损。此外，矿化不良的牙本质基质代偿性生成增加，造成牙髓腔狭窄或闭塞。X线摄片可见牙冠呈球茎状，颈部收缩，牙根细小，髓腔狭窄或闭塞，根管消失或呈线样狭窄带。病理显示，釉质外表正常，但约1/3患者可见到发育不良和钙化不全。釉牙本质界变异较大，有些牙齿的釉牙本质界扇形结构不明显，而另一些却特别显著。牙本质呈层板状，外层牙本质接近正常，有细分枝的牙本质小管。其余部分的牙本质明显异常，一些短的、形态异常的小管紊乱地分布于牙本质基质之中。前期牙本质带非常宽，沿着层板见到被包埋的细胞残余，类似于被包埋的造牙本质细胞和血管。电镜观察表明，发育不良牙本质微晶的形态和大小没有变化，但数目少，间断可见未钙化或部分钙化的胶原纤维横束和大量结晶空隙。
牙本质生成不全-II型的基因定位。早在1969年，Bixler等(7)企图用一些蛋白多态标记(如ABO、Rh、MNSs、Kell、Fy、JK、HP、ACPl、PGM1和PTC)对DGI-II家系进行连锁分析，但未能得到连锁的证据。至1977年，Mikkelsen等(8)将维生素D结合蛋白一组特异性组分(GC)定位于4q11-q13。次年，Kühnl鉴定出GC有GC2/2、2/1+、2/1-、1+/1-、1+/1+和1-/1-6种表型。随后Ball.S.P等(9)运用GC的多态性标记对其命名的Family MRC4000的DGI-II大家系进行了连锁分析，结果发现DGI-II与GC紧密连锁(Lod值为+7.9，θ＝0.13)。1992年，Crall等(10)将DGI-II定位于GC和干扰素诱导的细胞因子(Interferon-inducible cytokine INP-10)两蛋白多肽标记之间，染色体定位于4q12-21。上述初步结果只是将DGI-II的致病基因粗略定位，在当时情况下，要想在此范围内克隆致病基因几乎不可能。
1995年，Crosby A.H等(11)利用9个短串联重复多态标记(STRP)在收集的2个DGI-II大家系中进行连锁分析，结果致病基因被定位于4q21-23区域的D4S2691和D4S2692两个STRP之间。多点连锁分析提示致病基因可能在以SPP1为中心上下3.2cM的区域。最近，Aplin H.M等(12)应用高密的5个STRP对Crosby A.H的2个大家系进行了基因分型(genotyping)，连锁分析的结果表明，DGI-II致病基因位于GATA62A11和D4S1563两STRP之间，其遗传距离为2cM。此外，该研究小组构建了该区域的YACs Contigs，且应用PCR技术确定了DMP1、IBSP、SPP1和DSPP基因都位于该候选区域内。
然而，迄今为止，尚没有充分揭示牙本质生成不全II型的确切原因，也没有人揭示出牙本质生成不全II型与某种蛋白存在直接的相关性。
此外，本领域还缺乏早期和/或产前诊断牙本质生成不全II型疾病的有效方法以及非手术治疗牙本质生成不全II型的有效手段。
因此，本领域迫切需要开发新的诊断和治疗牙本质生成不全II型的有效方法，以及相关的治疗药物，诊断技术和试剂。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种新的诊断(尤其是产前和/或早期诊断)牙本质生成不全II型(及伴耳聋)的方法及检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种新的治疗牙本质生成不全II型(及伴耳聋)的方法。
本发明的再一目的是提供一种治疗牙本质生成不全II型(及伴耳聋)的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种对个体的牙本质生成不全II型和/或牙本质生成不全II型伴耳聋易感性进行诊断的方法，它包括步骤：
检测该个体的DSPP基因、转录本和/或蛋白，并与正常的DSPP基因、转录本和/或蛋白相比较，
存在差异就表明该个体患牙本质生成不全II型和/或牙本质生成不全II型伴耳聋的可能性高于正常人群。
较佳地，被检测的是DSPP的基因或转录本，并与正常DSPP核苷酸序列比较差异。更佳地，所述的差异选自下组：外显子3，第1位G1→T1；内含子3，第1位的G1→A1。
在本发明的第二方面，提供了一种治疗牙本质生成不全II型和/或牙本质生成不全II型伴耳聋的方法，它包括步骤：给需要所述治疗的病人施用安全有效量的正常DSPP和/或DSP蛋白。较佳地，DSPP和/或DSP蛋白被局部施用于牙周组织。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的DSPP和/或DSP蛋白以及药学上可接受的载体。较佳地，它是针剂。
在本发明的第四方面，提供了一种检测牙本质生成不全II型和/或牙本质生成不全II型伴耳聋的试剂盒，它包括特异性扩增DSPP基因或转录本的引物。较佳地，它还含有与突变部位结合的探针。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
在附图中，
图1是DSPP基因组成的模式图。该基因有5个外显子、4个内含子，总长为8201bp。其中E1(7-98)、E2(2359-2437)、E3(3577-3660)、 E4(3794-4780)和E5(5257-8201)编码DSPP。而E1、E2、E3、E4以及E5的(5257-5520)部分共同编码DSP，E5的(5521-7893)部分编码DPP。
图2显示了牙本质生成不全II型家系4q21区域STRP标记的单体型。
图3显示了牙本质生成不全II型并伴耳聋家系4q21区域STRP标记的单体型。
图4A和4B显示了DSPP基因中的序列变化。图4A显示了在外显子3中，第1位G1→T1，该位点的变化导致密码子由GTT变为TTT(相应氨基酸由Val→Phe)；图4B显示了在内含子3中，第1位的G1→A1，该位点的变化导致了剪切位点改变。
具体实施方式
本发明的发明人经过多年研究，首次发现和证明了牙本质唾磷蛋白(DSPP)和/或牙本质唾蛋白(DSP)与牙本质生成不全II型密切相关，而且发现了它的新功能，牙本质唾磷蛋白或牙本质唾蛋白(DSP)的改变将直接导致牙本质生成不全II型。在此基础上完成了本发明。
首先，本发明人利用收集的国内牙本质生成不全及牙本质生成不全伴耳聋的遗传性家系，通过微卫星标记进行基因分型，运用连锁分析的方法将牙本质生成不全的致病基因定位于第4号染色体的4q21-22区域。
然后，本发明人通过如下步骤确定了牙本质生成不全的候选基因：
(1)找出定位于染色体4q21-22区域所有基因即绘制4q21-22区域的转录图谱。
(2)了解染色体4q21-22区域所有基因在牙髓中的表达情况。
(3)位于染色体4q21-22区域所有基因且在牙髓中表达基因为牙本质生成不全的候选基因。
结果表明，候选基因包括：牙本质基因蛋白(DMP1)，胃唾蛋白(IBSP)，唾磷蛋白(SPP1)，牙本质唾蛋白(DSP)和牙本质磷蛋白(DPP)和牙本质唾磷蛋白(DSPP)。
接着，本发明人对所有的候选基因进行突变筛选，即确定的候选基因利用SSCP技术进行突变筛选，最终发现DSPP的突变与牙本质生成不全有直接因果关系，而其他基因不相关。
最后，通过序列分析确定了两个遗传家系中DSPP基因突变的方式和位置。其中，在一个牙本质生成不全II型家系中，相关的突变情况为外显子3的第1位G1→T1(SEQ ID NO：1中第3577位)，这一改变不仅导致氨基酸发生改变，还可能导致剪切位点的变化，从而可能造成内含子被表达、翻译提前中止、或译码等变化(图4A)，从而无法表达正常的DSPP(或DSP)蛋白。
在另一牙本质生成不全II型并伴耳聋家系中，相关突变情况为内含子3中的第1位的G1→A1(SEQ ID NO：1中的第3661位)。这一改变预计导致剪切位点的变化，从而可能造成内含子被表达、翻译提前中止、或译码等变化(图4B)，从而无法表达正常的DSPP(或DSP)蛋白，还可能影响信号肽的翻译而导致DSPP无法正确定位。令人意外的是，这一位点的变化，不仅造成了牙本质生成不全II型，还导致了携带者患耳聋。这暗示DSPP的变化还与耳聋相关。通过检测DSPP的正常与否，可以诊断耳聋(尤其是牙本质生成不全II型伴耳聋)。
在本发明的基础上，人们可以针对DSPP基因及其产物(转录本、蛋白等)以及相互作用的分子而进行药物设计开发。此外，还可利用DSPP基因进行体外牙齿再造，部分牙齿结构重塑(如牙本质)。
人类的牙本质唾磷蛋白(DSPP)的突变导致人类的牙本质生成不全II型，可根据DSPP基因及其表达产物设计的药物和诊断治疗技术，可用于诊断和治疗人类的牙本质生成不全II型。
人DSPP基因和蛋白：
关于人DSPP基因和蛋白的详细序列，可参见基因库中的登录号AF163151，以及Gu，K.，Chang，S.，Ritchie，H.H.，Clarkson，B.H.and Rutherford，R.B.，Eur.J.OralSci.2000 Feb：108(1)：35-42等文献。在序列表的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中分别列出了人DSPP的核苷酸序列和氨基酸序列。在图1中显示了人DSPP中各内含子和外显子。
外显子1 7..98
mRNA 合并的(7..98，2359..2437，3577..3660，3794..4780，5257..8201)
外显子2 2359..2437
CDS 合并的(2387..2437，3577..3660，3794..4780，5257..7896)
信号肽 2387..2431
成熟肽 合并的(2432..2437，3577..3660，3794..4780，5257..7893)
/产物＝″牙本质唾磷蛋白″
成熟肽 合并的(2432..2437，3577..3660，3794..4780，5257..5520)
/产物＝″牙本质唾蛋白″
外显子3 3577..3660
外显子4 3794..4780
外显子5 5257..8201
成熟肽 5521..7893
其他调整 5596..5604/注＝″区域：细胞结合域″
polyA信号 7988..7993
polyA信号 8171..8176
DSPP和/或DSP蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗DSPP和/或DSP蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进DSPP和/或DSP蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人DSPP和/或DSP蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人DSPP和/或DSP蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对人DSPP DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人DSPP基因产物或片段。较佳地，指那些能与人DSPP基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人DSPP蛋白的分子，也包括那些并不影响人DSPP蛋白功能的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人DSPP基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人DSPP蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人DSPP蛋白功能的抗体以及不影响人DSPP蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人DSPP基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人DSPP基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人DSPP和/或DSP蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人DSPP和/或DSP蛋白。
多克隆抗体的生产可用人DSPP和/或DSP蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与DSPP和/或DSP蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、或局部给药。较佳地是在牙周组织局部给药。
正常的DSPP和/或DSP多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于牙本质生成不全I I型方面的治疗。在使用本发明DSPP和/或DSP蛋白时，还可同时使用其他治疗牙本质生成不全II型的药剂。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明DSPP和/或DSP蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如针剂、片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的DSPP和/或DSP蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
人DSPP和/或DSP蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于DSPP和/或DSP蛋白的无表达或异常/无活性的DSPP和/或DSP蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。构建携带DSPP和/或DSP基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人DSPP和/或DSP基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
本发明还涉及定量和定位检测人DSPP和/或DSP蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人DSPP和/或DSP蛋白水平，可以用作解释人DSPP和/或DSP蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断DSPP和/或DSP蛋白起作用的疾病。
一种检测样品中是否存在DSPP和/或DSP蛋白的方法是利用DSPP和/或DSP蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与DSPP和/或DSP蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在DSPP和/或DSP蛋白。
DSPP和/或DSP蛋白的多聚核苷酸可用于DSPP和/或DSP蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，DSPP和/或DSP蛋白的多聚核苷酸可用于检测DSPP和/或DSP蛋白的表达与否或在疾病状态下DSPP和/或DSP蛋白的异常表达。如DSPPDNA序列可用于对活检标本的杂交以判断DSPP和/或DSP蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用DSPP和/或DSP蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测DSPP和/或DSP蛋白的转录产物。
检测DSPP和/或DSPP蛋白基因的突变也可用于诊断DSPP和/或DSP蛋白相关的疾病。DSPP和/或DSP蛋白突变的形式包括与正常野生型DSPP DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
DGI-II家系42人，DGI-II伴耳聋家系共14人。所有家系成员都由经验丰富的口腔科医师认真检查确诊，并作详细记录。耳聋患者由五官科医师认真检查，并得到电测听和脑干诱发电位的资料进一步证实。抽取家系成员5ml外周血，ACD血球保存液抗凝处理，DNA提取按如下方法进行：
血样DNA的制备
血样DNA抽提使用Qiagen试剂盒，方法按厂家的方案进行，具体步骤如下：
a.于1.5ml的离心管中加入蛋白酶K(20μl)、抗凝血标本(200μl)及缓冲液AL(200μl)。振荡15秒混匀。
b.于56℃消化10分钟后，加100％乙醇210μl，低速离心10秒。
c.将以上混合物移到QIAamp离心柱中，8000rmp离心1分钟。
d.弃去滤过液并将QIAamp离心柱转到新的2ml收集管中。
e.加500μl缓冲液AW1到QIAamp离心柱内，8000rmp离心1分钟。
f.弃去滤过液并在QIAamp离心柱中加入500μl的AW2，14000rpm离心3分钟。
g.弃去滤过液并将QIAamp离心柱转移到新的1.5ml的离心管。
h.加200μl缓冲液AE到QIAamp离心柱内，室温静置5分钟，8000rpm离心1分钟，离心管内收集的液体即为血液中抽取的DNA溶液。
i.1％琼脂糖电泳检查抽取的DNA质量，然后用紫外分光光度计将DNA定量，-20℃保存备用。
实施例2
1、基因分型：
4q21区的高度多态的STR标记(标记A-G分别为：
D4s2691，D4s1534，GATA62A11，DSP，DMP1，SPP1，D4s451)的引物序列从GenomeDatabase中获得。PCR扩增在MJ-Research Inc.PTC-225型PCR仪中进行。扩增程序采用LI-COR公司的操作说明书中touchdown Program各项参数。PCR反应体系为10μl，含20ng基因组DNA模板，2.0mM dNTP，1.0pM带有M13尾巴正链引物和1.0pM反链引物，1.0pM荧光标记的M13引物，1.5mM MgCl2，10mM Tris-HCl，1U的Gold Taq酶(Perkin-Elmer Corp.)。反应体系开始于95℃变性8分钟，随后95℃变性45秒，68℃退火2分钟，每循环下降2℃，72℃延伸1分钟，4循环后，95℃变性45秒，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，2～4个循环后，退火温度降至50～54℃，95℃变性30秒，50～54℃退火30秒，72℃延伸30秒，共20～30个循环，最后72℃延伸15分钟。PCR产物和荧光标记的标准DNA marker在LICOR测序仪上进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集的资料由Base Image 4.1和GeneImage 3.12软件分析，同时制作连锁分析家系文件。该连锁分析家系文件直接用于下一步的连锁分析和单体型分析。
2、连锁分析和单体型分析：
DGI-II遗传方式定位常染色体显性遗传。等位基因外显率为100％，疾病基因频率设为0.0001，各个STR的等位基因频率取平均值。运用LINKAGE5.10版的MLINK和ILINK程序进行2点连锁分析，单体型构建由SIMWALK2 Version 2.31和CYRILLIC2.02软件分析。
数据如表1和2，以及图2和3所示。
表1 DGI-II家系致病基因位点和4q21区STRP位点的两点连锁分析
表2 DGI-II伴耳聋家系致病基因位点和4q21区STRP位点的两点连锁分析
结果表明，收集的DGI-II家系以及DGI-II伴耳聋家系的致病基因与4q21的STRP标记连锁。
实施例3
候选基因的突变筛选
运用Primer 5.0(http://www/PrimerBiosoft.com)软件设计覆盖DSP基因外显子及外显子和内含子交界区的引物(具体序列如表3所示)，利用PCR-SSCP技术对DSP基因进行突变筛选，PCR产物在10％非变性的聚丙烯酰胺凝胶和含4％甘油的9.3％非变性聚丙烯酰胺凝胶两种条件下电泳，然后按常规的标准方法银染。
引物如下：
表3 DSPP编码区的引物序列
PCR产物测序了解突变的类型及位置
1、常规PCR扩增经SSCP筛选出电泳带谱有特征性改变的基因序列。
2、Millipore柱纯化PCR产物。
3、测序反应
(1)反应体系
反应化合物 2ul
引物(0.8uM) 2ul
纯化PCR产物 3ul
(2)反应条件
96℃ 30秒
96℃ 30秒
50℃ 5秒
60℃ 4分钟
60℃ 4分钟
35个循环
(3)测序反应产物的沉淀
A.在测序反映产物中加入9倍体积的70％乙醇，4℃3min
B.4℃，4000rpm离心30min
C.4℃倒置离心，当速度达到1300rpm时立即停止。
(5)上样测序
A.在沉淀的测序反应产物中加入2ul上样染料。
B.90℃变性2min，立即冰浴。
C.ABI PRISM 377测序仪上加样，测序。
结果如图4A和4B所示。其中，在牙本质生成不全II型家系中，相关的突变情况为外显子3的第1位G1→T1(SEQ ID NO：1中第3577位)，这一改变不仅导致氨基酸发生改变，还可能导致剪切位点的变化，从而可能造成内含子被表达、翻译提前中止、或译码等变化(图4A)，从而无法表达正常的DSPP(或DSP)蛋白。
在另一牙本质生成不全II型并伴耳聋家系中，相关突变情况为内含子3中的第1位的G1→A1(SEQ ID NO：1中的第3661位)。这一改变预计导致剪切位点的变化，从而可能造成内含子被表达、翻译提前中止、或译码等变化(图4B)，从而无法表达正常的DSPP(或DSP)蛋白，还可能影响信号肽的翻译而导致DSPP无法正确定位。令人意外的是，这一位点的变化，不仅造成了牙本质生成不全II型，还导致了携带者患耳聋。这暗示DSPP的变化还与耳聋相关。通过检测DSPP的正常与否，可以诊断耳聋(尤其是牙本质生成不全II型伴耳聋)。
讨论
1、连锁分析与单体型
我们选用了4q21区域7个STR标记对收集的DGI-II家系和DGI-II伴耳聋家系进行了基因分型，连锁分析和构建的单体型表明：DGI-II家系的致病基因与4q21连锁，并在SPP1位点产生最大的Lod值为8.38(θ＝0.00)(表1，图2)；DGI-II伴耳聋家系亦于4q21区域的STR位点连锁，且产生最大的Lod值为2.71(θ＝0.00)(表2，图3)
2、候选基因的突变筛选及测序验证
设计了22个覆盖DSPP基因的引物，对DSPP基因进行突变筛选并测序验证，发现DGI-II家系的致病基因与4q21区域的STR连锁，而DGI-II伴耳聋家系的致病基因亦与4q21区域的STR连锁，而100个正常人无此变化。说明此变化与DGI-II有因果关系。
DPP和DSP是由DSPP编码的单一转录物的表达产物，分裂为两个较小的具有特异性物理化学性质的多肽。DSP、DPP都在牙髓组织中特异性表达，另外，亦有可能在耳蜗组织中表达。DSP富含谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸有众多的磷酸化位点，推测与牙齿的矿化有关。DPP在矿化的作用是双响的。低浓度的DPP可结合于I型胶原纤维的间隙，启动板状磷石晶体的沉积；高浓度的DPP可结合于生长之中的晶体，影响其大小和形状，减缓晶体生长。DSPP基因的突变筛选牙本质生成不全和耳聋的机理有待于进一步的研究。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
文献
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序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：中国科学院上海生物工程研究中心
(ii)发明名称：利用牙本质唾磷蛋白基因及其编码产物诊断和治疗牙本质生成不全II型的方法
(iii)序列数目：2
(2)SEQ ID NO.1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：8201bp
(B)类型：核酸
(C)链性：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(iii)序列描述：SEQ ID NO.1：
attgtcatgc aaaagtccag gacagtgggc cactttcagt cttcaaagag aaagataaga 60
aattctggat tttcaaaatc cttttgaagc cttttaaggt aagatgaaat atccttttta 120
ctcagaacca actgattcat ttagaaagaa ctttgaattt caaagatgaa gccagtttga 180
ttttaagaag cgagtacccc ttaatgatta gattgtatgc ttcctttttg acttgtcata 240
ttgatagtat gtataaaaga taacggacga ttacgaccta aggaagagat agattgggaa 300
gaagaaagac ctcgtactga aaaattggcc aactgaggtg gaaatttgac aattaactat 360
ctgggcactt tgattagttt tgataaaaaa tgagataact cagatttcaa aaatccacct 420
tgggctttca aacaaggctt caattaggct ttgcttttta gtattttatt acttactatt 480
acttattatt tattgtccca catgaaatga aatttagcaa tcactaatga tgccaaatct 540
aattgctaaa tgaaatgaag ctaaatctca tttcattagt aacaataaat gaaataatct 600
gatggagctt cacaaattct gaagtctttg tttcatgctg aggtcacctg ggccattttt 660
attgtagtct tcgaagtcat tcacctgcct tggaaacggt gataaccatc atggaattgt 720
tcaggagtgg agctgaaaga gagatgtagt ggtcagattt ctgaactgta gctcagaaac 780
tggacacgta tcactctggc cttggctgca ggtacctttc cagtatgctg aggctcttcc 840
aaatcacagt gcagacgggc cttctgcaga gctatgtaat gattaggctt gggactgcaa 900
agtacaggat aactgtggct tagtaaacag ctggccttca acatctgtgc cccagagctc 960
tgcatgatac ttgtcctggt gtcacctcag cctcacttga atctatggca tttcagaagg 1020
agctctagct gttcttggct ttctgttgaa cagctataag aatgagcact tttttccctc 1080
tcagtagctc tggaactgtg tcatctctcc tgtgagaaaa cgccagtaat tctcatgaca 1140
gttgatattc agtgaagttt tattatattt tcactaccac cattaaattc aatcaaagcc 1200
attttatgac atgcagcatt ataatctata catctggtgg gagttcatga aataggagta 1260
aaactctcct ttctatcatt acttcaagaa atccaacttg caatataaat taattttttt 1320
actcacacag attataaaat gtctattcca acttatcaga aacatgtttt agaccatttc 1380
tgaatttgaa ttctaacagg gatgaagaat catgatttta gaagtcccat aaaataattg 1440
ctatcattta ttcaaaaatt gcaaagtgcc tgaagcaatg ctagatattg ctgatagtca 1500
taaatattta tcaacaacat tcagaaaacg tttttttctg tgctttgcat tggaatacaa 1560
taatcaccaa gacactctcc tgggcctcag gagcttacag gaaatcaggg caacacataa 1620
gtaactaggc aattttaaac agtgcaatgc gttaccagtg agacgtgcaa acttccttgg 1680
tataaaaagg aaagagatac caaataccct ttgaagtggc gtcagagagg gcgtctcaga 1740
gataattcta ccaaacttca ggataatcct gaggtgcagg tgttgttatt attccaggtg 1800
gagggataat aaacctactt aaatttctca agcttacaca gcaagtagca ggggtaacat 1860
ttgaacccag gtctctgaat acaaaccccg tattctttcc actagcgtag gctccctcat 1920
gttagtaatt tctttctctt aaagtctggt atagctcaat tctatagatt tggagtaagg 1980
atgacaagtg ttttaccttt gaagcacaat ttcagcagaa ttagttagta cttgattaaa 2040
gctattcaga agagaaatag atgtttttac acccaagaat tgcagaagaa caaagttaca 2100
gctatgccct ttgtacctat tatggtgttt tccttcattg gcacaggcag aaaaaaatct 2160
aggaagctac attagtgctg agcctggtga tgtccccata accacaccag gtatgttctg 2220
gaccatcgta tgtcttctcg tgttagatac atgcttcttg tccaggaaaa gggcaaatgc 2280
ttacacatca aaataatata gtactatgat tttcccttta ctttataagt aattttgtgc 2340
tgttcctttt ttatacagcc attgattatt attattccta aagaaaatga agataattac 2400
atatttttgc atttgggcag tagcatgggc cattccagta agtatgcctt tcttagaaaa 2460
cctcttcact ttgttatctt ttttaaccta acattaatac aaaatgtagt gtgtgtgtgt 2520
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgcatgtac atgtgtgtat atatgtgtgt gtgtatatat 2580
gtttccttaa ttttttttaa caggctgagt ctaaacattt agatttgcac taagggcttt 2640
atgtgatatc tgtgaggttt caacaaaacc actccaattc atcgtctcat tcctctatag 2700
aaactcatat ctcgtctgaa ggattattat tatttaaaac atttattcag attaatttac 2760
acttaatgcc cagaagtcat ggagactttg tccatctttg cttcatactc tgtgaatttc 2820
attctaatac gaacaaagtc tgtgctgttt aggaagtttc caagaaagaa taataagaaa 2880
aagtagattt tttttcaaca tataggagac taatttttca ctcagagtta ttatttatgt 2940
gctcactgtg gaaaatttgg aatatatgac gaaaaccaat aaaaaattga gaaaattcaa 3000
ccatttataa ttttactagc cagccatcat gtttaacatt ttcatatgct ttcataatac 3060
caaacatttg gtatttatgt agttgaaaat gttctcaagt atttcaaatg tgctcttgca 3120
gagcacagaa gtatactagc gtaatacttg attttgcttc tgtgcaggct ctggtcacgc 3180
ctcctgttct cttaagagtt ttcatcagga ttacacttag agcgggtttg tgctagtgca 3240
agaggctttt tgtagagaaa caccagaggt ctatcccctc gtctttctac aagactcttt 3300
ccttctacag ttgagataag tgggctgatc taacacgtcc ataaaattgg taataccaca 3360
gtgaaaaata tccatgtacc cagtttaaat tctacacaag ccctgtaaga agccacttct 3420
cttttctatc tgattagatc atactttggc ctttgtgtta aacctttctt cttcatggag 3480
ggaagaatat ttgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgcacgctc acacacatat tcacaaataa 3540
gaaccttttc aatagccagt attttctact tggcaggttc ctcaaagcaa accactggag 3600
agacatgtcg aaaaatccat gaatttgcat ctcctagcaa gatcaaatgt gtcagtacag 3660
gtataggatg taatatattt cattttattt cctatttctg agttgctaca ttccattaac 3720
ttctccaaga ttgcaatttg ctttccttca agatcattga cactcataat tgattgaatt 3780
gtttcttttt caggatgagt taaatgccag tggaaccatc aaagaaagtg gtgtcctggt 3840
gcatgaaggt gatagaggaa ggcaagagaa tacccaagat ggtcacaagg gagaagggaa 3900
tggctctaag tgggcagaag taggagggaa gagtttttct acatattcca cattagcaaa 3960
cgaagagggg aatattgagg gctggaatgg ggacacagga aaagcagaaa catatggtca 4020
tgatggaata catgggaaag aagaaaacat cacagcaaat ggcatccagg gacaagtaag 4080
catcattgac aatgctggag ccacaaacag aagcaacact aatggaaata ctgataagaa 4140
tacccaaaat ggggatgttg gcgatgcagg tcacaatgag gatgtcgctg ttgtccaaga 4200
agatggacct caagtagctg gaagcaataa cagtacagac aatgaggatg aaataattga 4260
gaattcctgt agaaacgagg gtaatacaag tgaaataaca cctcagatca acagcaagag 4320
aaatgggact aaggaagctg aggtaacacc aggcactgga gaagatgctg gcctggataa 4380
ttccgatggg agtcctagtg ggaatggagc agatgaggat gaagacgagg gttctggtga 4440
tgatgaagat gaagaagcag ggaatggaaa agacagtagt aataacagca agggccagga 4500
gggccaggac catgggaaag aagatgatca tgatagtagc ataggtcaaa attcggatag 4560
taaagaatat tatgaccctg aaggcaaaga agatccccat aatgaagttg atggagacaa 4620
gacctccaag agtgaggaga attctgctgg tattccagaa gacaatggca gccaaagaat 4680
agaggacacc cagaagctca accatagaga aagcaaacgc gtagaaaata gaatcaccaa 4740
agaatcagag acacatgctg ttgggaagag ccaagataag gttagtttgt aaagctgatt 4800
tctttcaatg gcagtttaaa ttcttcccct ccatctattg atgctagcac aaaaataaac 4860
catgacaagc atccatgtat ttttgtatcc atattacttg actatttaag gaaatctaga 4920
gtccttacta gacttcgaga tagaacaact ttaaacatct tacatttctg ataacttagt 4980
tataattcta gaaaagtctt atgtgaaatc atggatcccc atgtaattgt ttacaaaagt 5040
tcctactggg taggaatgtg gatgaatttt taaggaatct aagcaccagg atgctttcaa 5100
ttacagaata aagcacattt tcacaaataa ctgtgaagta ctagaaatgt aactcctatc 5160
cctatggcaa cttttcccag ttattcttcc tcagatcaat gcaattttgc agcaaatatt 5220
cactagttaa tcattctttc ctccatcctt ccatagggaa tagaaatcaa gggtcccagc 5280
agtggcaaca gaaatattac caaagaagtt gggaaaggca acgaaggtaa agaggataaa 5340
ggacaacatg gaatgatctt gggcaaaggc aatgtcaaga cacaaggaga ggttgtcaac 5400
atagaaggac ctggccaaaa atcagaacca ggaaataaag ttggacacag caatacaggt 5460
agtgacagca atagtgatgg atatgacagt tatgattttg atgataagtc catgcaagga 5520
gatgatccca atagcagtga tgaatctaat ggcaatgatg atgctaattc agaaagtgac 5580
aataacagca gtagccgagg agatgcttct tataactctg atgaatcaaa agataatggc 5640
aatggcagtg actcaaaagg agcagaagat gatgacagtg atagcacatc agacactaat 5700
aatagtgaca gtaatggcaa tggtaacaat gggaatgatg acaatgacaa atcagacagt 5760
ggcaaaggta aatcagatag cagtgacagt gatagtagtg atagcagcaa tagcagtgat 5820
agtagtgaca gcagtgacag tgacagcagt gatagcaaca gtagcagtga tagtgacagc 5880
agtgacagtg acagcagtga tagcagtgac agtgatagta gtgatagcag caatagcagt 5940
gacagtagtg acagcagtga tagcagtgac agtagtgata gtagtgacag cagtgacagc 6000
aagtcagaca gcagcaaatc agagagcgac agcagtgata gtgacagtaa gtcagacagc 6060
agtgacagca acagcagtga cagtagtgac aacagtgata gcagcgacag cagcaatagc 6120
agtaacagca gtgatagtag tgacagcagt gatagcagtg acagcagcag tagcagtgac 6180
agcagcagta gcagtgacag cagcaacagc agtgatagta gtgacagtag tgacagcagc 6240
aatagcagtg agagcagtga tagtagtgac agcagtgata gtgacagcag tgatagtagt 6300
gacagcagta atagtaacag cagcgatagt gacagcagca acagcagcga tagcagtgac 6360
agcagtgata gcagtgacag cagcaacagc agtgacagta gcgatagcag tgacagcagc 6420
aacagcagtg acagcagtga tagcagtgac agcagtgata gtagtgacag cagcaacagc 6480
agtgatagca acgacagcag caatagcagt gacagcagtg atagcagcaa cagcagtgat 6540
agcagcaaca gcagtgatag cagtgatagc agtgacagca gtgatagcga cagcagcaat 6600
agcagtgaca gcagtaatag tagtgacagc agcgatagca gcaacagcag tgatagcagc 6660
gacagcagcg atagcagtga cagcagtgat agcgacagca gcaatagaag tgacagtagt 6720
aatagtagtg acagcagcga tagcagtgac agcagcaaca gcagtgacag cagtgatagt 6780
agtgacagca gtgacagcaa cgaaagcagc aatagcagtg acagcagtga tagcagcaac 6840
agcagtgata gtgacagcag tgatagcagc aacagcagtg acagcagtga tagcagcaac 6900
agcagtgata gcagtgaaag cagtaatagt agtgacaaca gcaatagcag tgacagcagc 6960
aacagcagtg acagcagtga tagcagtgac agcagtaata gtagtgacag cagcaatagc 7020
ggtgacagca gcaacagcag tgacagcagt gatagcaata gcagcgacag cagtgacagc 7080
agcaacagca gcgatagcag tgacagcagt gatagcagtg acagcagtga cagcagtgat 7140
agcagcaaca gcagtgatag cagtgacagc agtgacagca gtgatagcag taatagtagt 7200
gacagcagca acagcagtga cagcagcgat agcagtgaca gcagcgatag cagtgacagc 7260
agtgacagca gcaatagcag tgacagcagt gacagcagcg acagcagtga tagcagtgac 7320
agcagtggca gcagcgacag cagtgatagc agtgacagca gtgatagcag cgatagcagt 7380
gacagcagcg acagcagtga cagcagtgac agcagtgaaa gcagcgacag cagcgatagc 7440
agcgacagca gtgacagcag cgacagcagt gacagcagcg atagcagcga cagcagcgac 7500
agcagcgata gcagtgacag cagcaatagc agtgatagca gcgacagcag tgatagcagt 7560
gacagcagcg acagcagcga tagcagcgac agcagtgata gtagtgatag cagtgacagc 7620
agtgacagca gcgacagcag tgacagcagc gacagcagtg acagcagcga cagcagtgac 7680
agcaatgaaa gcagcgacag cagtgacagc agcgatagca gtgacagcag caacagcagt 7740
gacagcagcg acagcagtga tagcagtgac agcacatctg acagcaatga tgagagtgac 7800
agccagagca agtctggtaa cggtaacaac aatggaagtg acagtgacag tgacagtgaa 7860
ggcagtgaca gtaaccactc aaccagtgat gattagaaca aaagaaaaac ccataagatt 7920
ccttttgtga aaagtttggt aatgggatag gaaaaaaaga tttccaagaa agtaaagaaa 7980
ggggagaaat aaacataaga cgtatgtaaa caaaaacaac tgggggaatc aaatcaaaca 8040
gttggattca gaaccaagac ctaactcctg cagagacaga ctctgaatgc atgacctttg 8100
gtacatgcct gttaatattc atgttctgaa aatattttgt taaaagtgta aatctaaaca 8160
taaaagaaca attaaaatat tctttaatac ttcacacaga a 8201
(2)SEQ ID NO.2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：1253个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：多肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO.2：
MKIITYFCIW AVAWAIPVPQ SKPLERHVEK SMNLHLLARS NVSVQDELNA SGTIKESGVL 60
VHEGDRGRQE NTQDGHKGEG NGSKWAEVGG KSFSTYSTLA NEEGNIEGWN GDTGKAETYG 120
HDGIHGKEEN ITANGIQGQV SIIDNAGATN RSNTNGNTDK NTQNGDVGDA GHNEDVAVVQ 180
EDGPQVAGSN NSTDNEDEII ENSCRNEGNT SEITPQINSK RNGTKEAEVT PGTGEDAGLD 240
NSDGSPSGNG ADEDEDEGSG DDEDEEAGNG KDSSNNSKGQ EGQDHGKEDD HDSSIGQNSD 300
SKEYYDPEGK EDPHNEVDGD KTSKSEENSA GIPEDNGSQR IEDTQKLNHR ESKRVENRIT 360
KESETHAVGK SQDKGIEIKG PSSGNRNITK EVGKGNEGKE DKGQHGMILG KGNVKTQGEV 420
VNIEGPGQKS EPGNKVGHSN TGSDSNSDGY DSYDFDDKSM QGDDPNSSDE SNGNDDANSE 480
SDNNSSSRGD ASYNSDESKD NGNGSDSKGA EDDDSDSTSD TNNSDSNGNG NNGNDDNDKS 540
DSGKGKSDSS DSDSSDSSNS SDSSDSSDSD SSDSNSSSDS DSSDSDSSDS SDSDSSDSSN 600
SSDSSDSSDS SDSSDSSDSS DSKSDSSKSE SDSSDSDSKS DSSDSNSSDS SDNSDSSDSS 660
NSSNSSDSSD SSDSSDSSSS SDSSSSSDSS NSSDSSDSSD SSNSSESSDS SDSSDSDSSD 720
SSDSSNSNSS DSDSSNSSDS SDSSDSSDSS NSSDSSDSSD SSNSSDSSDS SDSSDSSDSS 780
NSSDSNDSSN SSDSSDSSNS SDSSNSSDSS DSSDSSDSDS SNSSDSSNSS DSSDSSNSSD 840
SSDSSDSSDS SDSDSSNRSD SSNSSDSSDS SDSSNSSDSS DSSDSSDSNE SSNSSDSSDS 900
SNSSDSDSSD SSNSSDSSDS SNSSDSSESS NSSDNSNSSD SSNSSDSSDS SDSSNSSDSS 960
NSGDSSNSSD SSDSNSSDSS DSSNSSDSSD SSDSSDSSDS SDSSNSSDSS DSSDSSDSSN 1020
SSDSSNSSDS SDSSDSSDSS DSSDSSNSSD SSDSSDSSDS SDSSGSSDSS DSSDSSDSSD 1080
SSDSSDSSDS SDSSESSDSS DSSDSSDSSD SSDSSDSSDS SDSSDSSDSS NSSDSSDSSD 1140
SSDSSDSSDS SDSSDSSDSS DSSDSSDSSD SSDSSDSSDS SDSNESSDSS DSSDSSDSSN 1200
SSDSSDSSDS SDSTSDSNDE SDSQSKSGNG NNNGSDSDSD SEGSDSNHST SDD 1253
机译： 利用牙本质唾液磷蛋白基因及其编码产物诊断和治疗Ⅱ型牙本质生成不全的方法
机译： 利用牙本质唾液磷蛋白（dspp）基因及其编码产物诊断和治疗Ⅱ型牙本质生成不全的方法
机译： 牙本质唾液磷蛋白（DSPP）基因及其编码产物诊断和治疗II型牙本质不全的方法
