猪链球菌多重PCR检测方法的建立及试剂盒研制

摘要

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)作为重要的人畜共患病病原菌，其在全球范围内广泛分布，在猪上呈现关节水肿、肺炎、心内膜炎和败血症等症状，造成养猪业严重的经济损失;通过与生猪或猪肉制品的直接接触造成人的感染，可导致人出现链球菌特征性脑膜炎和中毒性休克综合征及耳聋复视等后遗症。中国的江苏和四川都曾爆发过由于猪链球菌感染而导致人死亡的案例，引发广泛关注。依据其荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)抗原结构的差异，猪链球菌可分为29个血清型。但是截至目前，猪链球菌的毒力基因的优劣依旧缺乏定论，菌株的致病力存在个体差异，新的毒力基因和致病相关的通路信息不断被挖掘;近期，泰国猪链球菌9型、24型和31型感染人的病例相继报道，提示更过的血清型有感染人的倾向，而大量未定型菌株的出现同样需要引起重视。多重PCR方法所具备的高特异性和敏感性的优势，适用于临床猪链球菌的鉴定和分型。本研究首先依据阳性菌株建立了多重PCR方法，包括猪链球菌2型强弱毒株的鉴别及ChzM血清型的鉴定，优化了PCR反应体系并组装了试剂盒，随后评价了试剂盒的特异性、敏感性和稳定性等，为该病的快速诊断提供方法。 1.鉴别猪链球菌2型强弱毒株三重PCR检测方法的建立 根据实验室先前对101株SS2菌株毒力基因谱聚类分析的结果，选择具有潜在的毒力优势基因为靶位，并依据相关文献及Genbank上传的毒力因子序列，设计合成3对引物endOD、epf和permease，通过PCR反应体系的优化，建立了一种涵盖上述3种猪链球菌主要毒力因子endOD、epf和permease的三重PCR检测方法，该方法同时可以对2型猪链球菌毒力的强弱进行初步鉴别。组合优化的结果显示，当退火温度为61.1℃，引物对终浓度为0.7pmol/mL时PCR反应可同时扩增出符合预期大小的三个目的片段;特性评价试验结果表明该法特异性强，PCR方法的敏感性可达104CFU/mL，DNA的检测下限可达10pg/PCRg。最后按照所建立的方法设计组装试剂盒、拟定操作说明书，通过重复性和保存期试验，证明试剂盒具有良好的重复性，稳定期为6个月(-20℃)。 2.鉴定猪链球菌新血清型(ChzM型)双重PCR检测方法的建立 参考相关文献发表的猪链球菌定型基因（编码谷氨酸脱氢酶）的序列合成gdh引物，同时结合本实验室设计的ChzM型猪链球菌定型引物，通过对PCR反应体系及程序的组合优化，建立了一种检测猪链球菌ChzM型的双重PCR方法。结果显示，当退火温度为51.5℃，引物对终浓度为0.4pmol/mL gdh、0.6pmol/mL ChzM时可同时扩增出符合预期大小的两个目的片段;特性分析试验结果表明该法特异性强，PCR方法的敏感性可达105CFU/mL，DNA的检测下限可达10pg/PCRg。最后按照所建立的方法设计组装试剂盒、拟定操作说明书，通过重复性和保存期试验，证明试剂盒具有良好重复性，稳定期为4个月(-20℃)。 3.产细菌素猪链球菌的筛选及其基因簇功能分析 细菌素是一类由细菌产生的具有抗菌活性的分泌蛋白，猪链球菌相关的细菌素报道较少。本试验以猪链球菌的细菌素为研究目标，采用琼脂扩散法筛选出27株产类细菌素猪链球菌菌株，血清型分布广泛，其中CZJYW024菌株的细菌素抑菌活性最强。使用细菌素检测引物(nisinA和scnA)对产类细菌素菌株进行检测，scnA和nisinA的携带率分别为33.3％和14.8％。初步纯化CZJYW024菌株的抑菌物质，提取物对马链球菌兽疫亚种ATCC35246的抑菌环直径达23.30±0.20mm，经有机酸、过氧化氢干扰试验及质谱鉴定，证实该抑菌物质属于羊毛硫细菌素家族，对热、pH和蛋白酶稳定，暂命名为suicin024。抑菌试验证实该基因缺失株(Δscz-CZJYW024)抑菌活性消失，进一步分析发现suicin024包含10个开放阅读框，由scz基因簇编码，调控表达具有抗菌活性的细菌素suicin024。经BALB/c小鼠模型证实CZJYW024菌株为无毒株，为该细菌素在动物制药和食品原料加工等抗生素替代品的研究和开发提供参考。

目录

声明

摘要

第一章猪链球菌病简述

1猪链球菌病流行病学研究进展

1．1易感动物

1．2传播途径

1．3季节性

1．4 临床症状及诊断

1．5国内外猪链球菌病流行状况

2猪链球菌检测与鉴定方法的研究进展

2．1微生物学检测与鉴定方法

2．2免疫学检测与鉴定方法

2．3分子生物学检测与鉴定方法

2．4动物试验

第二章鉴别猪链球菌2型强弱毒株三重PCR方法的建立与检测试剂盒研制

1材料与方法

1．1菌株

1．2试剂及仪器

1．3细菌培养

1．4基因组DNA的提取

1．5引物设计与合成

1．6多重PCR反应体系的建立及优化

1．7特异性试验

1．8敏感性试验

1．9试剂盒的重复性试验与设计组装

2结果

2．1 PCR

2．2试剂盒的重复性试验结果与设计组装

3讨论

第三章鉴定猪链球菌新血清型(ChzM型)双重PCR检测方法的建立与试剂盒研制

1材料与方法

1．1菌株

1．2试剂及仪器

1．3细菌培养

1．4基因组DNA的提取

1．5 PCR引物设计与合成

1．6多重PCR反应体系的建立及优化

1．7特异性试验

1．8敏感性试验

1．9试剂盒的重复性试验与设计组装

2结果

2．1 PCR

2．2试剂盒的重复性试验结果与设计组装

3讨论

第四章产细菌素猪链球菌的筛选及基因簇功能分析

1材料与方法

1．1材料

1．2方法

2结果

2．1产类细菌素菌株的筛选

2．2产类细菌素菌株定型试验

2．3 scnA和nisinA基因检测

2．4 suicin024的粗提及特性分析

2．5 suicin024的初步分离及质谱鉴定

2．6 suicin024基因簇功能分析

2．7缺失株验证

2．8 LD50测定

3结论

全文总结

参考文献

附录

致谢