抑制GATA－3基因表达的小干扰RNA及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了抑制GATA－3基因表达的小干扰RNA及其编码基因与应用。其目的是提供抑制GATA－3基因表达的小干扰RNA及其编码基因与其在制备变应性鼻炎治疗性药物中的应用。该抑制GATA－3基因表达的小干扰RNA是下述1)和2)中的至少一个双链RNA序列：1)正义链具有序列表中序列1的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列2的核苷酸序列；2)正义链具有序列表中序列3的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列4的核苷酸序列。本发明将在制备以抑制GATA－3基因表达的小干扰RNA或携带所述抑制GATA－3基因表达的小干扰RNA编码基因的表达载体为活性成分的药物中发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及小干扰RNA及其编码基因与应用，特别是涉及抑制GATA-3基因表达的小干扰RNA及其编码基因与其在制备变应性鼻炎治疗性药物中的应用。

背景技术

变应性鼻炎严重影响人们的生活质量，且全球发病率呈逐年上升趋势。传统的抗组胺药、糖皮质激素和白三烯拮抗剂等药物对该病虽具有一定的疗效，但需长期服用。随着变应性鼻炎发病机制的研究不断深入，研究人员发现变应性鼻炎是由于Th1/Th2细胞和细胞因子调节失衡所致，其中，GATA-3是一个位于Th2免疫网络中心位置的关键转录因子，它通过刺激Th2细胞的过度极化引发鼻黏膜的炎症反应(Pai SY，TruittML，Ho IC.GATA-3 deficiency abrogates the development and maintenance of Thelper type 2 cell.Proc Narl Acad Sci USA.2004；101(7)：1993-8.)。

RNA干扰技术(RNA interference，简称RNAi)是在小双链RNA(dsRNA)分子的介导下特异性降解靶基因的生物技术，能使基因表达沉默，达到拮抗靶基因功能的作用，因而，具有很好的生物(基因)治疗潜力。长度为21-22nt的小干扰RNA(siRNA，small interfering RNA)介导特异性干扰反应，只降解与其长度互补的特定基因的mRNA(Elbashir，S.M.，Harborth，J.，Lendeckel，W.et al.，Duplexes of21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells，Nature，2001，411(6836)：494)。RNAi技术因其在疾病治疗方面具有巨大潜力而备受关注。RNA干扰技术为系统地抑制RNA分子合成蛋白提供了快速而相对简便的途径，从而为疾病的防治提供了重要思路。因此，通过探索在mRNA的修饰或翻译水平上抑制Th2特异性转录因子GATA-3基因的表达，可以为探索变应性鼻炎药物治疗的方向开拓新的思路。

发明内容

本发明的目的是提供载体靶向的抑制GATA-3基因表达的小干扰RNA。

本发明所提供的抑制GATA-3基因表达的小干扰RNA，是下述双链RNA序列之一：

1)正义链为序列表中的序列1，反义链为序列表中的序列2的双链RNA序列；

2)正义链为序列表中的序列3，反义链为序列表中的序列4的双链RNA序列。将具有1)的双链RNA序列命名为siRNA-1，其反义链与GATA-3基因mRNA的第338-358位置序列5’-AACAUCGAUGGUCAAGGCAAC-3’互补。序列表中序列1由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列2由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

将具有2)的双链RNA序列命名为siRNA-2，其反义链与GATA-3基因mRNA的第717-737位置序列5’-AAGAUGAGAAAGAGUGCCUCA-3’确定互补。序列表中序列3由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列4由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

上述抑制GATA-3基因表达的小干扰RNA分子的编码基因可具有下述1)和2)中至少一个双链核苷酸序列：

1)有义链(正义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中序列5的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中序列6的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

2)有义链(正义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中序列7的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中序列8的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

将具有1)的双链寡核苷酸序列编码基因命名为siDNA1，编码siRNA-1。序列表中序列5由63个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列6由63个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。

将具有2)的双链寡核苷酸序列编码基因命名为siDNA2，编码siRNA-2。序列表中序列7由64个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列8由64个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。

含有上述抑制GATA-3基因表达的小干扰RNA编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明提供了可对GATA-3基因的表达产生干扰效应的小干扰RNA。转染有本发明小干扰RNA编码基因的小鼠肥大细胞瘤细胞系(P815细胞)和小鼠脾T淋巴细胞中的GATA-3基因在mRNA和蛋白水平上的表达均得到显著抑制。本发明为GATA-3的功能研究奠定了基础，为进一步研究GATA-3在变应性鼻炎的致病机制中的作用提供了新的平台，同时也为预防和治疗变应性鼻炎及其相关疾病提供了新的思路和方法。本发明在变应性鼻炎的特异性预防和治疗中具有潜在的应用价值，特别是在制备以抑制GATA-3基因表达的小干扰RNA或携带所述抑制GATA-3基因表达的小干扰RNA编码基因的表达载体为活性成分的药物中将发挥重要作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为分别携带有siDNA1、siDNA2和siDNA3的重组质粒的BamH I和Hind III双酶切鉴定结果

图2为小鼠肥大细胞瘤细胞P815阳性转染细胞在荧光显微镜下的观察结果

图3为siRNA1、siRNA2和siRNA3阳性转染细胞中GATA-3靶基因在转录水平抑制效率的RT-PCR检测结果

图4为siRNA1、siRNA2和siRNA3阳性转染细胞中GATA-3靶基因在蛋白水平抑制效率的Western blot检测结果

图5为阳性转染T细胞极化前和极化后的显微镜观察结果

图6为siRNA1和siRNA2阳性转染极化T细胞中GATA-3靶基因在转录水平抑制效率的RT-PCR检测结果

图7为siRNA1和siRNA2阳性转染极化T细胞中GATA-3靶基因在蛋白水平抑制效率的Western blot检测结果

图8为干涉GATA-3基因的表达对T细胞Th2极化功能影响的RT-PCR检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由北京奥科合成。

实施例1、抑制GATA-3基因表达的小干扰RNA及其编码基因的设计与筛选

一、抑制GATA-3基因表达的小干扰RNA的设计

首先在GenBank上找到小鼠GATA-3基因的开放阅读框架全长(ORF，GenBank号：NM_008091)，针对选用的Ambion公司的载体pSilencer2.1U6neo，依照Elbashir的RNAi设计原则(Elbashir SM，Harborth J，Lendecke 1W，et al.Duplexes of21-nucleotide RNAs mediate RNA interference In culturedMammalian cells.Nature.2001；411：494-498.)，同时通过

http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmL在线设计，最终选择3个靶位，分别位于GATA-3基因mRNA序列转录起始位点aug下游的3段长度均为21bp的序列，将获得的3对抑制GATA-3蛋白基因表达的小干扰RNA分别命名为siRNA-1(序列表中序列1和序列2)、siRNA-2(序列表中序列3和序列4)和siRNA-3(序列表中序列9和序列10)，siRNA-1作用于GATA-3mRNA的第338-358位置序列

5’-aacaucgauggucaaggcaac-3’，siRNA-2作用于GATA-3mRNA的第717-737位置序列5’-aagaugagaaagagugccuca-3’，siRNA-3作用于GATA-3mRNA的第1232-1252位置序列5’-agucaggggucuguuaauauu-3’。

二、抑制GATA-3基因表达的RNAi干扰载体的构建

1、根据siRNA-1、siRNA 2和siRNA-3所作用的靶序列以及载体pSilencer2.1U6neo(Ambion公司)的使用要求，设计能够产生siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3的siDNA序列，分别命名为siDNA1、siDNA2和siDNA3，具体序列如下(下划线碱基序列为针对GATA-3mRNA的靶序列)：

siDNA1正义链：

5’-gatccgcatcgatggtcaaggcaacttcaagagagttgccttgaccatcgatgttttttggaaa-3’(序列5)

siDNA1反义链：

3’-gcgtagctaccagttccgttgaagttctctcaacggaactggtagctacaaaaaaccttttcga-5’(序列6)

siDNA2正义链：

5’-gatccgatgagaaagagtgcctcattcaagagatgaggcactctttctcatcttttttggaaa-3’(序列7)

siDNA2反义链：

3’-gctactctttctcacggagtaagttctctactccgtgagaaagagtagaaaaaaccttttcga-5’(序列8)

siDNA3正义链：

5’-gatccgtattaacagacccctgactttcaagagaagtcaggggtctgttaatattttttggaaa-3’(序列11)

siDNA3反义链：

3’-gcataattgtctggggactgaaagttctcttcagtccccagacaattataaaaaaccttttcga-5’(序列12)。

2、将siDNA1、siDNA2和siDNA3的正义链和反义链两两退火后，再在T4 DNA连接酶作用下分别与经限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切的线性化载体pSilencer2.1U6 neo连接，将三种连接产物再分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性单克隆，提质粒，用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切鉴定，鉴定结果如图1所示(泳道M：DNA Marker DL15000，泳道1：酶切前的重组质粒，泳道2：双酶切后的重组质粒)，三种重组质粒酶切前的大小约为4500bp，经双酶切后显示出不同的条带，表明环状质粒经酶切后形成线性化的质粒，与预期结果相符，再对其用测序的方法做进一步鉴定，测序结果表明插入序列(siDNA1、siDNA2和siDNA3)正确，证明获得了插入序列及其位置均正确的分别以siRNA1、siRNA2和siRNA3为靶序列的GATA-3基因的RNAi载体，将以5’-aacaucgauggucaaggcaac-3’为靶序列的GATA-3基因的RNAi载体命名为pU6-sim1，将以5’-aagaugagaaagagugccuca-3’为靶序列的GATA-3基因的RNAi载体命名为pU6-sim2，将以

5’-agucaggggucuguuaauauu-3’为靶序列的GATA-3基因的RNAi载体命名为pU6-sim3。

三、利用小鼠肥大细胞瘤细胞系P815检测siRNA1、siRNA2和siRNA3对GATA-3基因的干扰效应

1、转染小鼠肥大细胞瘤细胞系P815

将步骤二分别针对siRNA1、siRNA2和siRNA3构建的RNAi载体pU6-sim1、pU6-sim2和pU6-sim3用脂质体介导法分别转染小鼠肥大细胞瘤细胞系P815细胞，阳性转染细胞表达有GFP绿色荧光蛋白，因而在荧光显微镜(蓝光照射)下可观察到绿色荧光，如图2所示(A为普通显微镜下转染细胞的观察结果，B为荧光显微镜下转染细胞的观察结果；放大倍数：200×)，对筛选到的阳性转染细胞用下述方法分析siRNA1、siRNA2和siRNA3对GATA-3基因的干扰效应。

2、siRNA1、siRNA2和siRNA3阳性转染细胞中GATA-3靶基因在转录水平抑制效率的RT-PCR检测

提取步骤1转染48小时后的阳性转染细胞的总RNA，同时以转染有来源于植物的一段不与GATA-3基因序列存在同源性的质粒片段(将pSilencer2.1U6 neo用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切后得到线性化质粒)的P815细胞和转染有pSilencer2.1U6neo空载体的P815细胞的总RNA作为阴性对照，在引物P1(上游引物)：

5’-cggcttcatcctcttctctg-3’和P2(下游引物)：5’-cagggatgacatgtgtctgg-3’的引导下用RT-PCR的方法检测分别转染有pU6-sim1、pU6-sim2和pU6-sim3的阳性转染细胞中GATA-3靶基因在转录水平的表达情况，以GAPDH基因为内参(检测用引物序列为：5’-acccagaagactgtggatgg-3’和5’-cttgctcagtgtccttgctg-3’)，PCR反应条件如表1所示，其中循环数分别设为23和25。

表1  RT-PCR反应条件

    PCR反应过程    温度    时间    预变性    94℃    5mins

    变性    94℃    45secs    退火    56℃    45secs    延伸    72℃    50secs    循环数    23、25    最后延伸    72℃    8mins

循环数分别为23和25的RT-PCR检测结果如图3所示(泳道M：DNA Marker DL2000，泳道1：siRNA1阳性转染细胞，泳道2：siRNA2阳性转染细胞，泳道3：siRNA3阳性转染细胞，泳道4：转染有来源于植物的一段不与GATA-3基因序列存在同源性的质粒的P815细胞，泳道5：转染有pSilencer2.1U6 neo空载体的P815细胞，从图3中不同循环数的连续扩增结果可以看出，siRNA1和siRNA2能够有效抑制GATA-3 mRNA的表达，其中以siRNA1的抑制效果最佳，而siRNA3不具有抑制效果。

3、siRNA1、siRNA2和siRNA3阳性转染细胞中GATA-3靶基因在蛋白水平抑制效率的Western blot检测

用Western blot方法再对siRNA1、siRNA2和siRNA3阳性转染细胞中GATA-3靶基因在蛋白水平抑制效率做进一步检测，以转染有来源于植物的一段不与GATA-3基因序列存在同源性的质粒(与步骤2相同)的P815细胞为阴性对照，所用一抗为GATA-3多克隆抗体(购自santa cruz公司)，二抗为HRP羊抗鼠IgG(Pierce公司)，同时以β-Actin蛋白为内参(检测用一抗为抗β-Actin的单克隆抗体(购自Santa Cruz公司)，二抗为HRP羊抗鼠IgG)。检测如图4所示(泳道1，2：siRNA1阳性转染细胞，泳道3，4：siRNA2阳性转染细胞，泳道5，6：siRNA3阳性转染细胞，泳道7，8：转染有来源于植物的一段不与GATA-3基因序列存在同源性的质粒的P815细胞)，从图4可以看出，siRNA1和siRNA2能够有效抑制靶蛋白GATA-3的表达，其中以siRNA1的抑制效果最佳，而siRNA3不具有抑制效果，与步骤2的检测结果一致，证明siRNA1和siRNA2为可抑制GATA-3基因表达的小干扰RNA。

四、利用小鼠脾T淋巴细胞检测siRNA1和siRNA2对GATA-3基因的干扰效应

1、转染小鼠脾T淋巴细胞及其极化培养

将RNAi载体pU6-sim1和pU6-sim2用脂质体介导法分别转染小鼠脾T淋巴细胞(简称T细胞)，6小时后筛选阳性转染T细胞，如图5中的图A所示(放大倍数：40×)，向培养基中添加20mg/mL刀豆蛋白A(ConA)，1000U/mL白细胞介素2(IL-2)，200U/mL白细胞介素4(IL-4)和1μM/mL鸡卵白蛋白(OVA)刺激阳性转染T细胞增殖并发生Th2极化，极化后24小时的T细胞如图5中的图B所示(放大倍数：200×)，经细胞因子刺激后，发生增殖和极化的T细胞呈现出串珠样聚集生长的状态，可以在体外培养生长5天。

2、siRNA1和siRNA2阳性转染极化T细胞中GATA-3靶基因在转录水平抑制效率的RT-PCR检测

提取步骤1中极化后48小时的阳性转染T细胞的总RNA，同时以极化后48小时的转染有来源于植物的一段不与GATA-3基因序列存在同源性的质粒(与步骤三相同)的T细胞和极化后48小时的T细胞的总RNA为对照，用与步骤三中相同的方法在引物P1和P2的引导下用RT-PCR的方法检测分别转染有pU6-sim1、pU6-sim2阳性转染极化T细胞中GATA-3靶基因在转录水平的表达情况，以GAPDH基因为内参。检测结果如图6所示(泳道M：DNA Marker DL2000，泳道1：极化后48小时的T细胞，泳道2：转染有来源于植物的一段不与GATA-3基因序列存在同源性的质粒的T细胞，泳道3：siRNA2阳性转染极化T细胞，泳道4：siRNA1阳性转染极化T细胞)，与步骤三中P815细胞系的RT-PCR检测结果一致，siRNA1和siRNA2均能够有效抑制GATA-3mRNA的表达，其中siRNA1的抑制效果更佳。

3、siRNA1阳性转染极化T细胞中GATA-3靶基因在蛋白水平抑制效率的Westernblot检测

用与步骤三中相同的Western blot方法再对极化后48小时的siRNA1阳性转染T细胞(以极化后48小时的转染有来源于植物的一段不与GATA-3基因序列存在同源性的质粒(与步骤三相同)的T细胞，极化后48小时的T细胞和未极化的T细胞为对照)中GATA-3靶基因在蛋白水平抑制效率做进一步检测，同时以β-Actin蛋白为内参。检测如图7所示(泳道1：极化后48小时的T细胞，泳道2：极化后48小时的转染有来源于植物的一段不与GATA-3基因序列存在同源性的质粒的T细胞，泳道3：siRNA1阳性转染极化T细胞，泳道4：未极化T细胞)，与步骤2的检测结果一致，siRNA1能够有效抑制靶蛋白GATA-3的表达。

4、RT-PCR检测干涉GATA-3基因的表达对T细胞Th2极化功能的影响

用RT-PCR方法检测步骤1获得的分别转染有pU6-sim1和pU6-sim2且发生Th2极化的T细胞中IL-5基因表达水平的变化，方法为：提取步骤1中极化后48小时的阳性转染T细胞的总RNA，同时以极化后48小时的转染有来源于植物的一段不与GATA-3基因序列存在同源性的质粒(与步骤三相同)的T细胞、极化前及极化后48小时的T细胞的总RNA为对照，检测IL-5基因的上、下游引物序列为：

5’-ATGACTGTGCCTCTGTGCCTGGAGC-3’和5’-CTGTTTTTCCTGGAGTAAACTGGGG-3’，以GAPDH基因为内参。检测结果如图8所示(泳道M：DNA Marker DL2000，泳道1：siRNA1阳性转染极化T细胞，泳道2：siRNA2阳性转染极化T细胞，泳道3：转染有来源于植物的一段不与GATA-3基因序列存在同源性的质粒的T细胞，泳道4：未极化T细胞，泳道5：极化后48小时的T细胞)，由图8可以看出，没有发生Th2极化的T细胞几乎不表达IL-5基因(泳道4)，极化后的T细胞IL 5基因表达(泳道5)，与转染有来源于植物的一段不与GATA-3基因序列存在同源性的质粒的T细胞(泳道3)相比，转染siRNA1、siRNA2的T细胞(泳道1和泳道2)IL-5基因的表达水平显著降低，证明了siRNA1和siRNA2通过下调GATA-3基因的表达进而影响了T细胞的Th2极化功能。

序列表

<160>12

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

aacaucgaug gucaaggcaa c                                              21

<210>2

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

guugccuuga ccaucgaugu u                                              21

<210>3

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

aagaugagaa agagugccuc a                                              21

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

ugaggcacuc uuucucaucu u                                              21

<210>5

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gatccgcatc gatggtcaag gcaacttcaa gagagttgcc ttgaccatcg atgttttttg    60

gaaa                                                                 64

<210>6

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gcgtagctac cagttccgtt gaagttctct caacggaact ggtagctaca aaaaaccttt    60

tcga                                                                 64

<210>7

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

gatccgatga gaaagagtgc ctcattcaag agatgaggca ctctttctca tcttttttgg    60

aaa                                                                  63

<210>8

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

gctactcttt ctcacggagt aagttctcta ctccgtgaga aagagtagaa aaaacctttt    60

cga                                                                  63

<210>9

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

aauauuaaca gaccccugac u                                              21

<210>10

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

agucaggggu cuguuaauau u                                              21

<210>11

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

gatccgtatt aacagacccc tgactttcaa gagaagtcag gggtctgtta atattttttg    60

gaaa                                                                 64

<210>12

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

gcataattgt ctggggactg aaagttctct tcagtcccca gacaattata aaaaaccttt    60

tcga                                                                 64