均相多重筛选分析方法和试剂盒

摘要

用于多个可能的核酸靶的高度多重均相体外筛选分析方法，样品中可能存在所述核酸靶的任何一种，在该分析方法中采用了由一组荧光团组合编码的荧光杂交探针，将每一探针分成各部分，然后对每一部分进行不同的标记，这样当将各部分组合到一起时，每一探针就具有了一种独特的代码。该分析方法可以包括靶扩增和实时检测。包含其它分析试剂的探针组和试剂盒也可以用于实施上述筛选分析。

说明书

技术领域

本发明涉及体外均相多重分析方法，尤其包括均相扩增分析方法，以筛选生物样品中大量核酸序列中的任何一种的存在。

背景技术

现在已经有多种分析技术可以用于测定各种不同来源的生物样品中核酸序列的存在，其中上述核酸序列的存在指示着如特定的细菌、病毒或其它病原体，包括特定株系或变种的存在。上述分析也可以用于测定样品中测试对象自身基因组DNA的核酸序列的存在，该核酸序列的存在指示着例如某种或其它疾病-相关基因的突变的存在。分析包括带有可检测标记，例如P³²或荧光标记的寡核苷酸探针。可以直接探测到样品中的核酸，即DNA或RNA。可选择的，分析可以包括使用几种扩增技术的任意一种扩增靶序列，例如，PCR，NASBA或TMA。可以应用嵌入染料，如SYBR绿，或荧光标记的探针，如5’核酸酶探针(Livak，K.J.等，1995，Oligonucleotides with fluorescent Dyesat Opposite Ends Provide a Quenched Probe System Useful forDetecting PCR Product and Nucleic Acie Hybridization，PCRMeth.Appl.4：357-362)、二元FRET探针(Espy，M.J.等，2002，Detection of Vaccinia Virus，Herpes SimplexVirus，Varicella-Zoster Virus，and Bacillus anthracis byLightCycler Polymerase Chain Reaction afterAutoclaving：Implications for Biosafety of BioterrorismAgents，Mayo Clin.Proc.77：624-628)、或分子信标(beacon)探针(Tyagi，S.和Kramer，F.R.，1996，Molecular Beacons：Probes thatFluoresce upon Hybridization，Nature Biotechnol.14：303-308；Tyagi，S.等，1998，Multicolor Molecular Beacons for AlleleDiscrimination，Nature Biotechnol.16：49-53)。已经使用TaqMan二元-标记的线性探针和5’核酸酶检测方法，以及可选择的，使用PCR扩增和分子信标探针证明了用PCR扩增的实时多重分析，参见Tyagi.S等，1998，如上所述；Vet，J.A.等，1999，Multiplex Detection ofFour Pathogenic Retroviruses Using MolecularBeacons，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：6394-6399；El-Hajj，H.等，2001，Detection of Rifampin Resistance in Mycobacteriumtuberculosis in a Single Tube with MolecularBeacons，J.Clin.Microbiol.39：4131-4137。现在所使用的基于荧光的多重分析仅限于每个样品中大约8种靶序列，只有这样才能避免荧光团发射光谱的交叠，因此上述方法不能用于高度多重筛选分析。

高度多重分析依赖于靶的空间分隔，以便于分辨信号。空间分隔使得能够应用将不同颜色荧光团进行组合(组合编码)、将每种荧光团按不同量进行组合(比率编码)、和两者结合的编码方案。利用空间分隔的一种分析方法的实例是荧光原位杂交、或用于染色体分析的FISH。例如Speicher等，1996，Karyotyping Human Chromosomes byCombinatorial Multi-fluor FISH，Nature Genet.12：368-375，报道了一种用于染色体分布分析的方法，其中使用了27个由六个不同荧光团的组进行组合标记的探针。类似的，细胞核中转录位点的分隔同样使得能够应用组合编码以及比率编码，其中对于每个位点可以使用多重、单一标记的探针。Singer，R.H.，国际(PCT)专利申请WO 00/65094；Levsky，J.M.等，2002，Single-Cell Gene ExpressionProfiling，Science 297：836-840。另外一种空间-分隔探针技术是使用多重探针阵列，包括DNA芯片上的阵列。Schena，M.等，1995，Quantitative Monitoring of Gene Expression Patternswith aComplementary DNA Microarray，Science 20：467-470；Gingeras，T.R.等，1998，Simultaneous Genotyping and SpeciesIdentification Using Hybridization Pattern RecognitionAnalysis of Generic Mycobacterium DNA Arrays.Genet.Res.8：435-448；Han等，2001，Quantum-Dot-TaggedMicrobeads for Multiplexed Optical Coding ofBiomolecules，Nature Biotechnol.19，631-635。另外一种空间分隔技术是通过电泳将不同长度的连接探针对进行分离。Tong，A.K.等，2001，Combinatorial Fluorescence Energy Transfer Tags forMultiplex Biological Assays，Nature Biotechnol.19：756-759。在上述方法中，使用了寡核苷酸连接分析(“OLA”)的变化形式，用于SNP检测，过程是将带有不同标记的探针连接到捕获核酸靶的探针上，将杂交分子固定、洗涤、释放，并通过电泳使其彼此分离，然后读取每个探针的荧光代码，其是颜色和比例的组合。阵列方法和电泳方法在技术上是复杂的，需要许多单独的步骤，包括扩增、杂交、洗涤和分析。

虽然需要这样一种适用于高度多重筛选分析的技术，但是迄今为止还没有这样的均相荧光杂交分析技术。例如，在使用蛋白酶抑制剂抑制HIV-1病毒的过程中，随着处理时间的推移，可能增生出大约30种的突变，并且需要改变疗法。Hirsch，M.S.等(1998)，Antiretroviral Drug Resistance testing in Adults withHIV Infection，JAMA 279：1984-1991。在缺少高度多重筛选分析技术的情况下，现在的做法是随着患者的病毒负荷增加，对不同的病毒样本进行测序。但是因为所发生的突变不仅仅是存在的等位基因，因此通过测序进行分析是很困难。另外在对某个带有特定症状如发热的患者的最初诊断过程中，现在还没有可以利用的高度多重均相分析方法，以筛选出导致患者上述症状的多种可能的感染因素之一的早期指标。

本发明的一个方面是提供高度多重均相分析方法，用于筛选样品中核酸靶序列的存在，其中所述样品中存在至少10种和60种之多或更多的核酸靶序列，在所述的分析方法中可以使用常规的荧光检测仪器和技术，以及荧光标记的杂交探针。

本发明的另外一个方面是提供如下的筛选分析方法，其中应用靶扩增、任选应用实时检测，该筛选分析方法能够检测原本无菌的样品如血液中所存在的少量的病原体。

本发明的另外一个方面是提供用于实施本发明特定筛选分析的试剂盒和寡核苷酸组。

发明概述

根据本发明的分析方法是适用于筛选的高度多重分析方法。术语“高度多重”是指一种分析，其能够检测至少6种，优选至少10种，和在某些实施方案中30-60种，甚至更多种的靶序列。

根据本发明的分析方法是荧光标记的均相体外核酸分析方法，其中使用杂交探针。术语“均相”是指在溶液中实施对核酸靶的检测，不需要将核酸靶进行空间分隔，同时不需要洗去未结合的杂交探针。从反应混合物自身接受荧光信号。优选的实施方案包括靶扩增，通过例如PCR或NASBA，从而使之能够检测样品中的少量病原体。在扩增过程中，需要将反应容器如微量离心管进行热密封，以防止与其它同时测定的样品、未测定的样品、装置和工作者的相互污染。

在根据本发明的分析中，检测采用的是荧光标记的核酸杂交探针。荧光标记，当被激发时，能够发射出电磁波谱的可见、紫外或近红外部分。每种探针均特异于所筛选中的多个靶中的一个。如果分析和设计的目的是区分细菌物种，则可以设计针对细菌物种的探针，例如针对结核分枝杆菌保守区的探针，或设计杂交到同一细菌物种多个株的不相同序列的探针。另一方面，如果检测的目的是区分株系或突变等位基因，则可以设计针对可变区的探针，以提供必要的区别特征并使探针对株特异。本发明优选使用的探针是分子信标探针，这样可以根据分析的需要，使上述探针具有错配耐受性或错配不耐受性。正如本领域所公知的，在探针设计和选择靶序列上要寻求平衡，将假阳性和假阴性降至最小。

多重能力的取得依靠的是组合编码，加入或优选不加入比率编码，其中使用一组不同的荧光团。在组合代码中，每种代码元件通过自身不同标记的独特模式而加以鉴别，在本申请中是颜色。在组合代码中，一种代码元件可以包括每个代码元件最多四种不同的荧光团。上述不同的荧光团来源于具有至少四个不同荧光团的组，更优选的具有4-8个不同荧光团的组。组合代码可以是二元编码，其中代码元件包含两种颜色，任选地，其可以被由其中一种颜色组成的其它代码元件放大。组合代码可以是三元编码，其中代码元件包含三种颜色，任选地，其可以被由其中两种颜色组成的其它代码元件放大(即三元代码与二元代码的组合)，同时任选地，其可以被由其中一种颜色组成的代码元件放大。组合代码可以是四元编码，其中代码元件包含四种颜色，任选地，其可以被由其中三种颜色、二种颜色或一种颜色或其任意组合后形成的其它代码元件放大。

并非用多种颜色标记单个探针以使探针具有作为代码元件的模式，而是将每个探针细分为所需数目的部分，每一部分均经过标记以发射出不同的颜色信号。然后将上述各部分混合在一起形成一个探针，当该探针与靶杂交时，将会包括该代码元件所具有的独特的颜色模式。

对于最优选的淬灭探针，如分子信标探针，每部分均能够发射单色。对于较不优选的用两种不同的相互作用荧光团标记的探针，如5’-核酸酶探针，其中一种选择是利用一种共有的短波荧光团(在本申请中称为“接受”荧光团)，来改变长波荧光团(在本申请中称为“发射”荧光团)，并且检测后者的信号变化。在这种情况下，每一部分将发射出不同颜色的信号。另外一种选择正好相反，也就是说，利用共有的发射荧光团来改变接受荧光团，并且检测后者的信号变化。在这种情况下，每一部分也是发射出不同颜色的信号，但是对于编码目的来说，它是变成被检测的发射基团的接受基团。但是，第三种选择是同时改变上述两种荧光团，检测两者发射的变化比率，因此第一部分的信号可能是比率a/b，第二部分的比率可能是c/d，第三部分的比率可能是e/f，其中a，b，c，d，e和f是可以辨别的荧光团。在上述情况下，长波荧光团被改变，同时可以认为这种改变是从任意给定探针部分获得的信号的表征。为了便于理解，本申请和附图中的组合代码的描述大体描述了一些实施方案，其中人们可以检测每一探针部分所发射出的特定颜色，其中该特定颜色是发射荧光团的表征。应当理解的是，该教导同样适用于利用比率的实施方案，本领域技术人员能够将这些教导用于那些实施方案。

例如，如果由8种不同的荧光团的组开始，并且选择将每个探针细分为四部分，对四个部分用不同的颜色标记，则代码簿包括多至70种不同的组合；如果以相同大小的荧光团组开始，但将探针细分为三部分，对三个部分用不同的颜色标记，则包括多至56种不同的组合；如果以相同大小的荧光团组开始，但将探针细分为两部分，对两部分用不同的颜色标记，则包括多至28种不同的组合。由四种颜色、三种颜色和两种颜色组成的代码可以彼此组合使用，同时也可以与一种颜色的代码组合使用，但是，本发明最优选的实施方案不包括这样的组合。在比率编码中，用区分量的相同标记进行区别。本发明的组合代码可以用比率代码增强，比率代码优选是整数比率代码也就是如2∶1、3∶1、4∶1或5∶1的整数比率，反之亦然。优选的，分子信标探针的各个部分用非-荧光淬灭剂和单信号-颜色荧光团进行标记，最优选的，不加入比率编码，其中的原因将在下面给予解释。

如上所述，本发明的分析方法是均相检测分析方法。不需要将靶进行分隔。也不需要将未结合探针与结合靶的探针进行分离。因此在本发明的分析方法中，必须要有可检测的信号变化，这种变化指示着探针与靶的杂交。优选的分子信标探针，在测定方法中的检测温度下自由漂浮时是高度淬灭的，但是当与各自的靶杂交时却能够改变构象并发出荧光。另外还有一类探针，其荧光通过与其靶的杂交恢复，这种探针通常适用于本发明的分析，这种探针称为“阴-阳”探针，这是一种生物分子探针，在靶互补链上用荧光团标记，同时在竞争链上存在淬灭剂。Li，Q.等(2002)，A New Class of Homogeneous NucleicAcid Probes Based on Specific Displacement Hybridization，Nucleic Acids Res.30：e5。其它探针分析方案，导致荧光信号的改变，指示探针与靶杂交。在5’-核酸酶检测方法中，用两种不同的荧光团对线性(或随意盘绕)探针进行末端标记，在自由漂浮状态下，两种荧光团通过荧光共振能量转移(FRET)而相互作用，但是在聚合酶链式反应(PCR)扩增过程中，在引物延伸中被切断，从而导致信号改变(较短波长的荧光团发射量增大，较长波长的荧光团发射量降低，因此两者的比率发生变化)。Livak，K.J.等(1995)，如上所述。另外一种体系，称为LightCycler探针，其工作模式正相反。每种探针是一对荧光标记的线性寡核苷酸，在靶上的杂交是邻近的，可以通过FRET而相互作用，由此产生信号变化(较短波长的荧光团发射量降低，而较长波长的荧光团发射量增加，因此两者的比率发生变化)。Espy，M.J.等(2001)，如上所述。对于FRET体系，申请人将较短波长的荧光团称作“接受者”，将较长波长的荧光团称作“发射者”。然而，由于FRET淬灭过程所导致的背景信号显著高于接触-介导的淬灭过程(在使用分子信标探针和阴-阳探针时通常会采用接触-介导的淬灭过程)(Tyagi等，1998，如上所述；Marras，S.A.E.等，2002，Efficiencies ofFluorescence Resonance Energy Transfer and Contact-MediatedQuenching in Oligonucleotide Probes，Nucleic AcidsRes.30：e122)，因此本发明的筛选分析并不优选上述FRET淬灭过程。本发明的分析优选采用通过接触-介导淬灭过程进行淬灭的探针，如分子信标探针或阴-阳探针。本发明最优选的探针是包括非-荧光淬灭剂的分子信标探针。这些探针是最优选的，这不仅仅是因为其具有较低的背景信号，还因为它们对于应用到多元体系来说，在设计上是容易的。Bonnet，G.等(1998)，Thermodynamic Basis of the EnhancedSpecificity of Structured DNA Probes，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：6171-6176。

本发明的分析方法包括但不限于应用了靶扩增的实施方案。有几种指数扩增技术是公知的。其中之一是聚合酶链式反应(PCR)，其包括热循环、和等温扩增方案，如基于核酸序列的扩增(NASBA)、链-置换扩增(SDA)、转录-介导的扩增(TMA)、滚环扩增(RCA)和分枝扩增方法(RAM)。扩增分析的实施方案可以利用终点检测或实时检测。优选在如密封管的密封环境下和存在杂交探针的条件下实施扩增，以减少样品间交叉污染的可能性，一般在敞开的样品管中进行扩增会导致交叉污染。

虽然不限制样品来源，但根据本发明的分析方法优先使用人或动物样品，有时是指无菌的样品，如血液、组织或脑脊液。与如唾液、粪便或环境样品相比，上述样品具有一定的优点，因为上述样品所包含的可能潜在干扰扩增和检测的无关DNA序列更少。已知在患者血液中可以发现至少小量的一些病原体，即使在由于细菌感染导致的脓毒综合征中也是如此。在具体的筛选分析方法可以允许选择的情况下，优选使用正常的无菌来源，而不优选非-无菌来源。

根据本发明的某些扩增分析方法，有利地使用引物来扩增所有或一部分所要筛选的核酸靶。当筛选突变时，在特定的感兴趣的可变核酸序列内可能存在多个可能突变，使用位于该区域侧翼的一对引物可以扩增所有可能的突变。这些所谓的“通用引物”中的一些能够与多个物种的保守区结合，并且用于扩增多个靶，例如不同细菌的某些基因。参见如，Kox，L.F.F.等(1995)，PCR Assay Based on DNA Codingfor 16S rRNA for Detection and Identification of Mycobacteriain Clinical Samples.J.Clin.Microbiol.33：3225-3233；Iwen，P.C.等(1995)，Evaluation of Nucleic Acid-Based Test(PACE 2C)forSimultaneous detection of Chlamydia trachomatis and Neisseriagonorrhoeae in Endocervical Specimens，J.Clin.Microbiol.33：2587-2591；Yang，S.等(2002)，QuantitativeMultiprobe PCR Assay for Simultaneous Detection andIdentification to Species Level of BacterialPathogens，J.Clin.Microbiol.40：3449-3454；Schonhuber，W.等(2001)，Utilization of mRNA Sequences for BacterialIdentification，BMC Microbiol.1：2；Wong，R.S.和Chow，A.W.(2002)，Identification of Enteric Pathogens by HeatShock Protein 60kDa(HSP 60)Gene Sequences，FEMSMicrobiol.Lett.206：107-113。对于具体筛选分析，一对，更可能两对或三对引物是足够的。

本发明还包括用于实施本发明的特定多重筛选分析的分析试剂盒。试剂盒至少包括检测探针的互补序列。我们将寡核苷酸的集合称为“寡核苷酸组”。当分析是扩增分析，如PCR分析时，寡核苷酸组优选还包括扩增所需的引物。还可以包括任意的可扩增对照序列。试剂盒可以包括其它的分析试剂，如酶、扩增缓冲液和如果需要，包括用于分离核酸的样品制备试剂；也就是说，直至包括所有的实施上述分析，从样品制备一直到检测所需的试剂。

本发明的基于荧光的筛选分析一般要与检测仪器相适应，检测仪器有可能具有热循环能力。仪器可以使用单波长光源或多波长光源，例如白光与可选择滤光器的组合、多激光光源或多光发射二极管光源。检测仪器在区分多荧光团的发射光的能力方面是不同的，在选择用于具体分析的荧光团足时要充分考虑。在本发明分析方法的优选实施方案中，每个探针的荧光团的发射在强度上是平衡的，这样细分部分的强度是接近的，这样有利于鉴别。不同的荧光团在强度上是不同，不同的靶序列对于探针杂交的可接近性是不同的，仪器对不同波长的反应可能也是不同的。可以改变各部分的相对量以获得平衡。如果可能，优选探针的所有所有部分均是平衡的，以便于鉴别。上述分析的结果可以由计算机程序实时进行自动解码和编译，以保证分析的高度精确，并以临床诊断设置，以自动化、高通量方式进行。

结合附图和下面的说明书对本发明的一个或多个实施方案的详细内容进行说明。根据说明书和附图以及权利要求书，人们可以很清楚了解本发明所具有的其它的特征、目的和优点。

附图说明

图1是一个表，显示每个探针使用两种或三种颜色和一组4-8种可区分的荧光团所得到的可区分组合的数目。

图2显示实时扩增分析的荧光发射结果，其中表明在测试样品中存在单一靶序列(是所设计的分析中要检测的多个可能的靶序列中的一种)，和一种探针(用荧光强度相同的三种不同的颜色标记)，其是试验混合物中与扩增的靶序列结合的多个探针中的一种。

图3显示实时扩增分析的荧光发射结果，其中表明在测试样品中存在两种浓度不同的靶序列，以及两种与扩增靶的序列结合的探针(每一种探针是用荧光强度相同的三种不同颜色的不同组合进行标记的，两种探针没有相同的颜色)。

图4显示实时扩增分析的荧光发射结果，其中表明在测试样品中存在两种浓度不同的靶序列，以及两种与扩增靶的序列结合的探针(每一种探针是用荧光强度相同的三种不同颜色的不同组合进行标记的，两种探针具有一种相同的颜色)。

图5显示实时扩增分析的荧光发射结果，其中表明在测试样品中存在浓度相同的两种不同靶序列，两种探针(按照图6a所示的第一种三色代码簿进行标记)具有两种相同的颜色，导致结果的明确解释。

图6a和6b包含表，显示用于检测样品中十种不同的可能靶的可供选择的探针编码方案的影响，其中所采用的每一探针均是用荧光强度相同的三种不同的颜色进行标记的，选自五种不同的荧光团，所述影响是针对在测试样品中存在相同浓度的两种不同靶的情况下，45种组合中的每一种所获得的结果。

图7显示实时扩增分析的荧光发射结果，其中表明在测试样品中存在浓度相同的两种不同的靶序列，两种探针(按照图6a所示的第一种三色代码簿进行标记)具有一种相同的颜色，得到明确的结果。

图8显示实时扩增分析的荧光发射，其中利用按照图6b所示的第二种三色代码簿标记的探针重新检测图7所示分析中使用的相同样品，提供了利用替代性编码方案的第二种测定如何能够分辨明确的结果的例子。

发明详述

图1的表显示本发明所使用的某些组合编码方案。表的上部表示从4、5、6、7、或8种荧光团的组中选择两种不同的荧光团对每种探针进行不同的标记，所得到的代码数量。如果该组包括8种荧光团，则有28种可能的代码。表的下部表示从上述5、6、7或8荧光团的组中选择三种不同的荧光团对每种探针进行不同的标记，所得到的代码数量。如果该组包括8种荧光团，有56种可能性。根据本发明的分析，每种探针带有两种或三种(有时四种)不同标记的部分，并且一组荧光团的数目足以得到至少6种不同编码的探针。可以通过如下的实施方案实现，例如，将表的两部分组合起来，也就是同时使用两种颜色的代码和三种颜色的代码。例如，如表底部所列出的，可以将探针细分成三部分，用于五种荧光团的组，提供最多十种不同编码的探针，并且可以将另外的探针细分成两部分，用于五种荧光团的组，提供最多十种另外的不同编码的探针。通过上述方式，在同一分析混合物中组合了20种不同编码的探针。

根据本发明的分析对于一种靶采用一种探针(探针可以是单分子探针，如分子信标探针或TaqMan探针，或双分子探针，如阴-阳探针或LightCycler探针对)。除由单颜色表示的代码元件外，将探针细分成各部分，然后根据来自至少4种，优选5-8种可区分的荧光团组的组合代码或组合-加-比率代码，对上述各部分进行标记，从而完成编码。为了示例，使用我们优选的分子信标探针，探针的每一部分均设计为具有不同的颜色标志。某些探针也可以是波长-转换探针，也就是探针的一个臂标记有淬灭基团，而另外一个臂标记有FRET对，其中FRET对包含“接受”荧光团和“发射”荧光团，其中的“接受”荧光团吸收来自激发光源的能量并将能量转移给“发射”荧光团，当探针处于其开放构型时，“发射”荧光团在其自身的更长的特征性波长光谱强烈发射荧光。我们使用波长-转换探针时，所使用的仪器带有单波长光源，该光源不被发射更长波长的可见荧光的荧光团，例如德克萨斯红(Texas Red)高度吸收。参见Tyagi，S.等(2000)，Wavelength-Shifting Molecular Beacons，NatureBiotechnol.18:1191-1196；E1-Hajj，H.等(2001)，如上所述。另外也可以通过接触-介导的淬灭过程，利用一种荧光团淬灭另外一种荧光团。存在两种另外的可能性。第一种，在使用的体系中具有相对低的发射的荧光团可以被放置在每个臂上，以便当探针关闭时，荧光团彼此淬灭，但当探针杂交到靶上并且开放时，两者发射同样颜色的荧光，增加其强度。这项技术可以用于添加比率代码到组合代码中。第二种，在探针的两个臂上放置不同的荧光团，使探针的一部分携带两种代码元件(颜色)，这样当探针关闭时，荧光团彼此淬灭，但当探针杂交到靶上并且开放时，每一荧光团均发射出具有自身的特征性发射光谱的荧光。这可以用于将两部分组合为一部分，由此可以减少两种颜色、三种颜色或四种颜色代码元件所需的不同部分的数量。这相当于具有分离的部分。因为非-荧光淬灭剂的淬灭过程比荧光团的淬灭过程更加有效，还因为在同一分子中如果存在两种发射荧光团，则由于相对浓度的问题而无法实现强度平衡，因此，在本发明优选的实施方案中，在分子信标探针的一个臂上采用非-荧光淬灭剂。Dabcyl是一种优选的淬灭剂，代码为Black Hole Quencher No.2。

本发明的“代码簿”采用每个探针四种颜色，每个探针三种颜色，每个探针两种颜色，或每个探针四种、三种或两种颜色的组合，采用或不采用单-颜色探针。优选的代码簿是每个探针仅四种颜色，每个探针仅三种颜色或每个探针仅两种颜色。优选这些方案的理由是，在特定PCR循环中产生的一种颜色的表现，表明在分析制备物中存在一种错误。如果使用单-颜色探针，这样的错误就不明显。在本发明的一些实施方案中，可以用比率编码补充组合编码，以提高代码元件的数量或可能性。优选的比率是整数，从5∶1到1∶5，优选从3∶1到1∶3。比率编码最适用于以下筛选分析，其中极有可能只存在一种靶。原因是，当代码是严格意义上的组合代码并且存在两种或多种靶的情况下，强度水平的变化有助于解决在分析发射光谱过程中所存在的不确定性。因此，在不太可能只存在一种靶的优选分析中，使用严格意义上的组合代码。

在荧光团组中可以包括多种不同的荧光团。某些荧光团具有相对窄的发射光谱，例如，Vic，Alexa 488和量子点(quantum dots)(Gao等，2002，Quantum-Dot Nanocrystals for UltrasensitiveBiological Labelling and Multicolor OpticalEncoding，J.Biomed.Opt.7，523-537)，它们非常适用于采用六种以上荧光团的组的高度多重分析。

寡核苷酸探针，包括分子信标探针，可以通过固相DNA合成技术很容易地制备得到，例如，在Applied Biosystems 394 DNA/RNA合成仪上制备。可以使用DNA核苷酸或RNA核苷酸，包括修饰的核苷酸，如2’-O-甲基核糖核苷酸，由它所形成的链具有切割抗性。本发明合成分子信标的优选方法是从含有淬灭剂dabcyl的带有控制的孔的玻璃柱开始的，用于将dabcyl掺入到探针的3’末端。可以从BiosearchTechnologies(Novato，California，USA)购买上述柱子。在探针5’末端掺入荧光团的优选方法是利用硫醇修饰剂亚磷酰胺或氨基修饰剂亚磷酰胺，这样可以使碘乙酰化的荧光团衍生物偶联到5’-巯基上，使荧光团的琥珀酰亚胺酯偶联到5’-氨基上。对于四氯荧光素，我们的做法是直接掺入四氯荧光素亚磷酰胺。对于波长-转换探针，需要非-末端荧光团。出于上述目的，我们使用了荧光素亚磷酰胺，以掺入内部荧光素部分。我们的分子信标探针合成方法中包括探针纯化过程，该过程使用通过NAP-5 Sephadex柱的凝胶排阻层析，之后进行通过反相柱，如购买自Waters的C-18柱的HPLC。最后用乙醇沉淀探针，然后溶解在100μl的Tris-EDTA缓冲液中。分子信标探针所具有的信号/噪音比至少为25，优选接近100，需要记住，例如，对于三元代码来说，每种荧光团对于30-60％的探针是共有的。

正如上述所提到的，将探针细分为两部分、三部分或四部分，用于标记和使用。分析中一种探针的各个不同部分，如果可能，所有部分有利地产生大致相同的信号强度。因此，我们的优选的分析方法和试剂盒中，具有为此目的“平衡的”部分。术语“平衡的”是指由不同部分发出的荧光信号强度，彼此之间的差别一般在20％以内，最优选在5％以内。由具体探针部分，如分子信标探针部分产生的荧光强度，依赖于其发射荧光团所具有的固有特性(另外，如果是波长-转换分子信标探针，还依赖于它所具有的接受荧光团的固有特性)，以及靶的性质，因为有些靶比其它靶容易接受探针，并且在用于检测的仪器上非常可能接受探针。通过测试在所使用仪器上进行的分析中针对靶的探针，可以调节各部分之间的相对量，以产生平衡的信号。申请人进一步优选所有组合标记探针的所有部分均是平衡的。将每一探针的各个部分平衡之后，调节探针彼此间的相对量，以产生平衡的信号。不调节每个探针各部分的量，而是通过调节检测仪器以调节信号阅读，进而解决荧光团和仪器所存在的差异也是可行的。例如，如果具有标记为a、b、c的三部分的探针，等体积的每一部分分别产生1.0、1.5和3.0的相对强度，则可以将仪器程序化为“a”部分的读数乘3，“b”部分的读数乘2，c”部分的读数乘1。那么仅仅是探针的相对量需要平衡。然而，我优先调节部分量，而不是仪器。采用平衡的发射，可以使观察者显著更容易解释，因为可以立即看出例如三种颜色是否表明特定的代码元件。

根据本发明的分析方法是高度多重的。虽然不限定样品来源，但是本分析方法特别适用于来自人类或其它动物部位的，被认为是无菌的样品，如血液、组织和脑脊液。非-无菌样品，如痰或粪便，有可能含有多种来源的核酸，因而更难筛选。通常病原体以非常小的程度感染血流。但是对于核酸扩增分析来说，只要样品中存在极少量的靶序列就可以。例如，Kane等，采用“通用”细菌引物比较了血培养与PCR分析，以诊断严重患病的手术患者的细菌感染。Kane，T.D.等(1998)，The Detection of Microbial DNA in Blood：a Sensitive Methodfor Diagnosing Bacteremia and/or Bacterial Translocation inSurgical Patients.Ann.Surg.227：1-9。尽管只有14％的样品是血培养阳性的，PCR分析中64％为阳性。

对于采用扩增，如PCR或NASBA的实施方案，均需要各种靶的引物。引物设计在本领域是已知的。引物之间可以相互测试，然后用探针进行测试，以验证是否会发生不必要的相互反应。引物，以及探针(在更小的程度上)在多重反应中不发生相互作用是非常重要的。本发明所使用的一种具有高度特异性的引物已经公开在公开的国际专利申请WO00/71562中。上述引物形成发夹茎结构，可以显著减少不必要的杂交。我们通过利用上述高特异性的引物而减少了引物间的相互反应，注意保证茎的解链温度(T_m)比本分析所使用的引物退火温度高大约6℃。本发明构建了两对通用引物，共同扩增多个细菌物种所具有的16s核糖体RNA基因的片段。一对引物包括5’-TGACGACAACCATGCACC-3’(SEQ ID NO.1)和5’-ATGTGGTTTAATTCGAAGCAA-3’(SEQ ID NO.2)，扩增炭疽芽孢杆菌和相关革兰氏阳性细菌的靶区域。另外一对引物包括5’-GTGGACTTAGATACCCTGGTAGTCCAC-3’(SEQ ID NO.3)和5’-GCGTTGCATCGAATTAA-3’(SEQ ID NO.4)，扩增几种重要的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的靶区域。第三个鉴别探针中带有下划线的序列是形成发夹结构的序列，加入该序列可以减少不希望的引物的杂交反应。

可以在多种仪器上进行具有实时检测的扩增分析，该仪器利用不同的技术激发荧光团并检测发射。激发可以通过激光、带有滤光器的白光、或发光二极管。另外，分析仪器可以采用同步扫描模式，其中连续改变窄的激发和发射波长，而两者之间保持固定的波长差异。Lee等(1999)，Seven-Color，Homogeneous Detection of Six PCRProducts，Biotechniques 27，342-349。仪器的选择可能会影响到组中所包括的不同荧光团的数目。

本发明的筛选分析方法，包括但不限于，实时扩增分析，在靶可以由其独特的标志，优选其独特的颜色标志，但也可能由信号-加强度标志得到鉴定的情况下，可以是信号靶阳性的。有时在样品中存在两种或两种以上的靶。

在这样的情况下，译解光谱可以利用以下事实，即虽然探针的绝对荧光依赖于靶浓度，与同一靶杂交的两个探针部分的荧光比率却不依赖于靶的浓度。如果严格组合编码利用三色代码(其中各部分的强度得到平衡)，假定存在两种靶。如果靶没有相同的颜色，则得到六种颜色。然而，因为在样品中两种靶的浓度极不可能是相同的，因此对样品直接探测可能产生第一种强度的三种颜色和第二种强度的三种颜色，并由此鉴定出两种靶。另一方面，如果分析是实时扩增分析，在信号升高至高于背景时，例如PCR反应的阈循环(C_T)期间，有可能是存在区别的，这样会产生两组的三种颜色，两组之间信号升高的时间不同，由此鉴定出两种靶。

如果赋予两种靶的探针的代码具有相同的颜色，则在直接探测样品中核酸的分析中，上述颜色的荧光强度则与其它颜色的荧光强度不相匹配。相当于是两种靶的组合，因此将不同于其它颜色的水平，由此可鉴定出这种颜色是共有颜色。另一方面，如果分析是实时扩增分析，三种颜色会叠加到一起，作为更充足的靶的信号。当达到较不充足的靶的第二阈值，两种颜色会叠加到一起，共有颜色的强度曲线斜率将发生改变到达更高的值，由此鉴别出这种颜色即为共有颜色。

考虑还使用比率编码的情况，假定两种靶共有一种颜色，但是更充足的靶与该靶的其它部分相比的强度比率是2∶1。在实时扩增分析中，当达到第一个阈值时，三种颜色的信号将会升高于背景信号以上，但其中一种颜色(共有颜色)比其它两种颜色将会具有更高的斜率。然而，当到达第二个阈值时，共有颜色的强度曲线斜率将会发生改变到达更高的值，这意味着上述颜色即为共有颜色。

当样品中存在两种浓度相同的靶时，编码每一探针的颜色将会同时出现。在这种情况下，有时不太可能对每种代码都做到明确的鉴别。在上述情况下，可以采用替代编码方案对上述靶进行重复分析，在几乎所有情况下都能解决不确定的问题。

实施例1

在该实施例中，从怀疑受到细菌感染的正常情况下无菌的血液样品中分离DNA，并对上述DNA进行了实时PCR扩增分析。反应混合物中存在引物组，其能够扩增出所有怀疑可能存在于血液样品中的细菌物种的16S核糖体RNA基因的片段。分析中存在多种分子信标探针，每一种均与每种怀疑的细菌靶物种相对应。每种不同的分子信标具有一个通用的淬灭部分(dabcyl)，共价连接在其3’末端。根据本发明，用三种不同颜色的荧光团的独特组对上述每种不同的物种-特异性的分子信标探针进行组合标记。这些荧光团共价连接到每一寡核苷酸的5’末端。对于每种存在于分析混合物中的物种-特异性探针来说，在进行分析前调节共同组成物种-特异性探针的三个分别带有不同颜色的寡核苷酸的量，以使得在用于进行上述分析的分析仪器所检测到的探针三种颜色的荧光强度大致相同。图2是进行上述分析所得到的结果的作图。“x”轴表示到进行每次荧光测定时进行的扩增循环数。该测定可以通过分析仪器进行自动测定，其测定方式允许测定用于标记探针的每一不同颜色荧光团的荧光强度。“y”轴表示特定颜色荧光团的荧光强度。在每一扩增循环的退火阶段进行测定。在扩增过程中每个扩增循环中进行实时测定。将用于标记探针的每一不同颜色荧光团的荧光强度作图为完成的扩增循环数量的函数。

在图2所显示的试验中，在进行了特定数量的扩增循环后，即出现了高于背景荧光并且其强度足以使之得到检测的信号。发生这一现象时的扩增循环即是已知的“阈循环”，一般缩写为“C_T”。阈循环之后所出现的信号由三种不同颜色组成(a、b和c)。随着完成了更多的扩增循环，该信号以线性方式增加。一起组合出现的三种信号的组鉴定出血液样品中存在那个细菌物种。根据出现信号时的阈循环，确定样品中细菌物种的含量。阈循环与样品中靶分子数量的对数呈反比。

实施例2

在该实施例中，所进行的分析方式以及分析目的与实施例1相同。该试验所得到的结果显示在图3中。产生了两种不同的信号，一种(由a、b和c三种颜色组成)在反应中出现较早，另外一种(由d、e和f三种颜色组成)在反应中出现较晚。结果表明样品中存在两种不同的细菌物种，一种含量相对较高(由颜色a、b和c确定)，另外一种含量相对较少(由颜色d、e和f确定)，含量较少的细菌物种需要进行更多的扩增循环，这样才能得到足够多的扩增产物，这样与物种-特异性探针杂交时才能检测到高于背景荧光的荧光信号。两种信号中每种信号中的独特颜色组明确鉴定出了样品中所存在的两种细菌物种中的每一种。

实施例3

在该实施例中，所进行的分析方式以及分析目的与实施例1相同。该试验所得到的结果显示在图4中。产生了两种不同的信号，一种(由a、b和c三种颜色组成)在反应中出现较早，另外一种(由d和e两种颜色组成)在反应中出现较晚。另外，在阈循环之后，表示颜色“c”的荧光强度的曲线斜率增大，此时出现较晚的信号(由颜色d和e组成)。结果表明样品中存在两种不同的细菌物种，一种含量相对较高(由颜色a、b和c确定)，另外一种含量相对较少并且出现较晚(由颜色c、d和e确定)。表明颜色“c”的荧光强度的曲线斜率增大，是由于探针结合于来自于较少细菌物种的扩增DNA片段产生的“c”荧光加上探针结合于来自于较多细菌物种的扩增DNA片段产生的“c”荧光的贡献。尽管用于鉴定样品中两种细菌物种中每一种的三色代码具有一种相同的颜色，但是两个细菌物种在样品中含量不同，这使得来自一个物种的信号可以与另一个物种的信号相区分。一般来说，当临床样品中同时存在两种(或甚至三种)细菌物种，每种细菌的浓度是不同的，则由于每一种细菌物种的存在产生的编码的信号可以与由于样品中其它物种的存在产生的信号相区分。

实施例4

该实施例表明即使样品中存在浓度大致相同的两种不同物种，如何获得明确的结果。在该实施例中，所进行的分析方式以及分析目的与实施例1相同。在该试验中，存在于分析混合物中的探针是设计用来检测十种不同细菌物种(命名为物种0、1、2、3、4、5、6、7、8和9)。使用三色代码标记上述十种探针的每一种，来自由五种不同颜色的荧光团组成的组(命名为a、b、c、d和e)。对于存在于分析混合物中的每种物种-特异性探针来说，在进行分析前调节共同组成物种-特异性探针的三个分别带有不同颜色的寡核苷酸的量，以使得在用于进行上述分析的分析仪器所检测到的探针三种颜色的荧光强度大致相同。在该分析中，使用了如下的编码方案(在本申请中被称为“第一种三色代码簿”)。

物种0的探针    abc

物种1的探针    abd

物种2的探针    abe

物种3的探针    acd

物种4的探针    ace

物种5的探针    ade

物种6的探针    bcd

物种7的探针    bce

物种8的探针    bde

物种9的探针    cde

使用根据上述代码簿标记的探针实施该试验所得到的结果显示在图5中。在同一个阈循环时产生由四种不同颜色组成的信号(a、b、c和d)。其中两种颜色(a和b)的曲线斜率是另外两种颜色(c和d)的曲线斜率的两倍。上述结果表明在样品中存在两种浓度大致相同的不同的细菌物种，并且它们各自探针的三色代码共有两种相同的颜色。因为颜色“a”和“b”的曲线斜率大约是颜色“c”和“e”的曲线斜率的两倍，因此颜色“a”和“b”是样品中所存在的两种细菌物种的代码都具有的成分。从上述结果可以得到如下的结论，即其中一种结合扩增的靶序列的探针的代码是“abc”，而另外一种结合扩增的靶序列的探针的代码是“abd”。将上述结果与第一个三色代码簿(如上所示)所示的编码方案相对照，“abc”是细菌物种“0”的代码，“abd”是细菌物种“1”的代码。因此，上述结果很明确地表明样品中含有物种“0”和物种“1”，它们具有大致相同的浓度。

实施例5

该实施例表明当样品中存在浓度大致相同的两种不同物种时，有时也会得到不太明确的结果。本实施例所描述的分析的实施方式和分析目的与实施例4相同。在本分析中所使用的探针同样使用第一种三色代码簿(实施例4所示)标记。

图6a的表包括两部分(基于第一种三色代码簿)，该表显示当样品中存在相同浓度的两种不同物种时，可能发生两个物种的45种组合时得到的结果。在上述组合的其中30种组合中，出现了四种颜色，其中两种的荧光强度增加速度较快(以带有下划线的字母示出)，两种的荧光强度增加速度较慢(以不带下划线的字母示出)。上述30种组合在表中是独特的，从而所提供的结果是明确的。

然而，从图6a可以看出，在以相同浓度存在于样品中的两种不同物种的45种可能组合中，有15种出现了5种颜色信号，其中一种颜色的荧光强度增加速度较快(以带有下划线的字母示出)，另外四种颜色的荧光强度增加速度较慢(以不带下划线的字母示出)。然而这些组合不是独特的。例如，代码“abcde”在上表中出现三次：第一次是物种“2”和“9”的组合，第二次是物种“4”和“8”的组合，第三次是物种“5”和“7”的组合。图7给出了一个产生上述模糊结果的试验实例。在上述分析中，结果显示在同一阈循环内出现了五种颜色(a、b、c、d和e)，其中一种颜色(e)荧光强度的升高速度是另外四种颜色的两倍。

实施例7

可以采用替代编码方案编码的相同探针，重复上述分析过程，从而消除图7中所示结果固有的不确定。例如，用获得图7所示结果的相同的样品进行分析，产生图8的结果，区别在于采用如下的替代编码方案(在本申请中称为“第二种三色代码簿”)对探针进行编码：

物种0的探针    cde

物种1的探针    bde

物种2的探针    bce

物种3的探针    bcd

物种4的探针    ade

物种5的探针    ace

物种6的探针    acd

物种7的探针    abe

物种8的探针    abd

物种9的探针    abc

图8显示了用图7试验中使用的相同的样品进行分析所获得的结果，区别在于探针是根据第二种三色代码簿进行编码的。在同一阈循环时出现了由四种不同颜色(a、b、c和d)组成的信号。其中两种颜色(b和c)的曲线斜率是另外两种颜色(a和e)的曲线斜率的两倍。因为颜色“b”和“c”的曲线斜率大约是颜色“a”和“e”的曲线斜率的两倍，因此颜色“b”和“c”是存在于样品中的两种细菌物种的代码所共有的。从上述结果可以得出如下的结论，即其中一种与扩增的靶序列结合的探针的代码是“abc”，而另外一种与扩增的靶序列结合的探针的代码是“bce”。将上述结果与第二种三色代码簿(如上所示)所示的编码方案相对照，可看出“bce”是细菌物种“2”的代码，同时“abc”是细菌物种“9”的代码。因此图8所示的结果消除了图7所示结果的不确定性，明确地表明样品中包含物种“2”和物种“9”，其浓度大致相同。

图6a显示当根据第二种三色代码簿对探针进行编码时，以大致相同浓度存在于样品中的两种不同的细菌物种将会产生的所有45种不同的组合。将图6a的两个部分的表与图6b的两个部分的表相比较，结果显示，当需要解决第一次分析中所产生的不确定性时，采用替代编码的探针进行第二种分析，能够明确鉴定出两种不同细菌物种的所有45种可能的组合。

本发明描述了多个实施方案。但是，应当理解的是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，可以对上述实施方案作出多种改进。相应的，其它的实施方案同样包括在本发明权利要求所要求保护的范围内。