通过细胞巨团培养产生的细胞组织样组构和宏观组织样构建体以及巨团培养方法

摘要

描述了通过称作巨团培养的高细胞接种密度培养产生的三维组织样组构。通过巨团培养，可以在没有支架的帮助下使得细胞将它们自己组织成组织样形式，并且三维宏观组织样构建体可以全部由细胞形成。三维组织样组构和宏观组织样构建体可以由间充质源性成纤维细胞(至少)产生，其可以是分化细胞或者能产生多种效果的成体干细胞。在本发明中，组织样组构和宏观组织样构建体是由真皮成纤维细胞、脂肪基质细胞起源的生骨细胞、软骨细胞和造骨细胞形成。导致宏观组织形成的因素是以每单位面积或三维空间的高细胞接种密度的大规模培养，也就是大规模进行的巨团培养。对于组织产生，没有使用支架或外源基体，组织是全部细胞起源的。对于组织形成没有使用有助于组织形成的其它媒介(除了高细胞接种密度之外)，例如组织诱导化学品、组织诱导生长因子、特殊性质的基质、旋转式培养等。通过高细胞接种密度的巨团培养产生的组织样组构也可以在微观水平上产生。

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程学。具体地，本发明涉及细胞三维组织样组构的产生。更具体地，本发明涉及可植入人体中作为对病态或受损状况进行治疗的三维宏观组织样构建体。

背景技术

人体可以由于不同器官的病态或受损状况而受折磨，对其的一种治疗方法是使用外部获得或培养的组织等效物代替受损部分。例如，可以通过应用合适的皮肤等效物来处理皮肤烧伤或溃疡，可以通过移植合适的骨代替物来处理在断裂的骨头中的不一致的断口，可以通过合适的软骨生成培植来修复关节软骨的损坏。

每年，外科医生执行外科方法来治疗忍受器官衰竭或组织损失的病人。外科医生/内科医生可以通过从一个人到另一人移植器官，执行修复手术，或通过使用例如肾透析器、修复髋关节或机械心脏瓣膜的机械装置来治疗病人。尽管这些方法挽救了许多生命，但是它们也有局限性。例如心脏、肝和肾的器官移植的局限性不在于外科技术，而在于捐赠器官缺乏的可用性。

自然可用移植的可能种类包括从动物获得的异种移植物、从人类捐赠者获得的同种异体移植物和从病人本身健康部分获得的自体移植物。异种移植物具有免疫不相容性和包括逆转录酶病毒的传染病原体的传播的问题。同种异体移植物具有免疫排斥和难以得到捐赠者的问题。自体移植物具有所需合适组织的数量不足和增加病人损伤的问题。

对于外科修复，可以将组织从病人的一部分移到另一部分。这些自体移植物(来自病人的组织移植物)包括用于烧伤的皮肤移植物、心脏搭桥手术和用于面部及手部修复的神经移植。使用自体移植物的缺点也包括需要多次手术和移植区的功能损失。另外，外科修复经常涉及为了非最初计划的目的而使用身体组织，并且可以导致长期并发症。

由于现有治疗选择的这些缺陷，人们需要制造的组织等效物，并且组织工程学作为新学科出现了。其目标是在培养物中产生组织，其不仅用作基础研究的模型系统，而且更为重要地是用作对于损伤或病态身体部分的替代组织。尽管产生用于人类治疗的生物人工组织和器官的努力可以追溯到至少三十年前，但是这种努力只是在最近十年中接近临床上的成功。这些由于在分子和细胞生物学、细胞培养技术和材料科学的重大进步而变为可能。

术语“组织工程学”是相对新的，并且在最近五年中更广泛地用于描述为生物人工组织和器官的发展而应用工程学和生命科学原理的跨学科领域。

为实验室培养组织的产生而采用的主要策略之一是在三维模板或支架(基体)上并在使细胞生长为功能组织的条件下的单个细胞的生长。在移植时，此人工生物组织应变得在结构和功能上与身体结合为一体。基体可以由例如胶原质的自然物质或例如塑胶的人造聚合体形成。最后，支架材料随着时间的过去应是生物可降解的，并且用作组织生长的初始三维模板。

随着细胞在支架上生长和分化，它们会产生重造组织所需要的多种蛋白质。支架的分解保证只有自然组织保留在体内。也有不同种类的为了用细胞来构造组织的任务而结合了不同技术的生物反应器。

事实上，在身体中的每个组织都是生物工程学的潜在目标，并且在许多方向上快速发生进展。对于作为器官的皮肤，不同种类的制成替代物已经发展出来——采用几种不同的方法来重新制造皮肤已经获得不同程度地成功。

美国专利第5489304号说明了具有与来自真皮模拟层的胶原质——软骨素硫酸盐——相结合的人造外层的非细胞移植。在应用培养的上皮自体移植物之前，此替代物最初置于伤口上，其具有这样的缺点，它缺乏对于皮肤伤口愈合重要的生长因子或可以产生这些因子的细胞。

美国专利第5460939号说明了另一种的细胞移植。成纤维细胞在生物可再吸收的乳酸/羟基乙酸共聚物网中生长以形成薄片。在此移植中，支架网不是自然源的。

Eaglstein & Falanga(1997)说明了一种皮肤移植，其包括具有在牛胶原质基体中生长的成纤维细胞的真皮层。在此移植中，在外部将细胞外基体提供给细胞，尽管其制造人胶原质，但是在实施移植时外加组分保留下来。

美国专利第5613982号说明了一种的细胞移植，其中处理人类尸体皮肤以除去抗原细胞成分，留下免疫惰性真皮层。这种方法具有非细胞和人类尸体皮肤不易获得的局限性。

在以上所有的实例中，生产等效物的技术要求是相当复杂的，因此会增加产品成本。使用抗坏血酸盐的成纤维细胞的细胞片已经发展出来，但是这种片的形成需要大约35天(Michel等人，1999；L′Heureux等人，1998)。

因此，人们需要开发组织等效物，其材料可以容易得到，其没有可能导致在一些病人中发炎反应的人工或自然的外源基体，其是细胞的，从而它可以产生生长因子和其它蛋白质，其可以在相对较短时间中制备，并且其制备在技术上简单从而产品更有成本效益。

在制造的组织产品领域中需要注意的方面是对于骨折没有愈合留下不一致缺口的病人的骨替代物。自体骨移植增加病人的损伤。在骨工程学中正在试验不同的方法(Service，2000)。已经试验了注入可引起骨形成的生长因子的例如胶原质基体的生物材料，但是这种结构缺乏细胞成分，并且结合所要求的大量生长因子使其成为非常昂贵的选择。将间质干细胞种在陶瓷或羟磷灰石基体上是另外的方法，但是这种支架的使用对于人体可能不是理想的。因此，人们需要会导致骨愈合的有成本效益的细胞植入。

在制造的组织产品领域中要求注意的另一方面是软骨修复。关节软骨具有在受伤后有限的完全修复能力是公知的事实。自体软骨细胞移植的细胞基础疗法已经表现出良好的临床效果(McPherson & Tubo，2000)，但是由于完全修复时间非常长，仍有充足的改进空间。可能地，预先形成的组织比细胞悬浮液对移植有更好的效果。再者，预先形成的组织对于外科移植优于游离细胞。因此，人们正在使用细胞和支架来制造软骨样构建体中尝试不同的方法，但是在移植中允许细胞逼真仿制自然软骨形成过程的理想支架基本仍面临挑战(Ilim & Han，2000)。因此，人们需要在植入受伤点时可以有效地开始软骨修复的预先形成的组织，并且其也有成本效益。

总之，人们需要发展用于治疗目的的相对便宜的活细胞组织替代物。前面所提到的用于发展三维组织的技术复合生物反应器是昂贵的方法。另外，一般地，人们总是需要用新方法发展组织替代物，其在测试时会证明比现有替代物在一个或多个方面具有更好的性能。

注意到目前的需要，本发明的科学家已经发展出具有用作人体中组织替代物的潜力的新三维宏观组织样构建体。这些组织样构建体的新特性在于，对于组织生成不需要支架或外源基体，组织可以由完全细胞源形成。另外，没有使用有助于组织形成(除了高细胞接种密度之外)的其它媒介，例如组织诱导化学品、组织诱导生长因子、特殊性质的基质、旋转式培养。对于组织样结构形成不要求特殊复杂的培养基。导致宏观组织样结构形成的因素是在每单位面积或空间高细胞接种的细胞大规模培养。

组织工程学的关键方面是如何使细胞聚集到组织或三维结构中。本发明提供了实现它的新方法。

发明目的

依照上面所述，因而本发明的目的是提供使细胞聚集成三维组织样组构和组织样结构的新方法。

另外，依照上面所述，因而本发明的目的是提供用于治疗病态或受损状况可植入人体的三维宏观组织样构建体。

本发明的另一目的是提供在组织学上符合要求的宏观组织样构建体。在组织学上符合要求的意思是，这些组织样构建体可以无损坏地容易地分割。

本发明的再一目的是提供细胞的三维组织样组构和由间充质源性成纤维细胞(至少)组成的有成本效益的公认的组织等效物，例如由真皮成纤维细胞组成的公认真皮等效物、由脂肪基质细胞衍生的生骨细胞组成或由造骨细胞组成的具有骨样特性的公认替代物和由软骨细胞组成的用于软骨修复的公认替代物。本发明的相关目的是展示也提供其它组织的可能性，如果这些其它细胞类型具有使它们经历通过本发明所定义的巨团培养的组织样团形成的特性，通过本发明的方法其由相应类型细胞组成是可能的。

本发明的再一目的是提供细胞三维组织样组构和宏观组织样构建体而不使用支架或外部基体或用于组织生成的复合生物反应器。

本发明的再一目的是提供细胞三维组织样组构和宏观组织样构建体而不使用有助于组织形成的任何媒介，例如组织诱导化学品、组织诱导生长因子、特殊性质的基质、旋转式培养等。

本发明的再一目的是提供细胞三维组织样组构和不同种类的宏观组织样构建体，其是通过利用培养器皿的每单位面积或空间的高细胞接种密度而形成，而不使用有助于组织形成的任何其它媒介。

本发明的另一目的是提供在最终形态中具有高细胞密度的宏观组织样构建体。

本发明的另一目的是提供细胞三维组织样组构和宏观组织样构建体，其可以在不需要特殊复杂的培养基成分的条件下形成。

本发明的另一目的是提供细胞三维组织样组构和宏观组织样构建体，其特性可以通过在生长和/或组织形成培养基中合适变化来调制以包括期望的特性。

本发明的另一目的是提供细胞三维组织样组构和宏观组织样构建体，其可以依照要求在不同的相容生长表面上通过巨团培养来形成。

本发明的另一目的是提供宏观组织样构建体，其可以通过在它们形成所用的方法，也就是巨团培养，的二维中的简单放大来放大到更大的尺寸。

本发明的另一目的是在宏观水平上产生三维组织样组构。

发明内容

在本发明中，提供了用于通过巨团培养将细胞聚集成三维组织样组构的方法和巨团培养的新方法。提供了在组织学上符合要求的并且由细胞巨团培养产生的宏观三维组织样构建体。本发明涉及组织工程学。更具体地，本发明涉及可能植入人体中作为对病态或受损状况进行治疗的三维宏观组织样构建体的形成。本发明给出了细胞组构三维组织样形式的方法，并且描述了组织样形式本身。

组织的形成是人体中病态组织替代的重要目标。对于组织工程学，人们正在努力探索和复原细胞的组织形成能力。

细胞移植的组织工程学方法包括下面两个(2)主要步骤——

i.从合适的来源中得到细胞。得到的细胞可以要求例如分化的适当制备，变成期望的细胞类型。

ii.使用适当制备的细胞组成组织，以产生不同组织工程产品。

本发明专注于这些步骤中的第二步。发明人已经开发出简单并且有成本效益的细胞三维组织样组构生成和活细胞的公认组织替代物的形成的方法。

本发明的组织样构建体具有内聚强度以能够经受物理操作和处理，这是在合适的支持和处理装置或仪器的帮助下从拥有该构建体的器皿中并且如外科手术般地将其放在身体需要部位的步骤所要求的。

在基于支架的组织替代物的产生中已经做了大量的工作，其包括作为重要结构和通常功能成分的支架。此支架要求具有生物相容性和生物降解能力(从而最终只有自然组织保留在体内)以及提供对于最佳细胞功能的许可环境的特性。在各种可能方面都是理想的支架的开发仍面对着挑战。本发明的优点在于，它避开了引入支架的要求，因为本发明产生的三维组织样构建体在不借助于支架的情况下制成的。通过本发明巨团方法的在组织学上符合要求的组织样结构的形成不需要支架。因此，本发明的组织样构建体也消除了可能与在某一方面不太理想的支架的使用相关的任何不利影响和缺陷。在本发明中，细胞外基体是由细胞自己合成的，没有使用外源基体成分。组织形成是通过在培养器皿的每单位面积或空间高细胞密度接种细胞来简单地发生。这被称做“巨团”培养，其定义为用于细胞三维组织样形成或组构的培养系统，其中以培养器皿的每单位面积或空间高密度接种细胞，其范围是达到大约10⁶个细胞每cm²，并且不需要有助于组织形成的任何其它媒介。巨团培养的更广泛的定义是由细胞产生宏观或微观的三维组织样组构的方法，其通过高密度细胞接种，将细胞在三维空间中依照一定有利范围内的细胞高密度紧密地放置，这有利于细胞粘着合为三维组织样状态，并且不需要有助于组织形成的任何其它媒介。在确定的空间中需要达到在有利范围内的细胞的一定高接种密度。在有利高细胞接种密度的巨团范围内，当将细胞一起放置在培养器皿底部由细胞占据的三维空间中时，它们变为互相紧密接近状态，这样引发或激发细胞进入组织形成模式，由此它们变得粘为一体。(可以说明的是，细胞接种密度的巨团范围可以在具有水平或弯曲底部的器皿中达到)。使用直径约为0.75cm或更大的培养器皿的结果是宏观的三维组织样结构的形成，其中“宏观”意思是，组织的大小至少是这样的，它可以由正常人类肉眼容易地在视觉上辨别出来。

作为以前公知的组织培养系统，高密度巨团培养已经用于细胞的软骨细胞分化，并且这种培养的规模限制到10到20μl的点滴的细胞悬浮液(Yoon等人，2000)。传统地，当按照巨团培养在生物体外培养肢芽间质细胞时，其经历前软骨浓缩或聚集的形成，作为覆盖巨团点滴区域的个体小结出现(Ahrens等人，1977)。因而形成的细胞结互相分离，没有形成到小结中的细胞分布其间，并且是用显微镜可见的。如同下文提及的，需要将例如生长因子的特定成分添加到培养基中产生更大的但是微观的球状结构，其中所有的细胞聚集在一起形成一集合体。但是，本发明产生的组织样团是宏观的(并且不使用有助于组织形成的任何特定媒介)，并且从而拥有具有作为人体组织替代品的潜力所要求的理想质量大小。在通过本发明巨团培养的组织样组构中，所有细胞变为完整组织样组构的一部分，从而其为一整体；没有个体小结。人们以前发现，通过巨团培养，胫前软骨间质细胞产生小结式样(Downie & Newman，1994)。尽管通过巨团培养翅前软骨间质细胞产生片状式样；这是在无血清培养系统中，不同于本发明的巨团培养系统。另外，胫前软骨间质细胞可以产生片样式样，但这是基于在无血清培养基中的TGFβ1，也不同于巨团培养，其中对于组织样片形成不需要有助于组织形成的任何特定媒介并且不需要无血清条件。

至今，通过高细胞接种密度培养而不使用有助于组织形成的任何特定媒介，细胞与细胞聚集导致整个组织样团形成是否会发生的问题仍没有得到研究。但是，本发明人的工作已经说明这个问题，并且本发明给出了肯定的回答。

高密度培养已经用于通过微观个体小结形成来促进软骨形成，但是还没有在更大的宏观规模上对于用于人体组织替代物的宏观组织的产生进行评估。并且甚至在微观规模上，如上所述，只有在特定媒介帮助下才可形成整个集合体，不同于本发明的巨团培养。

尽管术语“巨团”初看起来意思是“微团”的纯粹扩充，事实上它在重要方面是不同的，微团已经发展为用于细胞的软骨细胞分化方法，并且也包括甚至对于微观整体球状集合体形成的特定复杂培养基要求(如下所述)，而巨团是细胞的三维组织样组构和宏观组织样构建体的形成而没有对于形成的特定复杂培养基要求的方法。

时至今日，人们已经向细胞聚集的发展做出努力，其结果是称为微团的球状体。球状体是在有助于组织样形成的多种媒介的帮助下由肝实质细胞和其它细胞组成的三维细胞结构，例如无附着器皿(Takezawa等人，1993)，转瓶培养(Abu-Absi等人，2002)，例如Eudragit的聚合物(Yamada等人，1998)，Matrigel(Lang等人，2001)，Primarias器皿(Hamamoto等人，1998)，poly-D-Lysine镀膜器皿(Hamamoto等人，1998)，蛋白多糖镀膜(Shinji等人，1988)，培养基流(Pollok等人，1998)，旋转式培养(Furukawa等人，2001)，液体覆盖技术(Davies等人，2002)，例如胰岛素、地塞米松和成纤维细胞生长因子的因子增强细胞与细胞粘附力(Furukawa等人，2001)，诱导聚集聚合缩氨酸配对(Baldwin & Saltzman，2001)，旋转壁生物反应器(Baldwin & Saltzman，2001)等。不同于这些球状体，在我们的操作中组织团是在没有有助于组织样形成的任何这种媒介帮助下产生的。上述球状体小得多，主要是在微米或亚毫米的范围中。由于通过本发明所述的巨团培养可形成宏观组织团是，它们用于放置在人体中需要的部位，具有明显优于球状体的优点。

本发明人在公开文献中所发现的最大球状体(直径约1mm)是通过高密度小球培养的(Mackay等人，1998)。它们的形成是在无血清指定培养基存在下发生的，该培养基包括TGF-β3、地塞米松、抗坏血酸盐2-磷酸盐和胰岛素-铁传递蛋白-硒添加剂，然而这种无血清指定培养基对于通过巨团培养的组织组构是不需要的。在前述报告中采用骨髓导出间质祖细胞的小球培养，我们发现球状集合体形成没有在DMEM+10％FCS培育的小球中发生(Johnstone等人，1998)，而由巨团培养的组织样构建体在DMEM+10％FCS形成。通过多潜能间质细胞的微团培养的球状体形成已经公开；这里球状聚集体形成的发生仅基于用TGFβ1或牛骨提取物的微团培养处理(Denker等人，1995)。据报告微观骨细胞球状体在包含TGFβ1的无血清培养基存在下形成(Kale等人，2000；美国专利申请第20020127711号)，并且据报告在此方法中在没有血清以及有TGFβ1的条件下的细胞培养对于骨细胞球状体形成是必要的。在上述文献中，说明了对于球状体形成优选大约1×10³细胞/cm²到1×10⁶细胞/cm²的密度。除了与上述文献区别的本发明组织样结构的其它特征，即是宏观的，对于形成不需要无血清并且不需要TGFβ1，优选接种密度范围也是不同的。在我们的发明中，组织样构建体不发生在1×10⁵细胞/cm²或以下，而上述发明的1×10³细胞/cm²低了100倍。骨胚胎干细胞的细胞聚合体或结已经形成(Buttery等人，2001)，但是，这些结是微观的并且不是由本发明所述的高细胞密度培养形成的。可在大规模进行时由巨团培养产生的本发明组织团是宏观的，因而大小远大于已经发展出来的任何球状体，并且对于形成没有这种特定复杂培养基要求。例如DMEM+10％FCS的简单培养基对于巨团培养的组织样结构形成是足够的。细胞的粘性栓以前是由软骨细胞形成(美国专利第5,723,331号)，但是具有阻碍细胞附着从而使细胞失去固定位置的表面的预成形孔是对于它的关键要求，然而，在本发明中，对于组织样构建体形成不需要这种表面。

在本发明的一实施例中，组织样片是由人类真皮成纤维细胞形成为潜在真皮替代物。由于众所周知，人类真皮成纤维细胞在移植到同种异体接受者时是相对不产生免疫性的(美国专利第5460939号)，真皮成纤维细胞可以是同种异体源.此组织样片具有作为真皮等效物的潜能，其材料容易得到，其没有可能在一些病人中导致发炎反应的人工或自然外源基体，其是细胞的，从而它可以产生生长因子或其它蛋白质，其可以在相对短的时间中制备，其制备在技术上是简单的，从而产品更有成本效益。

在本发明的另一实施例中，通过巨团培养，从脂肪基质细胞源生骨细胞产生具有骨样性质的组织样团，其作为公认组织替代物可以具有致使在骨折中小的不一致缺口的愈合的潜能。这可以成为可能的自体疗法。此组织样团可以具有成本效益的细胞移植的潜能，而不用外源支架，其可以致使在骨中小缺口的愈合。在本发明中，组织样构建体也由骨源造骨细胞制备。

在本发明的又一实施例中，组织样片是由人类软骨细胞生长出来，作为对有关节软骨损伤的病人的公认移植诱导软骨修复。由于软骨细胞可以从软骨的小型活组织检查中得到，自体软骨细胞可以用于此组织疗法。此组织样片可具有成为预制组织的潜能，其当移植到受伤处时可以有效地诱导软骨修复，并且其有成本效益。

在本发明的另外实施例中，由巨团培养在海绵胶中产生微观三维组织样组构。

总之，由巨团培养产生的本发明组织样构建体可具有成为活的、细胞的组织替代物的潜能，其不需要支架和外源细胞外基体，并且其在技术上简单可行，因此有成本效益。详细描述为治疗目的的本发明组织样结构也可以同时发现其它用途，例如在试管中药物测试等。

6.附图说明

在附图中进一步说明本发明的优选实施例，说明如下——

图1，图片表示在3.5cm器皿中通过巨团培养由(a)真皮成纤维细胞(b)脂肪基质细胞(c)软骨细胞(d)造骨细胞形成的宏观组织样结构。

图2，细胞与细胞粘附作用导致在脂肪基质细胞巨团培养中发生的组织样结构形成(a)在巨团培养开始之后一小时(b)在巨团培养开始之后六小时。

图3，由真皮成纤维细胞巨团培养形成的组织片的组织学检验(a)苏木精和曙红着色表示三维组构(b)Masson-Trichome着色表示胶原质合成。

图4，由来自脂肪基质细胞的生骨细胞的巨团培养形成的组织样构建体的组织学检验(a)苏木精和曙红着色表示三维组构(b)Masson-Trichome着色。

图5，由软骨细胞的巨团培养形成的组织样结构的组织学检验(a)苏木精和曙红着色表示三维组构(b)Masson-Trichome着色。

图6，由真皮成纤维细胞形成的组织样构建体的组织切片的胶原质类型I免疫着色，表示胶原质类型I的阳性检测。

图7，用于评估存活能力的通过巨团培养的由真皮成纤维细胞形成的分离组织片再生的细胞。

图8，用Reverse Transcriptase-PCR化验，通过巨团培养由真皮成纤维细胞形成的组织片的基因表达分析。对应公知对于皮肤伤口愈合重要的不同基因的RT-PCR产品电泳化地表现在2％琼脂糖胶上(M)DNA分子大小标记(1)胶原质类型I(2)Syndecan 2(3)Tenascin-C(4)脉管内皮生长因子(5)胶原质类型III(6)Fibronectin(7)角化细胞生长因子(8)转化生长因子1β。

图9，由来自脂肪基质细胞的生骨细胞形成的组织样构建体中的基因表达。RT-PCR产品电泳化地表现在2％琼脂糖胶上(M)DNA分子大小标记(1)胶原质类型I(2)Osteopontin(3)副甲状腺激素受体(4)骨形态蛋白2(5)骨形态蛋白质4(6)骨形态蛋白质受体IA(7)骨形态蛋白质受体IB。

图10，由软骨细胞形成的组织样构建体中的基因表达。RT-PCR产品电泳化地表现在2％琼脂糖胶上(M)DNA分子大小标记(1)Aggrecan(2)胶原质类型II(3)胶原质类型X。

图11，在条件性生骨培养基存在下由来自脂肪基质细胞的生骨细胞形成的组织样构建体中的组织学分析，表示(a)在组织样构建体中病灶真骨形成(Masson-Trichome)以及(b)病灶钙沉积(Von Kossa)，证明了由巨团培养形成的组织样构建体的特性可以由培养基中的变化来调节。

图12，在(a)DMEM+10％FCS(b)软骨形成培养基存在下，由软骨细胞形成的组织样构建体的组织切片(甲苯胺蓝着色)，表示在(b)中特定软骨细胞外基体的形成，证明了由巨团培养形成的组织样构建体的特性可以由培养基中的变化来调节。

图13，由真皮成纤维细胞和胶原质+血纤维蛋白胶形成的组织样片组成的合成物的组织切片(Masson-Trichome着色)，证明了由巨团培养形成的组织样组构可以作为物体的成分。

图14，在海绵胶中巨团培养的组织切片(苏木精和曙红着色)，表示形成的微观三维组织样组构群。

在下面部分中将更详细地说明本发明的其它多方面。

7.材料和方法

本发明的发明人阐明了，在本发明的整个说明全文和附加的权利要求中，尽管培养器皿的面积是按照圆形培养器皿的直径来表示的，所述的方面实际上包括任何形状的培养器皿，其面积与所述直径的圆形器皿相同。再者，尽管在此说明书中所述的操作涉及具有平底的器皿，巨团培养可以在具有平底或非平底部的培养器皿中实现。

7.1.细胞分离、培养基和培养——

在本发明中，人类真皮成纤维细胞是从人类皮肤活组织检查中分离。通过用Dispase处理将真皮与表皮分开(Sigma，St.Louis，美国)。

将真皮切碎并用0.01％胶原酶在DMEM+10％FCS中过夜消化，然后使细胞附着。将细胞在37℃的DMEM+10％FCS中并在5％CO₂中培养，并用胰岛素-EDTA溶液继代培养。依照Zuk等人(2001)描述的方案，从人类吸脂物质中分离脂肪基质细胞。这些细胞保留在DMEM+10％FCS中。依照Zuk等人(2001)描述的方案，诱导这些细胞生骨分化。在DMEM+10％FCS的维持培养基中培育之前，通过切碎软骨并用胶原酶处理，将软骨细胞从人类软骨碎片中分离。通过类似步骤将造骨细胞从人骨中分离并且保留在含有50μg/ml的抗坏血酸维生素C的DMEM+10％FCS中。条件性生骨培养基是通过使用其中生长有生骨脂肪基质细胞的培养基作为生骨培养基的组成部分而制备的，该培养基用于相同细胞的继代培养。依照Zuk等人(2001)制备软骨形成培养基。

7.2.组织样构建体的形成

通过巨团培养实现组织样构建体的形成，是前面在本发明的说明书中所定义的本发明的新方法。

培养的细胞是用胰岛素-EDTA收获的。它们在适当量的培养基中重新悬浮并优选在孔直径3.5cm的培养器皿中以大约10⁶细胞每cm²的接种密度或在巨团有利范围内的组织形成细胞密度来接种。因此，优选地，为形成单个组织，在六孔板(9.6cm²面积)的单个孔中接种总计10⁷细胞。对于更小或更大的组织样构建体，调整接种的细胞总数从而达到对于组织样组构的有利接种密度。

7.3.组织学分析

在形成后，将组织样构建体固定并处理以进行组织学检验。依照Zuk等人(2001)和Bancroft等人(1994)所述方法，在本发明的合适组织构建体上进行Von Kossa着色和Alcian蓝着色。通过Bancroft等人(1994)所述方法进行油红O着色。甲苯胺蓝着色按如下进行——在切片的去石蜡作用和水合作用后，它们在2％甲苯胺蓝水溶液中着色1分钟，然后在水中洗2-3分钟。其后切片在2次更换的100％丙酮中进行脱水，然后在二甲苯中清洗并放好。

7.4.免疫组织化学——

使用羊抗胶原质类型I的抗体和Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，USA的ABC着色系统在石蜡包埋的组织的切片上进行胶原质类型I免疫着色。

7.5.在形成的组织样构建体中细胞的存活能力——

将本发明的组织团切碎，用0.5mg/ml胶原酶在无血清DMEM消化15分钟，并且将释放出的细胞重新悬浮在生长培养基中。用台盼蓝着色等分试样。将细胞接种在培养瓶中以评估存活能力。

7.6.基因表达分析

用Reverse Transcriptase-PCR分析在由真皮成纤维细胞、生骨脂肪基质细胞和软骨细胞形成的组织样构建体中的基因表达。运用Trizol(Gibco-BRL，Grand Island，USA)组织样构建体中提取RNA。应用特用于各自基因的引物和Titan One-Tube RT-PCR系统(Roche，Mannheim，Germany)进行RT-PCR。

7.7胶原质+血纤维蛋白胶制备——

对于胶原质+血纤维蛋白胶的制备，将134μl的在0.1N乙酸中的3.33mg/ml鼠尾胶原质类型I(Sigma，St.Louis，USA)、8μl的4N NaOH、165μl的28.8mg/ml纤维蛋白原(在1X DMEM中)和210μl的1.48mg/ml凝血酶(在1.66X DMEM中)混合。将混合物在37℃下胶化2小时。

7.8在明胶海绵中通过巨团培养的组织形成

所用的海绵胶是AbGel(Sri Gopal Krishna Labs.Pvt.Ltd，Mumbai，India)。

8.结果和讨论

8.1.三维组织样组构和宏观组织样构建体的形成——

通过巨团培养，在DMEM+10％FCS的存在下由真皮成纤维细胞形成片状组织样团(图1)，该片状组织样团从生长面上自然地分离或通过用钝器具轻剥来分离。脂肪基质细胞也在DMEM+10％FCS中形成组织样团，其通过油红O着色对脂类是阴性的。由于如此，为从脂肪基质细胞中形成可用的组织，它们分化为生骨细胞，其通过巨团培养形成相似的片，该片可以在分离后在进一步培育中压缩为紧密团。从人软骨分离的软骨细胞在DMEM+10％FCS中巨团培养时也形成了这样的片。在洗去含有抗坏血酸维生素C的维持培养基之后，从人骨中分离的造骨细胞也通过在DMEM+10％FCS中巨团培养形成这种组织片。如图2所示，细胞的结合看起来在这种组织样构建体形成中起重要作用，如同从广泛的细胞和细胞结合延伸形成中所看到的。当通过在8.5cm佩氏培养皿中以所述接种密度来接种细胞扩大真皮成纤维细胞巨团培养时，形成更大的片。因此，表明巨团培养可以直接扩大范围以得到所希望的大组织。真皮成纤维细胞也通过巨团培养在无血清DMEM中形成片，但形成时间比在含有10％FCS的DMEM中多，在含血清培养基培养基中过夜相当于3-4小时。在含血清培养基培养基中，从真皮成纤维细胞、从源自它们的脂肪基质细胞和生骨细胞的组织形成时间是大约4小时，而从软骨细胞是大约18小时。当清洗细胞以除去含抗坏血酸维生素C的生骨培养基之后，源自脂肪基质细胞的生骨细胞在生骨培养基中和在DMEM+10％FCS中形成组织样团。已经在直径0.75cm到8.5cm的培养器皿中成功地实现了通过巨团培养的组织样构建体的产生。可以推断，在直径小于0.75cm和直径大于8.5cm的培养器皿中会分别导致更小或更大的组织样构建体的形成。因此，三维组织样构建体的大小可以改变。

尽管这些组织样构建体不是全部形成组织，它们可能能够以与下面的发现相似的方式诱导并参与身体的痊愈过程，即，完全干细胞(even stem cell)或部分分化细胞(其没有全部形成组织而是处于组织形成的刚刚开始)的移植可以导致修复和再生(Kaji和Leiden，2001)。

据发现，通过巨团培养的三维组织样团形成现象取决于细胞接种密度。为检验可否可在高密度下形成组织，将真皮成纤维细胞在每单位面积不同的细胞密度范围内接种。我们发现，实际片形成发生在3.33×10⁵细胞每cm²，而在6.66×10⁴细胞每cm²(小五倍)或更低的接种密度时，没有形成组织片。同样，组织片形成发生在3×10⁶细胞每cm²(小五倍)或更低的接种密度，而不是7×10⁶细胞每cm²或以上；在后者的接种密度下，细胞只是松散地丛生在一起，但没有形成粘合的组织团。因此，组织片形成发生在3.33×10⁵细胞每cm²和3×10⁶细胞每cm²以及位于该经过检验过的二者之间的的所有密度。在检验过的大于或低于此范围的密度，没有发生组织形成。用天然脂肪基质细胞和软骨细胞做类似试验，结果列于表1中。如同使用真皮成纤维细胞，对于这些细胞类型也有类似于真皮成纤维细胞的最小和最大组织样构建体形成接种密度。这些数据表明，对于通过巨团培养的组织形成存在最小和最大细胞接种密度每单位面积。通过巨团培养的组织形成的高细胞密度范围对于未检验的其它细胞类型可能是不同的。

如表1所示，使用的细胞的较低接种密度导致较薄组织样构建体，也就是，具有较小的三维，而使用的细胞的较高接种密度导致较厚组织样构建体，也就是，具有较大的三维。因此，三维组织样构建体的大小是可以变化的。

表1.三维组织样构建体形成对细胞接种密度的依赖

 每cm²覆盖的全部细胞  真皮成纤维细胞    脂肪基质细胞    软骨细胞  1.3×10⁴  6.0×10⁴  1×10⁵  3.0×10⁵  7×10⁵  1×10⁶  3×10⁶  7×10⁶  10×10⁶  -  -  -  +  +  +  +  -  -    -    -    -    +    +    +    +/-(附着力小)    -    -    -    -    -    +/-(非常弱)    +    +    +    -    -

8.2.组织学(图3，4，5)

本发明的不同组织样构建体的切片的苏木精和曙红着色表示三维结构的组构和细胞外基体形成。由真皮成纤维细以及天生基质细胞和生骨基质细胞形成的组织样构建体的Masson-Trichome着色表示胶原质合成。由真皮成纤维细胞培育10天形成的组织样构建体的胶原质类型I免疫着色表示对于胶原质类型I的阳性着色(图6)。因此，细胞外基体形成看起来正发生在通过巨团培养方法的组织样构建体形成中。

8.3.在形成的组织样构建体中细胞的存活能力——

通过台盼蓝着色从由真皮成纤维细胞和软骨细胞形成的组织中再分离的细胞具有大于98％的存活能力；来自由脂肪基质细胞形成的组织团的细胞是大约90％可存活的。覆盖分离的细胞和群以评估再生力，发现其在每种情况下是可存活的，如图7所示，其表明细胞从解离的真皮成纤维细胞组织片群中长出。

8.4.组织样构建体的表达分析——

为评估由真皮成纤维细胞形成的组织片是否具有作为真皮替代物的潜能，分析公知的在皮肤的伤口愈合中起重要作用的基因的表达(图8)。在组织片中发现表达胶原质类型I、胶原质类型III、角化细胞生长因子、TGFβ1、纤连蛋白、脉管内皮生长因子、tenascin-C和syndecan-2，因此证明了由真皮成纤维细胞形成的此组织样片具有作为真皮替代物的潜能。为评估由生骨脂肪基质细胞形成的组织片是否具有作为骨样替代物的潜能，分析特定骨表达基因的表达。发现组织样构建体表达胶原质类型I、osteopontin、副甲状腺激素受体、骨形态蛋白质2、骨形态蛋白质4、骨形态蛋白质受体IA、IB和II，因此证明了其除了下面提及的病灶钙化和实际骨针形成之外的骨样性质(图9)。类似地，评估由软骨细胞形成的组织样构建体作为软骨组织替代物的潜能。除了下面提及的特定软骨细胞外基体的形成以外，发现表达了特异软骨表达基因胶原质类型II、aggrecan和胶原质类型x，从而证明了其软骨样性质(图10)。

8.5.通过组织形成培养基的非固定性调节组织样构建体特性

在巨团培养中，通过包含合适培养基成分或通过改变培养基来制定形成的组织特性是可能的，这是由于，至今被证明，只要阻碍巨团组织样组构的东西没有含在培养基中，组织形成不依赖于培养基条件。从对于在含血清和无血清培养基中由真皮成纤维细胞形成组织片，以及对于在DMEM+FCS和包含地塞米松和β-甘油磷酸的生骨培养基中由脂肪基质细胞形成组织来看，这一点是明显的。因此，可以通过改变组织形成培养基和/或细胞生长培养基来调节形成的组织特性以包含理想的特性。例如，如同本发明所述，通过在条件性生骨培养基中培养细胞并形成组织样构建体，在由脂肪基质细胞形成的组织中诱导在实际骨形成的形状中的骨样特性，与在单独的生骨培养基相比，其中没有看到实际骨针(图11)。在条件性生骨培养基存在下由生骨基质细胞形成的组织团的Von Kossa着色表明了钙化的病灶区域，从而证明了骨样特性，而在非条件性的生骨培养基中由生骨基质细胞形成的组织构建体没有表现出这些特性。

这种调节的另一实例是在DMEM+10％FCS存在下或在含有1％FCS和胰岛素的软骨形成培养基存在下，由软骨细胞形成组织样构建体；并且TGFβ1作为软骨诱导剂。在由软骨形成培养基形成的组织样构建体中产生具有软骨表型的细胞外基体特征的性质，而由DMEM+10％FCS形成的没有这种性质。这由在图12中的甲苯胺蓝着色说明。因此，正如它表明的，由巨团培养的组织形成没有特定复杂培养基要求，这种特定成分可以用于在培养基中调节形成的组织的特性。组织样组构和宏观组织样构建体可以在不同培养基的存在下形成，这也符合上述结果，并且这里所述的不同培养基是例证，于此，本发明并不限制于这些例证。

8.6.对于巨团培养的生长表面——

由覆盖在塑料表面的细胞形成的组织样片具有自然分离和弯曲或卷起的倾向，因为片一旦卷起就不直，所以这是不希望的。现开发的可用用作真皮替代物的组织要求保持平直。对此，在放在塑料器皿中的Hybond-N(Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，UK)过滤器上进行真皮成纤维细胞的巨团培养。随着此改装，形成的片保持平直并且附着在过滤器上，所以，在将来，它可以过滤器在其上而应用到皮肤伤口。此实验证明了，通过在不同相容生长表面上巨团培养可实现组织形成。因此，这样，由巨团培养形成的片变为公认移植物的成分，其包含用作支持层的尼龙过滤器，并且它不需要用于细胞组织样组构的支架。此支持层并不计划与真皮样片一起结合到身体中，所以它不是会变为身体一部分的支架，而是对真皮样片应用的支持处理装置。此支持层在愈合后要除去。

8.7.作为目的物的成分的组织样构建体——

为证明组织样构建体可以引入变为(较大)目的物的成分或部分，接种真皮成纤维细胞，通过巨团培养形成组织样片，然后在除去培养基后，用胶原质和血纤维蛋白胶混合物覆盖它。然后可以放置该凝胶。现在，可以拿起凝胶并使组织样片附着在其一侧。图13表示此组合物的组织切片，其中组织样构建体是其成分。除凝胶和组织样片之外，例如海绵或膜的其它基体也可以通过附着组织样构建体从一侧支持它们。因此，组织样组构和宏观组织样构建体可以与不同物体组合，例如片或膜、凝胶、海绵或其它基体。

8.8.通过巨团培养的微观三维组织样组构——

将真皮成纤维细胞在DMEM+10％FCS中以约3×10⁶细胞每cm²海绵面积的接种密度接种在直径3.5cm的海绵胶上。如图14所示，如同在海绵的组织切片中所看到的，此对于海绵胶的高细胞接种密度巨团培养方法的应用导致在海绵中三维组织样组构的微观群的形成。因此，巨团培养方法也可以用于产生在微观水平上的细胞三维组织样组构，组织样组构变为整个集合体的成分。

9.结束语

如同在此说明中详述的，本发明的新颖性在于，高细胞接种密度培养可以产生细胞的完整三维组织样组构并且不需要有助于组织形成的任何媒介来诱导这种组构，并且扩大面积以产生不同种类的宏观三维组织样构建体，此外还在于其它重要特性，例如，不使用支架材料或者不需要有助于组织形成的特定媒介/复杂培养基配方。本发明的发明人第一个提出，完整三维组织样组构和不同种类的宏观三维组织样构建体可以仅靠高细胞接种密度培养产生。

其它中胚层细胞或者内皮或外胚层源细胞也可以通过巨团培养形成这种组织样组构是可能的。因此，通过巨团培养由任何类型哺乳动物细胞形成的组织样组构和宏观组织样构建体，如果它们是可能的话，是在本发明的范围内，其界定的特征是通过巨团培养方法实现的组织样组构。

尽管宏观组织样构建体是本发明的优选实施例，显然地，在培养面积上小于大约0.75cm直径的任何东西中，较小规模的巨团培养会产生较小组织样组构，随着巨团培养规模减小，其大小向微观减小。在上述形式或其它形式中，例如在前述海绵胶中，通过高细胞接种密度巨团培养的微观组织样组构也因此在本发明的范围内。同样地，组织样构建体可以在大于8.5cm直径的培养器皿中通过巨团培养产生。

因此，在前述中，已经说明了本发明的具体实施例；对于不同细胞类型的使用，选择的生长表面的使用，为调节形成的组织特性而改变培养基的使用，组织形成的扩大，培养器皿的大小，组织形成高细胞密度的范围，以及通过巨团培养形成的组织作为其成分的公认移植物的产生，已经给出实例说明。尽管仅提出了所描述的实施例，它们只是为了例证和说明的目的，并不限制本发明。

仍然应该理解，对于本发明可以进行不同的修改和替代，这是在本发明的范围内。例如，发明人预期到，一种这样的修改是将通过巨团培养形成的组织团封入或封装到合适凝胶或基体中，或者另一种这样的修改会是其中将多个组织团或片通过一些方法结合或保持在一起的一种构建体。在这样的构建体中，由巨团培养形成的组织样构建体现在会成为整个替代物的成分。上面是不同于在结果中所说明的方法，通过这些方法，由巨团培养产生的组织样组构和结构可以是目的物的成分。如同在结果中所述，正如其坚持的，由巨团培养产生的细胞组织样组构不需要任何支架并且组织学上符合要求的组织样构建体，也在没有支架的帮助下形成，可以提供支架用于巨团培养，例如，作为选择的生长表面，以至于支架变为整个替代物的部分。因此，本发明的三维组织样组构和组织学上符合要求的组织样构建体可以发展为无支架的，但是，如果支架能赋予比单独的组织样构建体有益的特性或优点，其也可以与合适支架组合。其它修改可能是使用具有通过巨团培养形成组织样团的特性的其它细胞类型，使用其它不同于所述的相容性生长表面，用于调节的其它培养基的变化和扩大的大小等。因此，本发明的此说明书不是通过所揭示的精确的例证性实施例来限制本发明。

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