一种重组超广谱β－内酰胺酶的表达纯化及其高密度发酵方法

摘要

本发明公开了重组超广谱β－内酰胺酶的表达纯化及其高密度发酵方法。涉及含SHV－4型ESBL基因插入分泌型表达载体，并在大肠杆菌中表达。还涉及中试级别的发酵和纯化，发酵获取大量细菌后，菌体悬液超声破碎、离心获取超声上清及其包涵体沉淀：超声上清通过亲和层析，一步就获取高纯度重组SHV－4型ESBL，平均每升发酵液中得到7mg，酶比活为476IU/mg；而包涵体沉淀的复性和纯化同时进行，沉淀溶于尿素后，采用分子筛层析法纯化，获取高纯度重组SHV－4型ESBL，并在纯化的同时使重组ESBL复性，得到每升发酵液中得到17mg SHV－4型ESBL，酶比活为438IU/mg。本发明为各型ESBL生产制备提供一种方法，为大量制备ESBL打下坚实的基础。

说明书

技术领域

本发明重组超广谱β-内酰胺酶的表达纯化及其高密度发酵方法，属于医药生物工程技术领域，更具体地说是通过基因工程方法在大肠杆菌中表达纯化出ESBL，利用大规模发酵及其纯化技术获取大量、价廉的ESBL，为实际应用打下基础。

背景技术

ESBL是一类能水解青霉素类、头孢菌素类和单酰胺类抗生素酰胺环上酰胺键的酶，和广谱β-内酰胺酶(TEM-1、SHV-1)相比，其特征是能水解第四代以下头孢菌素β-内酰胺类抗生素酰胺环的酶(Jacoby G A.Extended-Spectrum-Lactamases And Other Enzymes ProvidingResistance To Oxyimino-Lactams.Infect Dis Clin Noth Am 1997，11：875-887。)绝大部分该类酶是由质粒介导的周质酶，能分泌到细胞周质中切断信号肽成为成熟酶，水解β-内酰胺类抗生素，从而避免了因抗生素作用于细菌内膜上的青霉素结合蛋白(penicillin bind proteins，PBPs)，而干扰细胞壁合成导致的细菌死亡。

由于不同的新型半合成β-内酰胺类抗生素的普遍应用，在抗生素的压力下，细菌的ESBL产生点突变，生成了种类繁多的ESBL，以便生成底物谱更广，水解率更高的β-内酰胺类抗生素。其中最常见和占主导地位的是SHV型和TEM型，它们分别是由位于质粒上编码SHV-1和TEM-1的结构基因突变，使酶活性中心一个或数个氨基酸发生取代而衍生出大量的亚型(Medeiros AA.Evolution and dissemination of β-lactamases accelerated by generations of β-lactam antibioticsl Clin Infect Dis，1997，24：19-45)。如SHV-4型ESBL：由SHV-1β-内酰胺酶进化而来，与SHV-1的区别在于氨基酸序列中第205位Leu被取代Arg，第238位Ser被Gln取代和240位Lys被Glu取代，突变导致了SHV-4型ESBL扩大了底物谱，具有较高的降解新一代β-内酰胺类抗生素活力。耐药菌将含不同ESBL基因的将耐药质粒传递到同种或异种细菌，造成ESBL基因的传播。

当然，耐药菌产生更多新的耐药酶对我们临床用药带来很大的困难。但是，扩大的耐药菌ESBL基因库为我们提供了一个重要的获取底物谱广，水解率高耐药酶基因来源。分离该种基因后，在大肠杆菌中高效表达纯化后得到的纯品可以用于保护非感染部位正常微生物免遭β-内酰胺地杀灭，降解环境中及其动物源性食品中β-内酰胺类抗生素。

关于ESBL的用途最早见于CN1438315A专利，该专利公开了一种同时具有β-内酰胺酶和氨基糖苷钝化酶融合蛋白，该蛋白可以用于保护非感染部位正常微生物免遭β-内酰胺和氨基糖苷类抗生素地杀灭，降解环境中及其动物源性食品中β-内酰胺和氨基糖苷类抗生素，但该专利侧重这两类酶应用范围的保护，未涉及融合酶单独的任一种耐药酶表达纯化方法专利申请。

WO 93/13795，A61K 37/54专利公开的以天然菌株获取β-内酰胺酶，保护抗生素治疗期间的肠道正常菌群，但该方法由于是从天然菌中提取酶，所以产量比较低，纯化较为困难，由此导致生产成本较高。

在国内有关于天然菌β-内酰胺酶纯化的报道，但是未见基因工程耐药酶表达纯化的报道，如赵秀丽纯化天然菌的β-内酰胺酶，先后使用了两次分子筛层析，一次离子交换层析，纯化过程的繁琐导致天然β-内酰胺酶纯化得率低、成本高(赵秀丽，李家泰.质粒介导的超广谱β-内酰胺酶(E S B L s)的特性研究.中国临床药理学杂志，1998，14(1)：18-23.)。

国外对天然的和基因工程重组β-内酰胺酶耐药酶纯化都有报道，但也存在纯化繁琐，或产量低下的缺点。如Quinting B(Quinting B，Galleni M，Timm J et al.Purification and propertiesof the Mycobacterium smegmatis mc2155 β-lactamase.FEMS Microbiol Lett 1997，149(1)：11-15.)纯化天然耻垢分枝杆菌mc2155中的β-内酰胺酶，目的蛋白产量约为1mg/L菌液，经过QSepharose High Performance柱(36/10)，以NaCL梯度洗脱后，上样monoP HR 5/20 column，pH洗脱后，浓缩上样Superdex 75(10/30)柱后得到的目的蛋白得率仅为20％。Bouillenne F(Bouillenne F，Matagne A，Joris B et al.Technique for a rapid and efficient purification of theSHV-1 And PSE-2 β-lactamases.J Chromatogr B Biomed Sci 2000，737：261-265.)把SHV-1基因接到表达质粒p453再转化到E.colik12中，该方法结果是表达量较低，纯化过程较繁琐，纯化过程使用了一种离子交换柱和一种分子筛柱。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种产量高、纯化简便、低成本的重组超广谱β-内酰胺酶的表达纯化方法，各种型号的种ESBL能依照此方法表达和纯化该酶蛋白。

本发明的实现方法：

本发明设计ESBL通用引物，并加入酶切位点。上游引物为：5’-GGCCATGGGGATGCGTTATATTCGC-3’和下游引物5’-TACTCGAGGCGTTGCCAGTGCTCGA-3’。从筛选的高耐药酶中获取总DNA，以此为模板，进行PCR反应。

PCR产物胶回收纯化后，与pMD 18-T vector进行连接，连接产物转化感受态JM109，经篮白斑筛选后，挑取白斑，再扩大培养，然后提取质粒pMD18T-SHV-4，经酶切电泳，并测序确认为SHV-4基因。

将pMD18T-SHV-4和pET26b用NcoI、XhoI双酶切，经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化，回收双酶切的SHV-4片段及其质粒大片断，用T4连接酶连接后，转化感受态E.coliBL21(DE3)，再将转化菌涂布于含卡那霉素的LB平板上，经37℃培养过夜，挑取单菌落扩大培养，经nitrocefin定性试验，确证有活性ESBL产生。

获取的工程菌转到发酵培养剂中进行高密度发酵，在35℃～40℃和pH6.0～7.5的条件下进行，得到高密度的发酵培养菌液。

本发明的培养剂以LB培养基为基础，每升添加40g葡萄糖、0.03％的卡那霉素、8ml无机盐溶液等组成。而无机盐溶液由0.2％～0.5％磷酸二氢钠、0.6％～0.8％磷酸氢二钾、0.01～0.05硫酸锌、0.01％～0.05％硫酸镁、0.2％～0.8％磷酸铵组成。

本发明中，SHV-4酶的表达由T7启动子控制的，T7启动子可由IPTG激活，当细菌生长到对数生长期的前期时，加入IPTG至0.2mmol/L的终浓度，此时细菌生长减速，目的蛋白表达量上升。

本发明中细胞周质中可溶性SHV-4酶的纯化：取Ni²⁺-NTA琼脂糖装柱，用Binding buffer平衡。含SHV-4酶细菌超声上清液经0.45μm滤膜过滤后，缓慢过柱，接着用的Binding buffer洗柱，再用Wash buffer洗柱，最后用Elute Buffer洗脱蛋白，仅通过一步的亲和层析获取95％以上纯度SHV-4酶，平均每升发酵液中得到7mg SHV-4酶，酶比活为476IU/mg。

本发明中包涵体SHV-4酶的复性和纯化：发酵菌液离心，收集沉淀，加适量H₂O吹悬菌体后，冰浴进行超声破碎，再离心，沉淀即为包涵体粗提物。沉淀中加入适量变性液，用吸管吹悬沉淀使之充分溶解，离心取上清，上清为包涵体溶解液。将适量包涵体变性液洗脱，收集活性蛋白峰，Sephadex G25柱脱盐、再冻干，得到蛋白纯品，SDS-PAGE电泳验证得到蛋白的纯度。

本发明酶活力测定方法采用紫外吸收法：测定酶对底物的水解率，OD₂₃₃时测定青霉素G吸光度的变化，计算酶活力单位。

本发明蛋白的含量测定采用Bradford法：1g/L的牛血清白蛋白为标准液，OD₅₉₅时在加入样品1h内测吸光度。

本发明的有益效果：

本案中采用基因工程的方法在大肠杆菌中表达ESBL，极大地提高了目的蛋白产量，而且重组ESBL在3’端添加了6×His尾，带这种His尾的融合蛋白方便了下游的纯化，通过一步亲和层析，纯度便达到95％以上。

通常在基因工程提高目的蛋白产量的同时，目的蛋白会聚集形成无活性的包涵体，如此就面临昂贵和繁琐的复性问题。在本案中对于出现的包涵体，用了尿素变性剂和分子筛层析相结合的的方法，在纯化的同时完成了复性，而避免了传统的氧化剂-还原剂谷胱甘肽的方法先复性，再纯化昂贵的价格和繁琐的步骤，从而极大的降低了生产成本和提高了SHV-4酶的得率。

由于所有类型的ESBL序列相似，SHV-4酶的表达纯化及其发酵的方法也适用于其它类型的ESBL的制备。

附图说明：

图1：表达载体pET26-SHV-4的构建图；

图2：1：DL15000分子参照物；2：pET26-SHV-4质粒单酶切(NcoI)；3：pET26-SHV-4质粒双酶切(NcoI+XhoI)；

图3：重组菌(pET26-SHV-4/BL21)上清纯化产物的SDS-PAGE电泳图；1：总上清；2：过柱上清(主要为为没有结合到亲和柱上的蛋白)；3：Bind洗脱液(主要清洗亲和树脂上未结合的的杂蛋白)；4：Wash洗脱液(洗去较紧密结合在亲和树脂上的杂蛋白。5：Elution洗脱液(纯度95％以上的SHV-4酶)；6：分子量标准；

图4：重组菌(pET26-SHV-4/BL21)包涵体纯化产物的SDS-PAGE电泳图；

1：Sephadex G75洗脱液(纯度95％以上的SHV-4酶)；2：包涵体变性液(最浓条带为SHV-4酶)；3：分子量标准；

本发明的材料

1.限制性内切酶NcoI、XhoI购自大连宝生物工程有限公司；

2.T4连接酶、Tag DNA plus聚合酶、Taq DNA聚合酶、UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生物工程有限公司；

3.质粒提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；

4.His·Tag亲和树脂购自美国Novagen，Inc.(Madison，WI)；

5.Nitrocefin购自英国OXOID公司；

6.LB培养基自己配置(蛋白胨1％，酵母粉0.5％g，NaCL 1％)

具体实施方式：

实施例1：SHV-4基因的克隆

(1)SHV-4片段的PCR扩增

以SHV-1型ESBL基因为模板，设计SHV型ESBL通用引物，并加入酶切位点。上游引物为：5’-GGCCATGGGGATGCGTTATATTCGC-3’含NcoI酶切位点和下游引物5’-TACTCGAGGCGTTGCCAGTGCTCGA-3’含XhoI酶切位点。提取上述产酶E.coli的质粒，以此为模板，进行PCR反应。反应条件为：94℃预变性5min，再按如下参数循环25次：94℃变性55s，58℃退火50s，72℃延伸1min，最后1个循环72℃延伸10min。

(2)PCR产物的纯化

采用低融点琼脂糖(Low melting point agarose，LMPA)法回收。PCR产物经1％低融点琼脂糖凝胶电泳后，切出含目的片段的胶块，放入1.5ml Eppendorf管中，加入TE约200μl，再加等体积的Tris饱和酚于70℃融化，10000rpm/min离心10min，等体积的酚∶氯仿(1∶1)，氯仿各抽提一次，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)沉淀DNA，根据回收片段的量溶于6-10μl水中，取1μl电泳检测，-4℃保存备用或直接用于连接反应。

(3)连接反应

把经纯化的PCR产物片段和pMD18T片段连接。

连接反应体系：pMD18T载体片段    2μl

PCR片段                         2μl

10×T4 Buffer                   2μl

T4连接酶2.5U                    1μl

加双蒸水至20μl

混匀加完毕的连接反应液，放置16℃连接5h后，放置4℃备用或直接用于转化反应。

(4)感受态细胞的制备及其转化

用氯化钙法制备感受态细胞，操作的每一步都要求严格的无菌。先用无菌接种环刮取冻存于-80℃冰箱中的E.coli JM109菌种，划线接种于不含抗生素的LB琼脂平板，37℃培养16h左右。挑取单菌落，接种到5ml LB培养基中，37℃，250rpm/min振摇培养，取0.5ml培养物接种于50ml LB培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD₆₀₀为0.4-0.6。再将细菌培养物转移到0℃预冷的无菌聚丙烯离心管中，冰浴10min，4℃、5000rpm/min离心10min，弃上清，以10ml冰预冷的100mmol/L CaCl₂、10mmol/LTris·Cl(pH8.0)的溶液重悬沉淀。最后冰浴20min，4℃、5000rpm/min离心10min，弃上清，以2ml冰浴预冷的100mmol/L CaCl₂-甘油溶液重悬沉淀细胞，即为感受态细胞。将感受态细胞分装于无菌微量离心管中，每管200μl，标明菌株、日期，置-80℃冰箱冻存备用。

(5)转化及其鉴定

将10μl连接反应液加入200μl E.coli JM109感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴45min，42℃水浴2min，重新放入冰浴2min，加LB培养基至1ml，37℃、150rpm/min振摇培养1h，取200μl上述培养物，布于氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB平板，经37℃培养过夜，挑取白斑，再扩大培养，然后提取质粒DNA，经酶切电泳，核苷酸测序由宝生物公司完成，并核对核苷酸序列，确认与NCBI公布的SHV-4型核苷酸序列一致，故将本克隆质粒命名为pMD18T-SHV-4。

实施例2：pET26-SHV-4重组质粒的构建、鉴定

(1)pET26b-SHV-4重组质粒的构建和鉴定

将pMD18T-SHV-4和pET26b用NcoI、XhoI双酶切，经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化，回收双酶切的SHV-4片段及其质粒大片断，按5∶1的分子数，用T4连接酶16℃连接过夜(见图1)。然后，转化感受态E.coli BL21(DE3)。再将转化菌涂布于含卡那霉素的LB平板上，经37℃培养过夜，挑取单菌落扩大培养，经nitrocefin定性试验，确证有活性ESBL产生。提取质粒，酶切电泳(见图2)。

实施例3：SHV-4酶的发酵表达

(1)发酵培养剂的制备

10L LB发酵培养基，100g蛋白胨，50g酵母粉，100gNaCL，40g葡萄糖、0.03％的卡那霉素、8ml无机盐溶液，无机盐溶液由0.2％～0.5％磷酸二氢钠、0.6％～0.8％磷酸氢二钾、0.01％～0.05％硫酸锌、0.01％～0.05％硫酸镁、0.2％～0.8％磷酸铵组成。将发酵液体120℃、30min高压灭菌后，加入卡那霉素至30μg/ml，发酵培养剂制备完毕，消泡剂为优质豆油(预先灭菌)；浓氨水和浓盐酸(调节发酵液pH值)；

(2)摇瓶发酵

重组菌接种于发酵培养基(含30μg/ml卡那霉素)，于37℃、150r/min振荡培养7h后，将活化的种子菌以1∶100比例接种于1L的LB培养基(含30μg/ml卡那霉素)，于37℃、150rpm/min振荡培养。当细菌生长达到OD₆₀₀为1.5时，加IPTG至终浓度0.2mmol/L，继续培养4h后，取菌液，经12000rpm/min离心5min，收集菌体.

(3)高密度发酵

设置发酵参数：特征是所述的发酵培养在温度35～40℃和pH6.0～7.5的条件下进行，并保持水溶性氧＞15％，搅拌速度400rpm/min，当溶氧＜15％，自动提高转速。

灭菌后的7L LB，加2.1ml卡那霉素(100mg/ml)使LB培养基终浓度为30ug/ml，再将种子按5％比例接入发酵罐内，当菌体生长至OD_600nm所需浓度1.5时开始诱导，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2mmol/L，其它发酵条件保持不变。待菌体OD值不再升高并保持一段时间开始下降时开始撤罐，发酵终止。

实施例4：重组SHV-4酶细菌纯化前原酶液的制备

3L发酵菌液8000rpm/min，4℃、20min离心，收集沉淀，加30ml H₂O吹悬菌体后，冰浴进行超声破碎：输出功率控制档为4，持续7s，间隔7s，时间35min。超声后的匀浆，20000rpm/min，4℃，离心30min，超声上清液，主要为可溶性重组SHV-4酶，超声沉淀主要为不溶性重组SHV-4酶。

实施例5：可溶性SHV-4酶的纯化

(1)可溶性SHV-4酶的纯化

取1ml Ni²⁺-NTA琼脂糖(每ml树脂可吸附5-10mg 6×His融合蛋白)，装柱，用Binding buffer平衡。100ml含SHV-4酶超声上清液经0.45μm滤膜过滤后，缓慢过柱，接着用1000ml的Bindingbuffer洗柱，再用600ml的Wash buffer(0.5M NaCl，60mM imidazole，20mM Tris-HCl，pH7.9)洗柱，最后用600ml Elute Buffer(1M imidazole，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.9)洗脱蛋白。

(2)活性蛋白峰脱盐、冻干

用无菌双蒸水平衡Sephadex G25 XK 50/100至pH和电导平衡。将活性峰上样Sephadex G25XK 50/100柱(上样量每次小于350ml)，用无菌双蒸水进行洗脱，收集脱盐峰。经过脱盐的β内酰胺酶活性峰用0.22um膜过滤除菌，上述无菌液按1-1.5ml/支分装到无菌安瓶中，-65℃冻结后，装入冻干球瓶中进行冻干，得到冻干纯品，平均每升发酵液中得到7mg SHV-4酶，酶比活为476IU/mg。把蛋白纯品及其不同纯化步骤组分SDS-PAGE电泳(见图3)。

实施例6：包涵体中SHV-4酶的纯化

(1)包涵体变性

实施例4中超声沉淀按每升菌液加入5ml变性液(10mol/L尿素，10mmol/L DTT)。用吸管吹悬沉淀使之充分溶解，室温放置1h以上。溶解液20000rpm/min，20℃、30min，离心取上清。

(2)包涵体复性及酶纯化

用分离Buffer(2mol/L尿素+0.05mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸，pH6.6)平衡Sephadex G75(XK50/100)柱至pH和电导平衡。将包涵体变性液(6mol/L的盐酸胍)15ml上样，流速5ml/min进行洗脱，280nm进行检测，收集活性蛋白峰，用nitrocefin定性，保留有高活力的蛋白峰。

(3)活性蛋白峰脱盐、冻干

用无菌双蒸水平衡Sephadex G25 XK 50/100至pH和电导平衡。将活性峰上样Sephadex G25XK 50/100柱(上样量每次小于350ml)，用无菌双蒸水进行洗脱，收集脱盐峰。经过脱盐的β内酰胺酶活性峰用0.22um膜过滤除菌，上述无菌液按1-1.5ml/支分装到无菌安瓶中，-65℃冻结后，装入冻干球瓶中进行冻干。冻干机：真空度0.05bar，捕水器-55℃。室温过夜，得到冻干纯品，平均得到每升发酵液中得到17mg SHV-4酶，酶比活为438IU/mg，把蛋白纯品及其不同纯化步骤组分SDS-PAGE电泳(见图4)。

实施例7：蛋白含量的测定

Bradford法测蛋白的含量，1g/L的牛血清白蛋白为标准液。OD₅₉₅时在加入样品1h内测吸光度。

(1)试剂：CBG250试剂：考马斯亮兰G250(Coomassie Blue G250)100mg溶于95％的酒精50ml，加蒸馏水800ml，加85％磷酸100ml，补足蒸馏水至1000，滤纸过滤后加12mol/L盐酸10ml。蛋白标准液：1mg/ml牛血清白蛋白

(2)测定方法

空白管：CBG250 5ml+100ul蒸馏水

标准管：CBG250 5ml+100ul蛋白标准液

测定管：CBG250 5ml+100ul样品(样品蛋白浓度稀释至接近蛋白标准液浓度)

计算公式：M样＝A样×V标/A标×V样，M总＝M样×V总/V样

A样、A标分别为测定管、标准管OD₅₉₅时的吸光度，V样、V标、分别为测定管、标准管加入的蛋白液体积，V总为测总蛋白液体积，M样、M总分别为加入蛋白、总蛋白的质量。

以空白管为对照，测定OD₅₉₅时A样、A标的吸光度，按上面的计算公式计算总蛋白的质量。

实施例8：酶活力的测定

(1)紫外吸收法测定酶对底物的水解率，OD₂₃₃时测定青霉素G吸光度的变化^[6]，计算酶活力单位。酶活力单位定义为pH7.0、37℃，每分钟水解1μmol底物为一个国际单位。

(2)试剂

底物：青霉素G，分子量356.4，浓度480μg/mL。

缓冲液：0.1mol/L PBS(0.1mol/LNa₂HPO4，0.1mol/LNaH₂PO4，pH7.0)

终止液：1mol/L盐酸

(3)测定方法

空白管：4ml蒸馏水+PBS 1ml+加入1ml终止液终止反应，混匀。

全分解管：底物1ml+PBS 1ml+10ul样品(约10mg/ml蛋白)，37℃水浴2h，加入1ml终止液终止反应，测定前加入3ml蒸馏水，混匀。

未分解管：底物1ml+PBS 1ml+10ul样品(约10mg/ml蛋白)+1ml终止液，37℃水浴2h，测定前加入3ml蒸馏水，混匀。

测定管：底物1ml+PBS 1ml+10ul样品(约10mg/ml蛋白)，37℃水浴10min，加入1ml终止液终止反应，测定前加入3ml蒸馏水，混匀。

计算公式：U样品＝(A未-A样)M/(A未-A全)T，U全＝V总×U样品/V样品U样品为测定酶样品的活力，U全为总酶活力，A未、A样、A全分别为未分解管、全分解管、测定管的吸光度值。M为1ml底物摩尔浓度，T为测定管温浴时间，V样品为加入测定管中样品的体积，V总为总样品体积。

以空白管为对照，测定OD₂₃₃时A未、A样、A全的吸光度，按上面的计算公式计算总酶活力。