一种鞘氨醇单胞菌以及采用该菌种生产微生物多糖—三赞胶的方法

摘要

本发明涉及一种鞘氨醇单胞菌以及微生物多糖的制备方法，特别是指一种鞘氨醇单胞菌以及采用该菌种生产微生物多糖——三赞胶的方法。它包括将鞘氨醇单胞菌CGMCCNo.1650接种到含有碳源的培养液中，添加必要的氮源及营养物质；调节培养液的pH，进行通气搅拌发酵；将发酵完成后的发酵液用中性盐调节等电点、沉降萃取、脱水后即得微生物多糖——三赞胶等工艺步骤。本发明解决了现有技术中以有机溶剂作为萃取剂存在的易挥发、安全系数低且成本高，且现有黄原胶产品的水溶液粘度等技术指标均较差的缺点，具有成本低，操作安全，所制备的微生物多糖——三赞胶在粘度、剪切性能值等指标上均达到GB13886－92的标准并显著优于现有黄原胶产品等优点，且外观呈纯白色，应用范围广等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鞘氨醇单胞菌以及微生物多糖的制备方法。

背景技术

目前以黄原胶为代表产品的微生物多糖，制备过程中是以黄单孢菌属中的维管束黄单孢菌、秋海棠黄单孢菌、野油菜黄单孢菌等菌种为发酵菌种，在提取过程中采用有机溶剂-乙醇作为萃取剂或采取酸提取做为主要提取方法而获得，采用上述菌种的发酵方法制成的成品微生物多糖——黄原胶产品色泽呈黄色或淡黄色，且该产品的水溶液粘度(800cp)、剪切性能值(6.3)及抗温性能均较差，由于其水溶液粘度及剪切性能值等主要技术指标偏低，导致该产品在推广应用过程中存在很大困难。而在发酵后的提取过程中采用有机溶剂和酸作为提取剂，存在着易挥发、使用时安全系数低、成本高等问题，给工业化生产带来很大的安全隐患等问题。

发明内容

本发明的目的之一在于公开了一种能够发酵生产微生物多糖——三赞胶的鞘氨醇单胞菌，即鞘氨醇单胞菌CGMCCNo.1650。

本发明的目的之二是公开了一种以鞘氨醇单胞菌为菌种生产微生物多糖三赞胶的方法，以获得水溶液粘度、剪切性能值及抗温性能等主要技术指标上均优于现有黄原胶的微生物多糖三赞胶。同时，在发酵后的提取过程中采用中性盐作为调节等电点的主要手段，使制备过程操作安全、生产成本低。

本发明的整体技术构思是：

本发明的中使用的微生物是：

本发明中用于生产生产微生物多糖三赞胶的菌种——鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.即为具有生产微生物多糖——三赞胶能力的菌种，该菌种已于2006年3月14日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.1650。

该菌种的DNA序列测定结果为：

TGCAGTCGAACGAGACCTTCGGGTCTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAAT

CTGCCCTTGGGTTCGGAATAACTCAGAGAAATTTGAGCTAATACCGGATGATGTCGAGA

GACCAAAGATTTATCGCCCAGGGATGAGCCCGCGTAGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTA

AAGGCTCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGG

ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAATGGACAATGG

GCGCAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCT

CTTTTACCCGGGATGATAATGACAGTACCGGGAGAATAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCC

AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCG

CACGTAGGCGGCTTTGTAAGTTAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTCAACTTCAGAATAGCC

TTTAAGACTGCATCGCTTGAATCCAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTG

AAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACTGGTATT

GACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC

GCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGCACTTGGTGCTTGGGTGGCGCAGCTAAC

GCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGAC

GGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTT

ACCAGCGTTTGACATGGCTAGTATGGGTCTCAGAGATGGGGTCCTTCAGTTCGGCTGG

CTAGCACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAG

TCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCTTTAGTTACCATCATTTGGTTGGGTACTCTAAAG

GAACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTT

ACGCGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCAACTACAGTGGGCTGCGAACTCGCGA

GGGTGAGCTAATCTCCAAAAGTTGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGC

ATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAG

GCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTCACCCGAAGGCAGTGCGC

TAACCGCAAGGAGGCAGCTGACCACGGTGATCAGCGTCGG

上述菌种具有如下表中所描述的细胞形态和理化特性：

试验项目结果  试验项目结果    试验项目  结果    试验项目结果细胞形态杆状  革兰氏染色阴性    接触酶  阳性    O/F试验氧化对照-  D-蜜二糖+    p-苯乙醇酸  -    L-组氨酸-a-环糊精-  甲基葡糖苷-    衣康酸  -    羟基脯氨酸-糊精+  D-阿洛酮糖-    a-氧代丁酸  -    L-亮氨酸-糖原-  D-棉子糖+    a-氧代戊二酸  -    L-鸟氨酸-Tween40-  L-鼠李糖-    a-氧代戊酸  -    L-苯丙氨酸-Tween80+w  D-山梨醇-    D，L-乳酸  -    L-脯氨酸-N-乙酰半乳糖胺-  蔗糖+    丙二酸  -    L-焦谷氨酸-N-乙酰葡萄糖胺-  D-海藻糖+    丙酸  -    D-丝氨酸-核糖醇-  松二糖-    奎尼酸  -    L-丝氨酸-L-阿拉伯糖+  木糖醇-    D-己糖酸  -    L-苏氨酸-D-阿糖醇-  丙酮酸甲酯+    葵二酸  +    D，L-肉碱-D-纤维二糖+  丁二酸一甲酯+w    丁二酸  -    g-氨基丁酸-i-赤藓醇+w  乙酸-    溴代丁二酸  +    尿刊酸+D-果糖-  顺-阿康酸-    琥珀酰胺酸  +    肌苷-L-果糖-  柠檬酸-    葡糖醛酰胺  -    尿苷-D-半乳糖+  甲酸-    L-丙氨酰胺  -    胸苷-龙胆二糖+  D-半乳糖内酯-    D-丙氨酸  -    苯基乙胺-a-D-葡萄糖+  D-半乳糖醛酸-    L-丙氨酸  -    腐胺-m-肌醇-  D-葡糖酸-    L-丙氨酰甘氨酸  -    2-氨基乙醇-a-D-乳糖-  b-甲基葡糖苷-    L-天冬酰胺  -    2，3-丁二醇-Lactulose+w  D-葡糖醛酸+    L-天冬氨酸  -    甘油+w麦芽糖-  a-羟基丁酸-    L-谷氨酸  -    D，L-甘油磷酸盐-D-甘露醇-  b-羟基丁酸+    甘氨酰天冬氨酸  -    D-葡糖-1-磷酸-D-甘露糖+  g-羟基丁酸-    甘氨酰谷氨酸  +    D-葡糖-6-磷酸-

本发明中利用鞘氨醇单胞菌为菌种生产微生物多糖——三赞胶的方法，包括如下工艺步骤：

A、将鞘氨醇单胞菌CGMCCNo.1650接种到含有碳源的培养液中，添加必要的氮源及营养物质；

B、调节培养液的pH，进行通气搅拌发酵；

C、将发酵完成后的发酵液用可溶性中性盐调节等电点、沉降萃取、脱水后即得微生物多糖三赞胶。

步骤C包括：

a、将发酵完成后的发酵液调节等电点，调PH值为4.5-5.5，并搅拌均匀；

b、在a步骤中制得的发酵液中加入可溶性中性盐进行沉降萃取得到纤维状的微生物多糖；

c、将b步骤中制得的生物多糖进行脱水，并用强碱弱酸盐或二价碱调节其PH值为6.5-7.5后干燥、粉碎制成微生物多糖三赞胶。强碱弱酸盐优选碳酸钠、碳酸钾，二价碱优选选用氢氧化镁、氢氧化钙。其中的脱水设备选用螺旋挤压脱水机，脱水过程中螺旋挤压脱水机的转速为10-15转/分钟。

步骤a中调节发酵液的PH值选用乙酸；步骤b中所述的可溶性中性盐为硫酸盐、硝酸盐、氯化物中的一种的水溶液，其中优选氯化钠、硝酸钠、硫酸钠。

步骤A、B中所述的培养液中的碳源选自葡萄糖或蔗糖中的一种或其混合物。培养液中包括下列重量份的组分：

葡萄糖20-30          蔗糖10-20      硝酸钠2.5-4    硫酸镁0.5-1

磷酸二氢钾1.5-2.5    碳酸钙1-1.5    水941-965

培养液的pH为7.0-7.2。

发酵条件为通风量0.2-0.5vvm，搅拌转速120-160转/分钟，培养温度35-40℃，发酵周期为60-70小时。

步骤B的发酵过程中采用裴林氏法检测还原糖≤0.02％，采用甲醛法检测氨基氮≤0.02％时为发酵终点。

将鞘氨醇单胞菌CGMCCNo.1650经过扩大培养后，按照种子液：培养液为7％-10％的接种量接种于培养液中。

扩大培养包括：

(1)将鞘氨醇单胞菌CGMCCNo.1650接种于试管中的斜面培养基表面制成斜面菌种；

(2)将斜面菌种经扩大培养后制成种子液；

(3)将制成的种子液按种子液：培养液为7％-10％的接种量接入发酵罐中的培养液，进行发酵。

步骤(1)中制备斜面菌种的工艺条件是温度36-38℃、培养时间为68-72小时。

步骤(2)中的扩大培养依次包括摇床种子的制备、一级种子的制备、二级种子的制备，其中摇床种子的制备过程中的培养基的组成成分与步骤(1)中斜面培养基的组成成分相同，将斜面菌种接入灭菌后摇床种子的培养基经过培养制成摇床种子，培养的工艺条件为摇床转速120-160转/分钟，培养温度35-40℃，培养时间20-24小时。

斜面培养基由下列重量份的组分组成：

葡萄糖12-15    酵母膏2.5-3    牛肉膏0.5-1    蛋白胨0.5-1

琼脂2.5-3      水770-820

其中一级种子的制备过程中培养液由下列重量份的组分组成：

蔗糖12-15    硝酸钠2.5    酵母膏0.5-1    磷酸二氢钾0.5-1

水805-845

接种量为摇床种子：一级种子培养液＝1％，将摇床种子接入灭菌后的一级种子培养液经过培养制成一级种子，一级种子的制备过程中的工艺条件是PH值为7.0-7.2，通风量0.2-0.3vvm，搅拌转速为200转/分钟，培养温度为35-40℃，培养周期为18-24小时。

二级种子的制备过程中的培养液由下列重量份的组分组成：

葡萄糖12-15    硝酸钠2.5    酵母膏0.5-1    磷酸二氢钾0.5-1

水805-845

接种量为一级种子：二级种子培养基＝7％-10％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是PH值为7.0-7.2，通风量0.2-0.3vvm，搅拌转速为200转/分钟，培养温度为35-40℃，培养周期为16-20小时。

本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

(1)发明的制备方法中采用鞘氨醇单胞菌为菌种进行发酵，在提取过程中的萃取步骤中利用中性盐调节等电点等技术措施生产制备的微生物多糖——三赞胶，所制成的产品在粘度(1900cp)、剪切性能值(7.5)等指标上均达到GB13886-92的标准并显著优于现有黄原胶产品，且外观呈纯白色，具有极高的应用前景和商业价值。采用本发明制备的微生物多糖——三赞胶可广泛地应用于食品、纺织、消防、石油、化工、日化等多种行业。

(2)产品在盐溶液中的粘度值有较大增加幅度，在同等条件下，该项产品特性明显优于现有产品——黄原胶，可广泛应用于油田钻采领域，尤其在高矿化度地区或海洋石油钻采过程中用于配制泥浆，效果显著。

(3)在低浓度、低转速的同等检测条件下，该产品的特性明显优于现有黄原胶。

(4)在生产过程中不使用有机溶剂，从而提高了生产操作的安全性，并整体上降低了生产成本。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述：

本实施例包括如下工艺步骤：

A、将鞘氨醇单胞菌CGMCCNo.1650接种到含有碳源的培养液中，添加必要的氮源及营养物质；

B、调节培养液的pH，进行通气搅拌发酵；

C、将发酵完成后的发酵液用可溶性中性盐调节等电点、沉降萃取、脱水后即得微生物多糖三赞胶。

步骤C包括：

a、将发酵完成后的发酵液调节等电点，调PH值为4.8，并搅拌均匀；

b、在a步骤中制得的发酵液中加入可溶性中性盐进行沉降萃取得到纤维状的微生物多糖；

c、将b步骤中制得的生物多糖进行脱水，并用强碱弱酸盐或二价碱调节其PH值为6.5-7.5后干燥、粉碎制成微生物多糖三赞胶。强碱弱酸盐优选碳酸钠、碳酸钾，二价碱优选选用氢氧化镁、氢氧化钙。其中的脱水设备选用螺旋挤压脱水机，脱水过程中螺旋挤压脱水机的转速为12转/分钟。

步骤a中调节发酵液的PH值选用乙酸；步骤b中所述的可溶性中性盐为氯化钠。

步骤A、B中所述的培养液中的碳源选自葡萄糖和蔗糖。培养液中包括下列重量份的组分：

葡萄糖25         蔗糖13    硝酸钠2.8    硫酸镁0.7

磷酸二氢钾1.8              碳酸钙1.2    水950

培养液的pH为7.1。

发酵条件为通风量0.3vvm，搅拌转速140转/分钟，培养温度38℃，发酵周期为65小时。

步骤B的发酵过程中采用裴林氏法检测还原糖≤0.2％，采用甲醛法检测氨基氮≤0.02％时为发酵终点。

将鞘氨醇单胞菌CGMCCNo.1650经过扩大培养后，按照种子液：培养液为7％-10％的接种量接种于培养液中。

扩大培养包括：

(1)将鞘氨醇单胞菌CGMCCNo.1650接种于试管中的斜面培养基表面制成斜面菌种；

(2)将斜面菌种经扩大培养后制成种子液；

(3)将制成的种子液按种子液：培养液为7％的接种量接入发酵罐中的培养液，进行发酵。

斜面培养基由下列重量份的组分组成：

葡萄糖13    酵母膏2.8    牛肉膏0.7    蛋白胨0.8

琼脂2.8     水810

步骤(1)中制备斜面菌种的工艺条件是温度37℃、培养时间为70小时。

步骤(2)中的扩大培养依次包括摇床种子的制备、一级种子的制备、二级种子的制备，其中摇床种子的制备过程中的培养基的组成成分与步骤(1)中斜面培养基的组成成分相同，将斜面菌种接入灭菌后摇床种子的培养基经过培养制成摇床种子，培养的工艺条件为摇床转速140转/分钟，培养温度35-40℃，培养时间20-24小时。

其中一级种子的制备过程中培养液由下列重量份的组分组成：

蔗糖14    硝酸钠2.5    酵母膏0.8    磷酸二氢钾0.7

水830

接种量为摇床种子：一级种子培养液＝1％，将摇床种子接入灭菌后的一级种子培养液经过培养制成一级种子，一级种子的制备过程中的工艺条件是PH值为7.1，通风量0.28vvm，搅拌转速为200转/分钟，培养温度为38℃，培养周期为20小时。

二级种子的制备过程中的培养液由下列重量份的组分组成：

葡萄糖13    硝酸钠2.5    酵母膏0.8    磷酸二氢钾0.8

水840

接种量为一级种子：二级种子培养基＝8％，将一级种子接入灭菌后的二级种子培养液经过培养制成二级种子，二级种子的制备过程中的工艺条件是PH值为7.1，通风量0.25vvm，搅拌转速为200转/分钟，培养温度为37℃，培养周期为18小时。