表达用于自动水解纤维素成分的纤维素酶的转基因植物和产生可溶的糖的方法

摘要

本发明涉及用于通过自动水解机制产生纤维素的转基因植物，和应用它们生产可溶糖类的方法，更具体地，涉及用编码纤维素酶、纤维素结合结构域和叶绿体靶向肽的重组cDNA转化的转基因植物，和应用它们生产可溶糖类的方法。转基因植物和应用它们生产可溶糖类的方法将是大规模生产可溶糖类的高度节约的系统。

说明书

技术领域

本发明涉及表达用于自动水解纤维素成分的纤维素酶的转基因植物，和应用其产生可溶的糖的方法，更具体地，通过用编码纤维素酶、纤维素结合结构域和叶绿体靶向肽的重组cDNA转染植物而产生的转基因植物，和通过自动水解所述转基因植物的纤维素而产生可溶的糖的方法。

背景技术

植物生物质是地球上最丰富的、天然的和可再生的资源。纤维素是植物细胞壁的主要组成成分，并且是一种重要的商业原料，其可以通过适当的方法而转化成为有用的产品(Hon DN Cellulose：a random walk along itshistorical path，In Cellulose.J.C.Roberts(ed.)，Chapman&Hall，1-25，1994)。一种这样的应用是从纤维素产生可发酵的糖类，用于生产生物燃料乙醇。由于这种方法的潜在的高度重要性，纤维素-降解酶已经受到了广泛的关注(Beltrane PL等.，Bioresource Technol.39：165-171，1992)。到目前，植物纤维素转化成为可发酵的糖类应用通过大规模发酵产生的商业酶而实现。然而，产生这些酶的成本仍然是广泛应用这种方法的显著障碍(CowanD，Tibtech.14：177-178，1996；Ho NW等.，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65：163-192，1999)。因此，已经采取了许多方法来大规模并且以低成本生产纤维素-降解酶(Goddijin OJM和Pen J，Trends biotechnol.13：3790-3870，1995；Gidding G等.，Nature Biotech.18：1151-1155，2000)。对于纤维素酶的生产，Trichoderma reesei已经成为一种靶点菌株，并且杆状菌(Bacillus)和曲霉菌(Aspergillus)微生物成为生产木聚糖酶的靶点。但是，这样的酶的浓度和活性不足以用于工业中。高的生产成本也是一个问题，其由高价的纯化介质产生，所述介质含有昂贵的物质，诸如乳糖，作为用于生产所述酶的底物。

由于大量的酶可以用最小的投入而产生，所以遗传工程转基因植物是一种用于大规模产生工业和医药应用的重组蛋白的最经济的系统。在尝试降低纤维素酶的生产成本中(Jensen LG等.，Proc.Natl.Acad.Sci.93：3487-3491，1996；Kawazu T等.，J.Ferment.Bioeng.82：205-209，1996；Nuutila AM等.，Plant Mol.Biol.41：777-783，1999；Ziegelhoffer T等.，Mol.Breed.5：309-318，1999；Dai Z等.，Transgenic Res.9：43-54，2000)，已经将纤维素酶基因在转基因植物中表达，但是获得的表达水平很低。对在植物中表达的重组纤维素酶的纯化也是费用浩大的步骤，其极大地组成了从纤维素生产发酵的糖类的成本。

因此，本发明人生产转基因植物，其中插入了含有纤维素酶基因、纤维素结合结构域基因和叶绿体靶向基因的重组基因。并且，本发明人通过证实在转基因植物自身中应用位于叶绿体的纤维素通过自动水解而将纤维素转化成为可发酵的糖是可能的，而完成本发明，并且生产成本也通过简化从纤维素到可溶糖的生产线而降低了。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是提供转基因植物和通过所述植物的自动水解以低成本从纤维素生产可溶的发酵糖类的方法，所述转基因植物通过在植物中插入编码纤维素酶、纤维素结合结构域和叶绿体靶向肽的重组cDNA而产生。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供转染了编码纤维素酶、纤维素结合结构域和叶绿体靶向肽的cDNA的转基因植物。

本发明还提供用于在具有纤维素自动水解活性的转基因植物中从纤维素生产可溶的糖的方法。

在下文中，将详细地描述本发明。

本发明提供用于植物转化的表达载体，其在植物中表达，并且含有编码纤维素酶、纤维素结合结构域和叶绿体靶向肽的重组cDNA。

上述表达载体可以设计成表达内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(exoglucanase)、或同时表达内切-和外切葡聚糖酶，并且上述纤维素基因是非植物源性的基因，优选地源于微生物，并且更优选地源于白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)(Cel5纤维素酶基因)。Cel5纤维素酶是一种具有非常强的针对可溶的纤维素底物的活性的纤维素酶。

将纤维素结合结构域融合到Cel5的的C端增加了其对细胞壁上的纤维素的亲和力，这导致纤维素酶活性的增加。在本发明的优选实施方案中，应用了源于粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)的木聚糖酶A的CBM6基因。

另外，可以将参与靶向特异细胞的序列融合到Cel5 N端。上述用于靶向的序列可以是用于在转基因植物中表达的异源蛋白的毒性的解决办法(solution)。在本发明的一个优选实施方案中，将核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)小亚基的N端转运肽(RbcS(tp))融合到Cel5:CBM6的N端，用于在转基因植物中表达的纤维素酶迁移到叶绿体内。

在本发明的一个优选实施方案中，由SEQ.ID.No1代表的编码纤维素酶、纤维素结合结构域和叶绿体靶向肽的重组cDNA，可以被融合到在植物中活化的启动子上，并且可以被融合到紫花苜蓿核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基启动子RbcSK-1A上(Khoudi等.，Gene 197：343-351，1997)。

本发明提供一种用于植物转化的包含上述重组基因的表达载体，更具体的，本发明提供pHB-Cel5:CBM6载体，其被设计成通过应用pCambia2300在RbcSK-1A启动子控制下表达RbcS(tp):Cel5:CBM6。

本发明提供具有纤维素自动水解活性的转基因植物。

本发明提供一种新型转基因植物，其通过用含有SEQ.ID.No1代表的重组cDNA的pHB-Cel5:CBM6表达载体转染烟草细胞而产生。

为了产生所述转基因植物，将根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA-4404用重组的表达载体pHB-Cel5:CBM6转染，形成用作产生表达RbcS(tp):Cel5:CBM6的转移植物的介体的转化子，并且本发明人于2004年6月28日将该转化子保藏在韩国生物科学和生物技术研究所(KoreaResearch Institute of Bioscience and Biotechnology)的韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures，KCTC)(呆藏号：KCTC10834BP)。

在本发明的表达RbcS(tp):Cel5:CBM6的转基因植物的实施方案中，通过应用根癌农杆菌LBA4404进行叶片转化，将重组基因插入到烟草叶片中，并且将所述细胞在植物生长条件下培养，形成转基因烟草(Harsch等.，Science 227：1229-1231，1985)。

本发明还提供产生表达自动水解的纤维素酶的转基因植物的方法。

本发明用于产生转基因植物的方法包括步骤：i)构建携带编码RbcS(tp):Cel5:CBM6的基因的植物表达载体；ii)应用转染了i)的植物表达载体的重组微生物转染植物细胞，以在植物细胞中表达RbcS(tp):Cel5:CBM6；和iii)在植物生长条件下培养ii)的植物细胞。

在本发明的一个优选实施方案中，将根癌农杆菌LBA4404(保藏号：KCTC 10834BP)用作上述ii)的转基因重组微生物，并且将烟草或双子叶植物用作本发明的植物。

本发明人观察已长成的转基因植物的表型，以研究具有纤维素自动水解活性的转基因烟草植物是否受到引入的纤维素酶基因的毒性的影响。结果，其中只将Cel5:CBM6基因引入细胞质的转基因植物具有严重的生长缺陷。然而，携带包含纤维素酶、纤维素结合结构域和叶绿体靶向基因的重组基因RbcS(tp):Cel5:CBM6的转基因植物没有表现出任何明显的形态变化(见图1B)。上述结果表明，在转基因植物中表达的纤维素酶没有停留在细胞质中，而是通过叶绿体靶向基因序列而导向叶绿体。

本发明的转基因植物通过在叶绿体中积累纤维素酶而具有针对其自身细胞壁的纤维素的自动水解活性。

特别地，当将转基因烟草植物的叶或茎组织匀浆在最理想条件下培养时，定位在叶绿体的Cel5:CBM6在降解细胞壁中的纤维素中是高度有效的，无需任何多余的步骤，这导致全部不溶的纤维素有12％转化成为可溶的糖。当外加在大肠杆菌(E.coli)中表达和纯化并且由纤维素酶和纤维素结合结构域组成的重组蛋白时，其中的自动水解活性几乎与本发明的转基因植物中的活性相同(见图3)。

本发明还提供应用具有纤维素自动水解活性的转基因植物从纤维素生成可溶的糖的方法。

本发明应用转基因植物生产可溶的糖的方法包括下列步骤：i)获得转基因植物的叶或茎的匀浆；ii)培养上述步骤i)的匀浆物，以诱导纤维素的自动水解；和iii)分离并且纯化自动水解的可溶的糖类。

由于对于外加的重组纤维素酶的表达和纯化步骤是不需要的，所以，本发明方法的应用通过简化生产线而减少了生产成本。

在本发明的可溶的糖的生产方法中，通过向步骤i)的匀浆物中添加外源表达和纯化的外切葡聚糖酶，全部不溶的纤维素有40％作为可溶的糖而被释放出来。

上述结果表明，引入设计成共表达外切葡聚糖酶以及内切葡聚糖酶的重组基因增加了可溶的糖的大规模生产，而不需要处理外源制备的外切葡聚糖酶的额外步骤。

附图描述

图1A是显示插入到本发明的转基因植物中的重组DNA构建体的示意图。

tp：叶绿体靶向基因

Cel5：内切-β-1，4，-葡聚糖酶(纤维素酶)

CBM：纤维素结合模块

图1B是显示转基因植物的生长的一系列照片，所述转基因植物分别转染了基本载体(a)，本发明的重组基因RbcS(tp):Cel5:CBM6(b)，和没有叶绿体靶向基因的重组基因Cel5:CBM(c)，

图2A是显示蛋白提取物的酶活性的图表，所述蛋白提取物分别从转染了基本载体的对照植物叶片、和分别转染了RbcS(tp):Cel5:CBM6和Cel5:CBM6重组基因的转基因植物Tb54(F)和Tb54而制备。图2B是显示插入到转基因植物中的基因的定位的一系列照片，其通过将转基因植物叶片片段的横切面用抗纤维素酶(Cel5)抗体作为一级抗体和FITC-缀合的抗兔IgG作为二级抗体(绿色)进行处理而显示(叶绿体的定位通过叶绿素的自发荧光图像(红色)而确定)。

a：用基本载体转染

b：用RbcS(tp):Cel5:CBM6转染

c：用RbcS(tp):Cel5转染

图3是显示RbcS(tp):Cel5:CBM6纤维素酶自动水解活性的研究结果的一系列图表。将从转基因烟草叶片获得的细胞提取物单独与烟草茎的细胞壁级分反应(A)，或与外源外切葡聚糖酶Cel6B(外切-β-1，4葡聚糖酶)一起反应(B)，之后通过DNS方法进行糖还原端的定量，

●：携带RbcS(tp):Cel5的转基因植物的叶片提取物

○：携带空载体的转基因植物的叶片提取物

■：携带RbcS(tp):Cel5:CBM6的转基因植物的叶片提取物

□：加入在大肠杆菌中表达和纯化的Cel5:CBM6

▲：单独的外源Cel6B

△：表达RbcS(tp):Cel5:CBM6+外源Cel6B的转基因植物叶片提取物

图4是显示通过RbcS(tp):Cel5:CBM6释放出来的可溶的糖的HPLC分析的结果的图表。细胞壁的纤维素成分被内源表达的RbcS(tp):Cel5:CBM6水解。72hr温育后，应用REZEX RSO寡糖柱对可溶的糖进行分析。

图5是显示自动水解后细胞壁残余物质的FTIR分析结果的图表。将细胞壁的纤维素成分用RbcS(tp):Cel5:CBM6水解，并且用FTIR进行分析。

粉色线：自动水解前

黑色线：自动水解后

最佳模式

本发明的实用和目前优选的实施方案是举例说明性的，如在下述实施例中所示。

然而，应该理解，本领域的技术人员，考虑到本公开内容，可以进行属于本发明的精神和范围内的修改和改进。

<实施例1>产生具有纤维素自动水解活性的转基因植物

<1-1>构建用于植物转化的表达载体

本发明人构建了携带纤维素酶、纤维素结合结构域和叶绿体靶向肽基因的表达载体，以产生转基因烟草植物，所述转基因烟草植物含有能够水解它们自身细胞壁的纤维素的纤维素酶。

特别地，将具有针对可溶的纤维素底物的强活性的白色瘤胃球菌的Cel5基因和CBM6融合，所述CBM6是纤维素结合结构域基因，已知其增强对细胞壁的纤维素的亲和力，形成重组基因Cel5:CBM6。应用pRA11和pCsCBD作为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增重组基因Cel5:CBM6，之后插入到T/A克隆载体中(Karita等.，Ferment.Bioeng.76：439-444，1993；Karita等.，Ferment.Bioeng.84：354-357，1997)。

pRA11和pCsCBD由Dr.Karita(生物科学系，Mie University，Tsu 514，Japan)提供。进行PCR，94℃/15秒，55℃/30秒，和72℃/1分钟，30个循环。

限制性酶处理后，将含有Cel5和Cel5:CBM6基因的DNA片段从上述载体分离，之后亚克隆到pKitmus54。应用质粒pRA11和pCsCBD2(Karita S.等.，J.Ferment.Bioeng.76，439-444，1993；Karita等.，J.Ferment.Bioeng.84，354-357，1997)作为模板，将含有白色瘤胃球菌(R.albus)基因(eglV)及其修饰的译本(eglV-CBDII)的DNA片段通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。将扩增的PCR片段克隆到T/A克隆载体中。将含有eglV的重组质粒用SacI/XbaI消化，并且将含有eglV-CBDII的重组质粒用SacI/SphI消化。将得到的插入片段分别与pKitmus 54和pKitmus 61缀合。将第一个构建体(pKitmus-54)融合到1.828kb大小的紫花苜蓿核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基(RbcSK-1A)启动子区和在翻译过程中的3’非编码序列。启动子区包括5’非编码靶向序列和叶绿体靶向肽的前9个氨基酸。第二个构建体(pKitmus-61)也包含RbcKS-1A启动子和3’非编码序列，但是它不包含转运肽(图1)。将重组质粒pKitmus-54和pKitmus-61用SalI和SmaI消化，并且将得到的含有启动子和3’非编码区的插入片段eglV和eglV-CBDII亚克隆到植物转化载体pCambia2300(Cambia，Canberra，Australia)的相对应的区域。将重组载体命名为pHB54和pHB61。

得到的构建体pHB54是这样的一种重组载体，即，其在紫花苜蓿的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基启动子的控制下，得到具有来自核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基的N端转运肽RbcS(tp)的翻译融合蛋白。

最后，将Cel5，Cel5:CBM6，RbcS(tp):Cel5和RbcS(tp):Cel5:CBM6与它们的启动子一起亚克隆到植物转化载体pCambia2300(Cambia，Canberra，Australia)，得到构建重组载体pHB54(F)，pHB54，pHB61(F)和pHB61(图1A)。

<1-2>产生转基因烟草

通过应用叶片转化方法(Horsch R.B.等.，Science 227：1229-1231，1985)，将在上述实施例<1-1>中构建的表达载体插入到根癌农杆菌LBA-4404中，本发明人制备了转基因烟草。

首先，将根癌农杆菌LBA-4404通过电穿孔用上述重组表达载体转染。并且将转化的细胞分布到含有10μg/ml卡那霉素和5tg/ml四环素的LB琼脂平板上，然后将其在28℃培养2天。选择转化子，将其于2004年6月28日保藏在韩国生物科学和生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC 10834BP)。

将Nicotiana bentamiana的叶片与上述根癌农杆菌LBA-4404一起培养，之后培养2天，以将包含在重组载体中的纤维素酶基因插入到烟草叶细胞的染色体内。将转化的叶片转移到MS选择培养基上(补充了0.5ml/l牛白蛋白，Murashige-Skoog盐，3％蔗糖，100mg/l卡那霉素，250mg/lpseudopen和0.8％琼脂)，以诱导胼胝体形成。将生成的胼胝体生长1个月，并且然后将再生的茎移植到含有等量的蛭石、珍珠岩和泥炭藓的苗床上，其后在16小时日长的条件下在26℃培养箱中继续培养，以长成转基因烟草植物。

本发明人研究了长成的转基因烟草植物的表型，以检验转基因植物的生长。结果，在细胞质中表达Cel5:CBM6的转基因烟草植物具有严重的生长缺陷。相反，表达RbcS(tp):Cel5；CBM6的转基因植物没有表现出任何明显的形态学改变(见图1B)。

上述结果表明，在转基因烟草植物中表达的重组蛋白通过叶绿体靶向肽RbcS(tp)而导向叶绿体，防止了可能由重组蛋白在转基因植物中引起的毒性。

<实施例2>在转基因烟草植物中表达纤维素酶并且确定纤维素酶活性

<2-1>研究重组的纤维素酶在转基因烟草植物中的表达

为了确定重组纤维素酶是否能够在转基因烟草植物中正常表达，从50株独立的表达RbcS(tp):Cel5:CBM6的转基因植物获得总RNA和总蛋白提取物，并且然后进行RNA印迹和蛋白质印迹。

结果，尽管表达水平在转基因株系中不同，在叶绿体或在胞质中观察到所插入的纤维素酶基因的表达。Tb54(F)-14和Tb54-8，分别表达RbcS(tp):Cel5；CBM6和RbcS(tp):Cel5重组蛋白，选来量化在叶绿体中的纤维素酶蛋白。在Tb54(F)-14叶绿体中的纤维素酶蛋白的量为总可溶蛋白的0.38％，和在Tb54-8中，为总可溶蛋白的0.22％。

<2-2>重组纤维素酶在转基因烟草植物中的定位

通过应用抗纤维素酶(抗-Cel5)抗体进行免疫定位，以确定重组纤维素酶在转基因烟草植物中的定位。

按照标准方法，将叶片样品用在100mM卡可酸盐缓冲液(pH7.2)中的4％甲醛固定24小时，在相同的缓冲液中洗涤，在乙醇系列中脱水，并且包埋在石蜡中。将切片(7μm)脱蜡，再水化，并且用由10mM PBS缓冲液中的5％脱脂干奶粉组成的blotto封闭溶液处理15分钟。随后，去除多余的液体后，将在2％blotto中的抗纤维素(Cel5)抗体铺于切片上。在高湿度培养箱中进行4℃过夜培养。然后，将载玻片用含有0.5％吐温20的PBS缓冲液洗涤，并且将100μl FITC-缀合的抗兔IgG(Sigma)铺于所述切片上。将载玻片在室温温育2小时，用PBS缓冲液和蒸馏水洗涤，并且用DABCO抗褪色溶液进行封固。使用Zeiss Axiophot显微镜捕获图像(Johnson等.，Gene Anal.Techniques 1：3-8，1984)。对于共聚焦显微镜，将切片在ZeissLSM 310显微镜下镜检。488nm氩激光器和515-565nm发射频带透过性滤光片用来显现FITC-缀合的抗体，并且543nm HeNe激光谱线和590nm发射高透过性滤光片用来显现叶绿素的自发荧光。

结果，从转基因植物获得的叶片细胞的叶绿体检测到强烈的荧光信号，而对照非转基因植物没有表现出任何显著的信号(图2B)。

<2-3>转基因烟草植物中的纤维素酶活性

应用羧甲基纤维素(CMC)作为从完全长成的烟草植物叶片获得的蛋白提取物的底物，确定在表达在转基因烟草植物中的纤维素酶活性。特别地，用CMC作为底物的纤维素酶活性这样测定，即，与样品在37℃温育5分钟后，测定在0.1M磷酸缓冲液(pH 6.8)中的1％(w/c)CMC溶液的粘度的减少。1个单位的酶活性定义为1min减少1厘泊的CMC溶液粘度所需要的酶的用量。

如在图2A中所示，与从携带没有纤维素酶基因的载体的转基因植物获得的蛋白提取物相比较，转基因植物的总蛋白提取物表现出强纤维素酶活性。从表达RbcS(tp):Cel5:CBM6的转基因植物获得的蛋白提取物表现出比表达RbcS(tp):Cel5的那些转基因植物略高的纤维素酶活性。

<实施例3>纤维素在转基因烟草植物中的自动水解

<3-1>测定在转基因烟草植物中表达的RbcS(tp):Cel5:CBM6的自动水解活性

本发明人进行了下述实验，以检验在转基因烟草植物中表达的纤维素酶是否能够在细胞裂解后水解细胞壁的纤维素。

纯化在大肠杆菌中表达的Cel5:CBM6，用于确定活性，并且确定在转基因植物中表达未经纯化的纤维素酶的活性。为了制备转基因烟草植物叶片组织的粗提取物，将lg叶片组织在5ml蛋白提取缓冲液(100mM磷酸缓冲液，pH 6.8)中，用海沙将1g叶片组织碾磨至匀浆。应用两种不同的底物，羧甲基纤维素(CMC)和植物茎不溶的细胞壁成分，确定纤维素酶的活性。用CMC作为底物的纤维素酶的活性用同实施例<2-3>中所述相同的方法进行测定，即，与样品在37℃温育5分钟后，通过测定在0.1M磷酸缓冲液(pH 6.8)中的1％(W/V)CMC溶液的粘度减少而测定纤维素酶活性。1个单位的酶活性定义为1min减少1厘泊的CMC溶液粘度所需要的酶的用量。

应用在液氮中碾磨的0.2g茎，并且在5ml叶片提取液中在40℃温育65小时，而测定用细胞壁成分作为底物的纤维素酶活性。在有规律的时间间隔将样品取出。应用葡萄糖作为标准，通过DNS方法确定从所述培养的混合物中释放的还原糖的量(Miller，G.L.等，Anal Biochem.1：127-132，1960)。

结果，含有RbcS(tp):Cel5:CBM6的Tb54(F)-14的粗提取物，从转基因植物的不溶细胞壁级分产生大量的可溶糖(图3A)。从反应混合物得到的不溶级分的化学分析表明，细胞壁级分总不溶的纤维素成分大约有12％被作为可溶糖而释放。相反，从Tb54-8或非转基因植物得到的蛋白提取物表现出对于所述细胞壁级分的可以忽略的活性。

本发明人比较RbcS(tp):Cel5:CBM6的水解活性与额外添加的Cel5:CBM6水解活性。结果，当将在大肠杆菌中表达和纯化的Cel5:CBM6添加到细胞壁级分中时，释放的可溶糖的量几乎与用等量的RbcS(tp):Cel5:CBM6获得的可溶糖的量相等。

由于Cel5:CBM6是一种内切葡聚糖酶，其只能在内部消化纤维素，所以释放的可溶糖的量可能不是精确地反映RbcS(tp):Cel5:CBM6的活性水平。可溶糖只是通过内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的协同作用而有效地释放。因此，本发明人检验了在存在外源添加的外切葡聚糖酶时，由RbcS(tp):Cel5:CBM6释放的可溶糖的效率。在本发明中，应用从Thermobifidus fusca纯化的外切葡聚糖酶Cel6B，一种β-1，4-葡聚糖纤维素二糖水解酶。

结果，当将Cel6B添加到含有RbcS(tp):Cel5:CBM6的自动水解反应混合物中时，与由外切葡聚糖酶Cel6B单独释放的量相比，释放的可溶糖的量极大地增加了。残余的不溶级分的化学分析表明，总不溶的纤维素的大约40％作为可溶糖释放。上述结果表明，RbcS(tp):Cel5:CBM6可以从可作为外切葡聚糖酶底物的细胞壁产生大量的长聚合的寡糖。

<3-2>分析由RbcS(tp):Cel5:CBM6转化的可溶糖

本发明人分析了释放的糖化合物，以更好地理解在上述实施例<3-1>中公开的自动水解的机制。

具体地，将从转基因Tb54(F)-14获得的蛋白提取物与细胞壁级分一起温育72小时，并且通过凝胶过滤将糖分子与未消化的物质分离。应用REZEX RSO寡糖柱(Phenomenex Inc.)，通过HPLC(Millipore Waters 600E)分析液体级分。流速0.3ml/min的水用作洗脱溶剂。纯的纤维素-寡糖(1％w/v，在10mM磷酸缓冲液中(Seikagaku Corporation，Japan))，诸如葡萄糖(G1)、纤维二糖(G2)、纤维三糖(G3)、纤维四糖(G4)、纤维五糖(G5)、和纤维六糖(G6)，用作标准。

结果，如图4所示，自动水解的分解产物主要是长聚合寡糖以及少量的葡萄糖(图4)。

由于RbcS(tp):Cel5:CBM6是内切葡聚糖酶，所以预计到这种类型的水解活性。寡糖链比纤维六糖更长，但是当增加温育时间时，寡糖链的长度被减小。

应用FTIR(Fourier Transform Infrared Spectroscopy，傅立叶变换红外光谱)，还分析了自动水解后获得的残余细胞壁级分。具体地，应用Bio-RadFTIR(FTS 175C)光谱计，对KBr小粒(在300mg KBr中的1mg转基因烟草综纤维素)采用IR光谱(Kacurakova等.，Carbohydr.Res.337：1145-1153，2002)。用醇-苯提取方法(Goering，H.K.等.，AgricultureHandbook，379，1970)，确定植物纤维素含量。

结果，对照和RbcS(tp):Cel5:CBM6-处理的细胞壁级分之间的光谱比较表明，在RbcS(tp):Cel5:CBM6-处理的细胞壁级分中，主要差别是分配到纤维素谱带强度中的减少：纤维素的糖苷基C-O-C键的谱带强度在1157cm^-1，C-O-C键在1060cm^-1，和C-C键在898cm^-1。

上述结果证明在本发明的转基因植物中表达的RbcS(tp):Cel5:CBM6在其自身细胞壁中具有自动水解活性(图5)。

工业适用性

如上文所阐释的那样，本发明用于产生表现出针对纤维素的自动水解活性的转基因植物和应用其产生可溶糖的方法，可以增加可溶的糖从植物细胞的细胞壁物质的产生，而不需要额外的步骤或外部来源的酶。因此，与应用外源产生的酶通过大规模发酵的常规方法相比，这是一种用于生产可溶糖类的高度节约的系统，其将酶生产过程最小化。

序列表内容

SEQ.ID.No1是RbcS(tp):Cel5:CBM6的序列，RbcS(tp):Cel5:CBM6是一种携带纤维素酶、纤维素结合结构域和叶绿体靶向肽的重组cDNA。

本领域的技术人员应该理解，对于实行本发明的相同的目的，在前述描述中公开的概念和具体实施方案可以容易地用作改进或设计其它实施方案的基础，本领域的技术人员还应该理解，这样等价的实施方案没有背离如在附上的权利要求中提出的本发明的精神和范围。

用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约

国际表格

原始保藏情况下的证明

按照细则Rule 7.1发行

致：HWANG，Inhwan

Center for Plant Intracellular Trafficking，Pohang of Science and Technology，#San31，Hyoja dong，Nam gu，浦项，790-784，

韩国

I.微生物的鉴定保藏人给予的鉴定参考：根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA-4404国际保藏机构给予的保藏号KCTC 10834BPII.科学描述和/或提议的分类命名对上文I中表示的微生物附有：[x]科学描述[]提议的分类命名(在适用的地方标注叉号)III.接收和接受本国际保藏中心接受了上述I中表示的微生物，该微生物于     收到.IV.转保藏请求的接收本国际保藏中心于2004年6月28日接受了上述I中表示的微生物，并且于2005年8月17日收到了将原始保藏转化为根据布达佩斯条约的保藏的请求.V.国际保藏机构名称：韩国典型培养物保藏中心地址：韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)#52，Oun-dong，Yusong-ku，大田305-333.韩国有权代表本国际保藏机构的官员签字OH，Hee Mock，Director日期：2005年8月19日

序列表

<110>Pohang Univ.

<120>表达用于自动水解纤维素成分的纤维素酶的转基因植物和产生可溶的糖的方法

<160>1

<170>Kopatentln 1.71

<210>1

<211>1357

<212>ONA

<213>人工序列

<220>

<223>RbcS(tp):Cel5:CBM6

<400>1

atgttggata aacttaaagt aataaatgga aaactgacag ccggtgagaa accagtaaga        60

cttttcgggt tatcaactca cggtatagcc tggtatccgg aatatatttg tgaagaatca        120

ttcaatgccc taaaaaaaga ctggcgtaca aactgtataa ggatagcaat gtacacagac        180

gaattcagag ggtactgcaa ggacggcaac aaacagcatc tgaaagagct gatcgagaaa        240

ggcgttgtta ttgcagaaaa actggatatg tatgtaatag tagactggca cgttctgtgt        300

gatcaggatc cgatgaaata tattgatgaa gctgaagagt ttttcagtga tatgtcaaag        360

aggttcgcca ataaaacaaa cgttatatac gagatatgta acgaacctaa ctgcagcggc        420

acatgggata aaataacaga atatgcagac aggataatcc cgataatccg cagtaactcc        480

cccgatgcac ttattgtcac aggaacatca acgtggtcgc aggacataca ctgtgcgctt        540

gaaaagccgc tgaaatggga caatgttatg tactctctgc atttctatgc tgctacacac        600

aagggtacac tgcgcagcag actggaacga tgtattgaag ccgggcttcc ggtttttatc        660

aatgaattca atctgtgtga agctagcggt aagggcgata tcgatataga tgaagcaaat        720

gcatggtatg aggtaataga cagactcggg ctgagctgca taagctggtg cctttcaaac       780

agtggagata cctgcggcgt ttttacccaa aattgtacaa agctttcagg ctggacggat       840

gaagatataa aaacatcggg caaaataata aaaggctggt ttgaggcatt tgcagatgag       900

gagaatacaa atgaacaatg ttttcgaagt tcaccagtgc ctgcacctgg tgataacaca       960

agagacgcat attctatcat tcaggccgag gattatgaca gcagttatgg tcccaacctt       1020

caaatcttta gcttaccagg tggtggcagc gccattggct atattgaaaa tggttattcc       1080

actacctata aaaatattga ttttggtgac ggcgcaacgt ccgtaacagc aagagtagct       1140

acccagaatg ctactaccat tcaggtaaga ttgggaagtc catcgggtac attacttgga       1200

acaatttacg tggggtccac aggaagcttt gatacttata gggatgtatc cgctaccatt       1260

agtaatactg cgggtgtaaa agatattgtt cttgtattct caggtcctgt taatgttgac       1320

tggtttgtat tctcaaaatc aggaacttaa ggagctc                                1357