法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-01-17
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12Q1/68 授权公告日:20080326 终止日期:20190128 申请日:20060128
专利权的终止
2008-03-26
授权
授权
2007-01-03
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-11-08
公开
公开
技术领域
本发明属于生物医学技术领域,具体涉及人胃癌耐药细胞特异结合及耐药逆转短肽筛选方法及序列。
背景技术
胃癌是我国引起死亡人数最多的恶性肿瘤,化疗是当前治疗胃癌的主要手段之一,但其治疗效果仍无重大进展,其主要原因就是胃癌细胞对化疗药物产生多药耐药。肿瘤细胞的多药耐药性(multi-drug resistance,MDR)是指肿瘤细胞对某一化疗药物产生耐药后,对其它化学结构及机理不同的化疗药物也产生交叉耐药性。
目前的研究表明,肿瘤细胞多药耐药性的产生主要与以下机制有关:1.发生在细胞膜水平的药物摄取减少和外排增多,引起细胞内药物的绝对浓度降低,如由P-糖蛋白引起的耐药;2.发生在细胞质和细胞器水平的药物亚细胞分布的改变,使药物无法接近其作用靶点,引起药物有效浓度降低;3.药物靶点在质和量的改变,如拓扑异构酶II表达降低,减弱了以此酶为靶点的药物的细胞毒性;4.细胞解毒系统功能加强,使药物迅速灭活,如与谷胱甘肽转移酶(GST)有关的耐药等。这些机制多是共同起作用,其中肿瘤细胞上某些膜蛋白的过多表达是产生多药耐药的主要原因。目前发现的与多药耐药有关的膜蛋白有三种:P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药蛋白(multidrug resistance protein,MRP)、乳腺癌耐药相关蛋白(Breastcancer resistance protein,BCRP),这三种膜蛋白在肿瘤细胞膜上行使着“分子泵”的功能,即将化疗药物从细胞内“泵”出,使肿瘤细胞免受化疗药物的杀伤(NatureBiotechnology.2000;18Suppl:IT18-20)。
目前人们针对肿瘤细胞膜上已知的耐药相关分子采用单克隆抗体及单链抗体(scFv)进行肿瘤耐药程度及预后的判断,以及肿瘤耐药细胞的靶向及逆转耐药治疗,如抗P-gp单克隆抗体MRK-16(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992;89:5824-5829;JControl Release 2001;77(1-2):77-86)能逆转肿瘤耐药,而抗FAS(Urology 2001;57(5):993-998)单克隆抗体则能明显提高肿瘤细胞内化疗药物的浓度。但单克隆抗体、单链抗体(scFv)以及生物工程抗体等。但单抗有难以克服的缺陷,如免疫原性较强、相对缺乏C区依赖的功能效应及穿透能力较弱等。虽然ScFv具有分子量较小,免疫原性弱,渗透力强,并可用于药物导向,中和毒素等优点,但其无抗体C区,不能介导抗体的其它生物学效应。目前筛选到的单克隆抗体及单链抗体(scFv)治疗只是针对已知的膜表面耐药分子,如P-gp、MRP、BCRP等,而且用来筛选相应抗体及单抗的分子是人工表达或合成纯化的分子,其构象及功能表位特征与细胞表面生理状态下的分子还有一定的差异。而且对于表达和纯化困难的细胞膜表面抗原难以进行相关配体的筛选。
目前耐药逆转治疗的效果还不理想,其主要原因之一还在于有很多与耐药相关的分子尚未被发现,其中包括很多膜表面耐药分子。我们知道在耐药肿瘤细胞膜表面存在着与药敏肿瘤细胞不同的膜分子表达谱,或者一些膜分子在耐药细胞的构象发生改变,这些膜分子的改变都是肿瘤细胞在化疗药物持续存在的压力下,为对抗化疗药物对细胞的作用而被诱导表达的,发生这些改变的膜分子与肿瘤细胞的耐药存在着必然的联系。因此寻找能够特异性结合及改变这些耐药相关膜分子生物学功能的配体,对于逆转耐药的治疗以及胃癌耐药相关分子的研究都有重要的现实及理论意义。而目前筛选逆转耐药配体的策略只能是针对已知膜表面的耐药分子,无法直接找到未知的膜表面耐药分子的配体。
鉴于目前寻找耐药肿瘤细胞靶向及逆转治疗分子中存在的不足,我们采用噬菌体随机肽库筛选完整的活的肿瘤耐药细胞,可以筛选到与生理状态下细胞膜表面分子结合的多肽,可以找到未知耐药相关分子的配体。多肽分子分子量更小,穿透能力强,没有抗原性,可具有生物活性的特点,更适合在体内应用。
用噬菌体随机呈现肽库筛选完整的细胞,对于细胞表面分子复杂多变的肿瘤细胞尤其适合(Curr Opin Chem Biol.2000 Feb;4(1):16-21)。噬菌体随机肽库活细胞筛选有很多优势,首先不要求预先确定目的的受体;除了筛选结合的受体外,还可以筛选内化的受体。Johnston和其同事用这种方法获得了表达20肽的噬菌体不但能够和纤维母细胞结合,并且能够内化进入细胞(Nat Genet 2001 Jan;27(1):6-8)。Hartley O等应用噬菌体肽库成功地筛得与表达在CHO-CCR5细胞及HEK-CCR5细胞表面的CCR5特异性结合的多肽(J Virol.2003 Jun;77(12):6637-44)。已知技术利用噬菌体随机肽库体内筛选到了与肿瘤血管内皮细胞特异性结合的短肽,申请号200510042810.4的专利申请,利用噬菌体随机肽库体外消减筛选胃癌血管内皮细胞体外培养模型,得到了与胃癌血管内皮细胞特异性结合的短肽。这表明以活细胞作为筛选靶标可以筛得能与细胞膜表面分子特异结合的多肽配基。但是200510042810.4的专利只是简单的筛选与细胞特异性结合的多肽,并没有针对性的筛选对细胞功能有影响的多肽。而本研究筛选的方法中加入了针对细胞功能的筛选,比其的优势在于能够直接筛选到对肿瘤细胞耐药功能有影响的多肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人胃癌耐药细胞特异结合及耐药逆转短肽筛选方法及序列,它利用噬菌体多肽筛选全细胞能够同时筛选肿瘤耐药细胞膜上所有特异性表达分子的配体,并通过功能筛选直接得到有生物活性的能够逆转肿瘤耐药细胞耐药特性的多肽,同时提供一种人胃癌多药耐药细胞特异性结合及具有逆转耐药特性,生物活性短肽及其序列(GMBPs)。
本发明的技术方案是:提供人胃癌耐药细胞特异结合及耐药逆转短肽筛选方法及序列,其特征是:它通过噬菌体随机肽库联合MTT体外药敏试验筛选,得到能够逆转胃癌耐药细胞耐药特性的噬菌体克隆多肽,其能够降低胃癌耐药细胞在化疗药物作用下的生存率和IC50值,并有统计学差异的克隆(p<0.05)。
所述的人胃癌耐药细胞特异结合及耐药逆转短肽序列选择下列序列之一:
GMBP1: E T A P L S T M L S P Y:
GMBP2: T T F S P P S P L S S I;
GMBP3: F N N H Y P A A A T Y P;
GMBP4: E V F W P L N A P R L L;
GMBP5: S W Q I P Y P I S P R S;
GMBP6: K T A P T P Y A L V H D;
GMBP7: S N F M H N T R I W S H;
GMBP8: S W Q I T Y P I S P R S;
GMBP9: A W T W V L P S S I R A;
GMBP10:T D S Y H V A S A R Q P;
GMBP11:S T Y S H P L S L R P D;
GMBP12:Y T T W P F T S L Q L D;
GMBP13:A F M E T T S Q N A W L;
GMBP14:E T A P P T P Y S V M F;
GMBP15:T T F N P L Y L R L D T;
GMBP16:S S F P Q V I P L D Y L;
GMBP17:A P K Y S L S D L Y L N;
GMBP18:Q I E K I S Q H L D M H;
GMBP19:T W N Q P Y I P P L Y P;
GMBP20:Y A S P P N P S L R L T;
GMBP21:Y H G L T P V R Y V S V;
GMBP22:Y T F M P E L T T P R T;
GMBP23:N S F N Y A P L L M P R;
GMBP24:T S P Y H L L H A H L Q;
GMBP25:S S F V A L S I S P S M;
GMBP26:A N L S S H S S P G D S;
GMBP27:T T L Q F T G Q T N K T;
GMBP28:T P P P R D A S L S R W;
GMBP29:H N I G T W G P K S H L;
GMBP30:S G F F E P Q H S H P L;
GMBP31:Q I E E S F V R G H T T;
GMBP32:S P Q T D G L V S T P S;
GMBP33:Y T F D P Q I R P A G L;
GMBP34:Y E R S I L P F S H V F;
GMBP35:Y P S V T F P T Q T L L;
GMBP36:A S T N V F A R P M Y L;
GMBP37:S P W Y M T P S P N T A;
GMBP38:H I S V I N Y T T K I S;
GMBP39:M N V T V S G R L S G P;
GMBP40:T I P Y P F S L L N N P;
GMBP41:G P F L Y S Q V A W R S;
GMBP42:T A L P N H W S D A S P;
GMBP43:S V S V G M K P S P R P;
GMBP44:Y Q E E T P A S S F S R;
GMBP45:N S S Q L A P Y T T H R;
GMBP46: T L H P S V L S Y V L K;
GMBP47:H N G L P N F F Q T R L;
GMBP48:E A A P N F Y P P L T F;
GMBP49:D L F Q F A F P L N T I;
GMBP50:F T F S Y A E S V S Y F。
它们分别由12个氨基酸组成,都具有苏氨酸——(1-3个)氨基酸——脯氨酸特征性共有序列模式,其氨基酸序列如下列之一
GMBP1: E T A P L S T M L S P Y;
GMBP2: T T F S P P S P L S S I;
GMBP3: F N N H Y P A A A T Y P;
GMBP6: K T A P T P Y A L V H D;
GMBP8: S W Q I T Y P I S P R S;
GMBP9: A W T W V L P S S I R A;
GMBP11:S T Y S H P L S L R P D;
GMBP12:Y T T W P F T S L Q L D;
GMBP14:E T A P P T P Y S V M F;
GMBP15:T T F N P L Y L R L D T;
GMBP19:T W N Q P Y I P P L Y P;
GMBP22:Y T F M P E L T T P R T;
GMBP24:T S P Y H L L H A H L Q;
GMBP28:T P P P R D A S L S R W;
GMBP29:H N I G T W G P K S H L;
GMBP33:Y T F D P Q I R P A G L;
GMBP35:Y P S V T F P T Q T L L;
GMBP37: S P W Y M T P S P N T A;
GMBP40: T I P Y P F S L L N N P;
GMBP42:T A L P N H W S D A S P;
GMBP46: T L H P S V L S Y V L K。
它们分别由12个氨基酸组成,都具有丝氨酸——(0-4个)氨基酸——脯氨酸特征性共有序列模式,其氨基酸序列如下列之一
GMBP5: S W Q I P Y P I S P R S;
GMBP10:T D S Y H V A S A R Q P;
GMBP16:S S F P Q V I P L D Y L;
GMBP20: Y A S P P N P S L R L T;
GMBP23: N S F N Y A P L L M P R;
GMBP25:S S F V A L S I S P S M;
GMBP26:A N L S S H S S P G D S;
GMBP30: S G F F E P Q H S H P L;
GMBP32: S P Q T D G L V S T P S;
GMBP34:Y E R S I L P F S H V F;
GMBP39:M N V T V S G R L S G P;
GMBP43:S V S V G M K P S P R P
GMBP45: N S S Q L A P Y T T H R。
它们分别由12个氨基酸组成,都具有苯丙氨酸——(0-2个)氨基酸——脯氨酸及脯氨酸——(0-2个)氨基酸——亮氨酸特征性共有序列模式,其氨基酸序列如下列之一
GMBP4: E V F W P L N A P R L L;
GMBP36: A S T N V F A R P M Y L;
GMBP48:E A A P N F Y P P L T F;
GMBP49:D L F Q F A F P L N T I。
它们分别由12个氨基酸组成,都具有苏氨酸——(0-3个)氨基酸——丝氨酸特征性共有序列模式,其氨基酸序列如下列之一
GMBP7: S N F M H N T R I W S H;
GMBP13:A F M E T T S Q N A W L;
GMBP38:H I S V I N Y T T K I S;
GMBP50:F T F S Y A E S V S Y F。
它们分别由12个氨基酸组成,都具有亮氨酸——(4个)氨基酸——谷氨酰胺——苏氨酸特征性共有序列模式,其氨基酸序列如下列之一
GMBP27:T T L Q F T G Q T N K T;
GMBP47:H N G L P N F F Q T R L。
它们分别由12个氨基酸组成,都具有谷氨酰胺——异亮氨酸——谷氨酸特征性共有序列模式,其氨基酸序列如下列之一
GMBP18:Q I E K I S Q H L D M H;
GMBP31:Q I E E S F V R G H T T。
它们分别由12个氨基酸组成,都具有脯氨酸——(1-4个)氨基酸——丝氨酸特征性共有序列模式,其氨基酸序列如下列之一
GMBP17: A P K Y S L S D L Y L N;
GMBP21: Y H G L T P V R Y V S V;
GMBP41: G P F L Y S Q V A W R S;
GMBP44: Y Q E E T P A S S F S R。
所述的(1)噬菌体肽库的体外全细胞消减筛选
筛选流程以人正常胃粘膜上皮细胞GES及胃癌药敏细胞SGC7901为阴性消减细胞,与原始肽库共孵育,取未结合的噬菌体再和胃癌耐药细胞(SGC7901/ADR,SGC7901/VCR)共孵育,回收结合噬菌体,扩增后投入下一轮筛选,4轮后挑取噬菌体单克隆进行DNA序列测定;
(2)体外筛选步骤
用市售EDTA细胞分离液收获对数生长期的GES细胞1×107,与取原始肽库10μl(2×1011pfu)混合,4℃孵育1.5h,800rpm,离心5min,收集上清,以同样的方法将SGC7901与回收的上清共孵育,再离心,收集上清;用EDTA收获SGC7901/ADR或SGC7901/VCR 1×107,与上述回收上清共孵育,离心,弃上清,用BF重悬SGC7901/ADR或SGC7901/VCR,混旋3min后再离心,重复洗7遍,0.2%PBST洗1遍,PBS洗2遍;以pH2.2的甘氨酸洗脱缓冲液4℃洗脱10min,加入pH9.1的Tris/HCl中和缓冲液,离心,去上清,再以pH2.2的甘氨酸洗脱缓冲液4℃洗脱10min,加入pH9.1的Tris/HCl中和缓冲液,收集上清,即为膜洗脱噬菌体或膜结合噬菌体;以含PMSF的TEA碱洗脱液4℃裂解洗脱5min,加入pH7.4的Tris/HCl中和缓冲液,离心,收集上清,即为裂解洗脱噬菌体或内化噬菌体(AN或VN);
(3)噬菌体的体外扩增
铺制LB-Tet平板,并加入X-gal/IPTG,颠倒培养后,随机挑取间距0.5cm以上、生长良好的蓝色噬斑400-500个,分为5部分分别加入宿主菌,37℃、250rpm振荡培养4-6h;将培养物4℃、10000rpm离心15min,上清与1/6体积的PEG/NaCl溶液4℃过夜;再离心,TBS重悬沉淀,微离心,将上清与1/6体积的PEG/NaCl溶液冰浴1h,离心,弃上清,以200μl 0.02%NaN3溶液重悬沉淀物,即为第一轮扩增的噬菌体;
(4)下一轮筛选
将扩增后的膜洗脱噬菌体和裂解洗脱噬菌体各取2×1011pfu,投入下一轮分别进行筛选;筛选过程同前,共进行4轮筛选,逐渐增加筛选强度:与阴性细胞孵育的时间增加至2h,与靶细胞的孵育时间减为30mins;BF、PBST、PBS混旋洗涤时间增至5min,PBST浓度渐增为0.2%、0.3%、0.5%;
(5)阳性噬菌体克隆的挑选及MTT体外药敏试验筛选
经过4轮筛选,从胃癌耐药细胞上回收的噬菌体显著增高,铺制LB平板,在克隆数少于100个的平板上随机挑取噬菌体单克隆共200个,其中AN,AM各50个,VN,VM各50个,编号为AN1-AN15,AN41-AN435,AM1-AM25,AM41-AM425,VN1-VN50,VN1-VN50;以AN2为例利用MTT体外药物敏感实验进行噬菌体对胃癌耐药细胞耐药特性影响的检测;收获对数生长中期的SGC7901/ADR细胞,按照每孔8×103个细胞/200μL接种入96孔板,置于细胞培养箱内培养过夜;经过MTT筛选检测AN2-AN10,AN41-AN43,AN45-AN418,AN420-AN425,AN428-AN430,AM1-AM13,AM15-AM23,AM41-AM45,AM47-AM413,AM415-AM425,VN1-VN14,VN17-VN21,VN23-VN30,VN34-VN42,VN45-VN50,VM1-VM7,VM9,VM11-VM14,VM16,VM17,VM19-VM30,VM35-VM47这些克隆可以使胃癌耐药细胞在4μg/ml阿霉素(ADR)的环境中生存率下降,与不加噬菌体克隆及加同等剂量无关噬菌体(原始肽库Ph.D.-12的扩增液)的胃癌耐药细胞相比有显著差异,并有统计学意义(p<0.05);
(6)阳性噬菌体克隆的测序
采用单链DNA提取试剂盒进行噬菌体单链DNA的提取,然后以以单链DNA为模板,采用噬菌体随机肽库试剂盒中所提供的测序引物,-96gIII,5′-CCC TCATAG TTA GCG TAA CG-3′测序;根据测序得出的DNA序列,推导出呈现随机肽的氨基酸序列。
本发明特点:目前人们针对肿瘤细胞膜上已知的耐药相关分子采用单克隆抗体及单链抗体(scFv)进行肿瘤耐药程度及预后的判断,以及肿瘤耐药细胞的靶向及逆转耐药治疗,如抗P-gp单克隆抗体MRK-16(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992;89:5824-5829;J Control Release 2001;77(1-2):77-86)能逆转肿瘤耐药,而抗FAS(Urology2001;57(5):993-998)单克隆抗体则能明显提高肿瘤细胞内化疗药物的浓度。但单克隆抗体、单链抗体(scFv)以及生物工程抗体等。单克隆抗体有难以克服的缺陷,如免疫原性较强、相对缺乏C区依赖的功能效应及穿透能力较弱等。虽然ScFv具有分子量较小,免疫原性弱,渗透力强,并可用于药物导向,中和毒素等优点,但其无抗体C区,不能介导抗体的其它生物学效应。
目前筛选到的单克隆抗体及单链抗体(scFv)治疗只是针对已知的膜表面耐药分子,如P-gp、MRP、BCRP等,而且用来筛选相应抗体及单抗的分子是人工表达或合成纯化的分子,其构象及功能表位特征与细胞表面生理状态下的分子还有一定的差异。而且对于表达和纯化困难的细胞膜表面抗原难以进行相关配体的筛选。耐药逆转治疗的效果还不理想,其主要原因之一还在于有很多与耐药相关的分子尚未被发现,其中包括很多膜表面耐药分子。我们知道在耐药肿瘤细胞膜表面存在着与药敏肿瘤细胞不同的膜分子表达谱,或者一些膜分子在耐药细胞的构象发生改变,这些膜分子的改变都是肿瘤细胞在化疗药物持续存在的压力下,为对抗化疗药物对细胞的作用而被诱导表达的,发生这些改变的膜分子与肿瘤细胞的耐药存在着必然的联系。因此寻找能够特异性结合及改变这些耐药相关膜分子生物学功能的配体,对于逆转耐药的治疗以及胃癌耐药相关分子的研究都有重要的现实及理论意义。而目前筛选逆转耐药配体的策略只能是针对已知膜表面的耐药分子,无法直接找到未知的膜表面耐药分子的配体。
鉴于目前寻找耐药肿瘤细胞靶向及逆转治疗分子中存在的不足,本发明采用噬菌体随机肽库筛选完整的活的肿瘤耐药细胞,可以筛选到与生理状态下细胞膜表面分子结合的多肽,找到未知耐药相关分子的配体。多肽分子分子量更小,穿透能力强,没有抗原性,可具有生物活性的特点,更适合在体内应用。用噬菌体随机呈现肽库筛选完整的细胞,对于细胞表面分子复杂多变的肿瘤细胞尤其适合(Curr OpinChem Biol.2000 Feb;4(1):16-21)。噬菌体随机肽库活细胞筛选有很多优势,首先不要求预先确定目的的受体;除了筛选结合的受体外,还可以筛选内化的受体。Johnston和其同事用这种方法获得了表达20肽的噬菌体不但能够和纤维母细胞结合,并且能够内化进入细胞(Nat Genet 2001 Jan;27(1):6-8)。Hartley O等应用噬菌体肽库成功地筛得与表达在CHO-CCR5细胞及HEK-CCR5细胞表面的CCR5特异性结合的多肽(J Virol.2003Jun;77(12):6637-44)。现有技术中利用噬菌体随机肽库体内筛选到了与肿瘤血管内皮细胞特异性结合的短肽,申请号200510042810.4的专利申请,利用噬菌体随机肽库体外消减筛选胃癌血管内皮细胞体外培养模型,得到了与胃癌血管内皮细胞特异性结合的短肽。这表明以活细胞作为筛选靶标可以筛得能与细胞膜表面分子特异结合的多肽配基。
但是目前利用噬菌体多肽筛选全细胞,只是简单的筛选与细胞特异性结合的多肽,并没有针对性的筛选对细胞功能有影响的多肽。本发明则利用噬菌体肽库生物淘筛技术,先从逆转耐药的功能着手,结合MTT体外药敏试验筛选方案,有针对性地筛选能逆转肿瘤耐药细胞耐药特性的有生物活性的多肽。本发明利用噬菌体多肽筛选全细胞,它能够同时筛选肿瘤耐药细胞膜上所有特异性表达分子的配体,同时通过功能筛选直接得到有生物活性的能够逆转肿瘤耐药细胞耐药特性的多肽,是一种高效的寻找逆转肿瘤耐药细胞耐药特性多肽的方法。
附图说明
以下结合附图表对本发明作进一步的详细说明。
图1噬菌体肽库体外筛选流程图;
图2四轮筛选中噬菌体在胃癌多药耐药细胞上逐渐富集图示;
图3 17个噬菌体克隆与SGC7901/ADR结合特异性的ELISA鉴定结果图示;
图4 7个噬菌体克隆与SGC7901/VCR结合特异性的ELISA鉴定结果;
图5 AN2体外活细胞结合实验结果图示;
图6 GMBP1与AN2细胞结合竞争抑制实验;
图7 AN2噬菌体与SGC7901/ADR结合特异性的免疫荧光检测;
图8 GMBP1合成肽对于AN2噬菌体与胃癌SGC7901/ADR细胞结合特异性阻断的免疫荧光检测;
表4 VCR作用于加有多肽GMBP42、对随机多肽和PBS的SGC7901/VCR细胞株的细胞生存率(%)及IC50值;
表5多肽GMBP42裸鼠体内药物敏感试验。
具体实施方式
胃癌耐药细胞表面分子标记物是胃癌多药耐药逆转治疗的关键靶标之一,通过噬菌体随机肽库体外全细胞筛选,结合MTT体外药敏实验功能鉴定成功地获得了一组人胃癌耐药细胞的特异性结合及逆转耐药短肽GMBPs,并利用噬菌体细胞结合实验、免疫细胞/组织化学染色、细胞结合竞争抑制实验、免疫荧光检测等方法鉴定了GMBPs的结合特异性,进一步采用多肽MTT体外药敏实验、裸鼠体内药物敏感实验确定了GMBPs的逆转耐药特性,具体方法如下:
1.技术方案
1.1.噬菌体肽库的体外全细胞消减筛选
1.1.1.筛选流程
以人正常胃粘膜上皮细胞GES及胃癌药敏细胞SGC7901为阴性消减细胞,与原始肽库共孵育(原始肽库购于New England Biolabs公司),取未结合的噬菌体再和胃癌耐药细胞(SGC7901/ADR,SGC7901/VCR)共孵育,回收结合噬菌体,扩增后投入下一轮筛选,4轮后挑取噬菌体单克隆进行DNA序列测定(上海华诺公司)及同源性分析(见图1)。
1.1.2.体外筛选步骤
用EDTA(市售)细胞分离液收获对数生长期的GES细胞1×107,与取原始肽库10μl(2×1011pfu)混合,4℃孵育1.5h,800rpm,离心5min,收集上清,以同样的方法将SGC7901与回收的上清共孵育,再离心,收集上清。用EDTA收获SGC7901/ADR或SGC7901/VCR 1×107,与上述回收上清共孵育,离心,弃上清,用BF重悬SGC7901/ADR或SGC7901/VCR,混旋3min后再离心,重复洗7遍,0.2%PBST洗1遍,PBS洗2遍。以pH2.2的甘氨酸洗脱缓冲液4℃洗脱10min,加入pH9.1的Tris/HCl中和缓冲液,离心,去上清,再以pH2.2的甘氨酸洗脱缓冲液4℃洗脱10min,加入pH9.1的Tris/HCl中和缓冲液,收集上清,即为膜洗脱噬菌体或膜结合噬菌体(AM或VM)。以含PMSF的TEA碱洗脱液4℃裂解洗脱5min,加入pH7.4的Tris/HCl中和缓冲液,离心,收集上清,即为裂解洗脱噬菌体或内化噬菌体(AN或VN)。
1.1.3.噬菌体的体外扩增
铺制LB-Tet平板,并加入X-gal/IPTG(购于上海生工),颠倒培养后,随机挑取间距0.5cm以上、生长良好的蓝色噬斑400-500个,分为5部分分别加入宿主菌,37℃、250rpm振荡培养4-6h。将培养物4℃、10000rpm离心15min,上清与1/6体积的PEG/NaCl溶液4℃过夜。再离心,TBS重悬沉淀,微离心,将上清与1/6体积的PEG/NaCl溶液冰浴1h,离心,弃上清,以200μl 0.02%NaN3溶液重悬沉淀物,即为第一轮扩增的噬菌体。
1.1.4.下一轮筛选
将扩增后的膜洗脱噬菌体和裂解洗脱噬菌体各取2×1011pfu,投入下一轮分别进行筛选。筛选过程同前,共进行4轮筛选,逐渐增加筛选强度:与阴性细胞孵育的时间增加至2h,与靶细胞的孵育时间减为30mins;BF、PBST、PBS混旋洗涤时间增至5min,PBST浓度渐增为0.2%、0.3%、0.5%。
1.1.5.阳性噬菌体克隆的挑选及MTT体外药敏试验筛选
经过4轮筛选,从胃癌耐药细胞上回收的噬菌体显著增高,明显高于对照细胞(见图2)。铺制LB平板,在克隆数少于100个的平板上随机挑取噬菌体单克隆共200个,其中AN,AM各50个,VN,VM各50个,编号为AN1-AN15,AN41-AN435,AM1-AM25,AM41-AM425,VN1-VN50,VN1-VN50。以AN2为例利用MTT体外药物敏感实验进行噬菌体对胃癌耐药细胞耐药特性影响的检测。
收获对数生长中期的SGC7901/ADR细胞,按照每孔8×103个细胞/200μL接种入96孔板,置于细胞培养箱内培养过夜。分为3组,各组设4个复孔,每孔分别加入AN2噬菌体1×1010pfu,以同样剂量的无关噬菌体(原始肽库Ph.D.-12的扩增液)及PBS作为对照,2小时后,每组再加入4μg/ml浓度的阿霉素(ADR),继续培养3天。每孔加新鲜配制MTT溶液(5g/L)20μL,37℃继续培养4小时;小心吸弃孔内培养上清,每孔加入150μL的DMSO,振荡10min,使结晶物充分溶解;波长490nm,在全自动酶标仪仪上测各孔光吸收值,取每4个重复孔A值的平均数,计算细胞的存活率:细胞存活率=(实验组A值-空白对照组A值)/(阴性对照组A值-空白对照组A值)×100%;以第四军医大学统计学教研室的Nosa统计软件进行显著性检验。结果显示,AN2能够逆转SGC7901/ADR的耐药特性,与无关噬菌体及PBS相比使胃癌耐药细胞的生存率下降,(p<0.05)有统计学意义。
经过MTT筛选检测AN2-AN10,AN41-AN43,AN45-AN418,AN420-AN425,AN428-AN430,AM1-AM13,AM15-AM23,AM41-AM45,AM47-AM413,AM415-AM425,VN1-VN14,VN17-VN21,VN23-VN30,VN34-VN42,VN45-VN50,VM1-VM7,VM9,VM11-VM14,VM16,VM17,VM19-VM30,VM35-VM47这些克隆可以使胃癌耐药细胞的生存率下降,并有统计学意义(p<0.05)。
1.1.6.阳性噬菌体克隆的测序
对MTT试验筛选的阳性噬菌体克隆进行测序。采用华舜公司生产的单链DNA提取试剂盒进行噬菌体单链DNA的提取,按操作说明书进行操作:在含有单个噬菌体克隆的LB培养液中加入沉淀液,高速离心后得到噬菌体颗粒沉淀,加入裂解液裂解噬菌体外壳蛋白,经过树脂纯化,洗脱得到噬菌体单链DNA。以单链DNA为模板,采用噬菌体随机肽库试剂盒中所提供的测序引物,-96gIII,5′-CCC TCATAG TTA GCG TAA CG -3′送至上海华诺有限公司测序。除AM20,AM23,AM421,AM424,VN34,VN39,VN48,VM40,VM44号克隆测序失败,由于一部分克隆序列重复,最终得到50个不同的噬菌体克隆(见表1),将其呈现短肽命名为GMBPs(Gastric cancer MDR cell Binding Peptides)。根据测序得出的DNA序列,推导出呈现随机肽的氨基酸序列,以AN2为例。DNA测序报告为:
CCTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAAGTAACATGGAGCAGGTCGC
GGATTTCGACACAATTTATCAGGCGATGATACAAATCTCCGTTGTACTTTGTTTC
GCGCTTGGTATAATCGCTGGGGGTCAAAGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTTG
CCTCTTTCGTTTTAGGTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTT
AATGGAAACTTCCTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCTGTAGCCGTT
GCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCAAA
AGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTG
GGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAA
ATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGA
GCCTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAG
TGGTACCTTTCTATTCTCACTCTGAGACTGCTCCGCTTTCGACGATGTTGTC
GCCTTATGGTGGAGGTTCGGCCGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAATCCC
ATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGAC
根据斜体有下划线的为内切酶KPN1的酶切位点,在其下游找到在噬菌体上表达插入蛋白的DNA序列,即后面下划线的部分。然后再根据DNA序列,按照遗传密码规则推导出其蛋白序列为ETAPLSTMLSPY。
字母缩写与氨基酸的对应关系如下:
A丙氨酸;R精氨酸;N天冬酰氨;D天冬氨酸;C半胱氨酸;Q谷氨酰胺;E谷氨酸;G甘氨酸;H组氨酸;I异亮氨酸;L亮氨酸;K赖氨酸;M甲硫氨酸;F苯丙氨酸;P脯氨酸;S丝氨酸;T苏氨酸;W色氨酸;Y酪氨酸;V缬氨酸。
表1测序得到50个随机插入片段及其编码的短肽
*表示该片段在所有测序克隆中重复出现的次数,未注明的均为1次
1.2.GMBPs氨基酸序列的同源性分析
1.2.1. 50个GMBPs间的同源性分析
登陆ClustalW网站(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/),12个短肽氨基酸序列之间进行对比分析,部分序列之间呈现出较高的同源性,发现有7种不同特征的共有序列模式。见表2所示。
表2 50个短肽序列中7种不同特征的共有序列模式
1.2.2.通过数据库检索进行同源性分析
登陆NCBI/BLAST网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/),搜索蛋白质数据库进行同源性分析,结果未发现含有与这些短肽氨基酸序列完全一致的蛋白质,GMBPs与某些蛋白质分子具有较好的同源性(见表3)。
表3 50个GMBPs短肽的蛋白质数据库检索同源性分析
*表示该片段在所有测序克隆中重复出现的次数,未注明的均为1次
1.3.噬菌体克隆结合活性的ELISA鉴定
根据测序及信息分析结果,选取24个克隆进行噬菌体克隆进行结合特异性的细胞ELISA鉴定,其中与SGC7901/ADR细胞筛选得到的克隆为17个,与SGC7901/VCR细胞筛选得到的克隆为7个。以SGC7901为对照细胞,用ELISA法初步鉴定测序成功的噬菌体克隆与SGC7901/VCR和SGC7901/ADR的结合活性,排除假阳性或无差异结合的噬菌体。并设PBS对照及无关噬菌体(原始肽库Ph.D.-12的扩增液)对照。实验步骤如下:
收集处于对数生长期的SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901/ADR,铺于96孔板(每孔细胞数为1×105),培养4h使细胞贴壁、伸展,0.25%戊二醛(市售)中固定15min,4%H2O2室温封闭30min,1%BSA(购于北京鼎国公司)37℃封闭30min,分别加入1×1010pfu阳性噬菌体,37℃孵育2h。与HRP-抗M13IgG(购于美国Pharmacia公司)37℃孵育1h,TMB(购于万泰药业)显色30min,终止反应,450nm/630nm双波长下测定OD值。实验重复3次,计算平均OD值,实验组OD值与对照组OD值之比≥2.1判定为阳性。数据以均数±标准差表示,SPSS软件进行统计学分析。结果显示,AN2,AN46,AN49,AN410,AM410这5个噬菌体克隆在SGC7901和SGC7901/ADR上有明显的差异性结合(见图3);VN4,VN23,VM2这3个噬菌体克隆在SGC7901和SGC7901/VCR上有明显的差异性结合(见图4)。
1.4. 8个差异结合噬菌体及其呈现短肽的结合特异性鉴定
以AN2噬菌体及其呈现短肽GMBP1为例,采用噬菌体细胞结合实验、免疫细胞荧光染色、细胞结合竞争抑制实验等方法鉴定其结合活性及特异性。其它噬菌体克隆或短肽的鉴定,以同样方法进行。
1.4.1.体外细胞结合/内化实验
为验证AN2噬菌体在SGC7901/ADR上结合的特异性,以SGC7901,GES为对照细胞,进行噬菌体体外结合实验。方法如下:收获对数生长期的SGC7901、SGC7901/ADR、GES细胞各1×107个,将1×1010pfu AN2噬菌体及无关噬菌体分别与三种细胞共孵育,洗涤、pH2.2的甘氨酸洗脱细胞膜上噬菌体、TEA碱裂解洗脱回收内化入细胞内的噬菌体并滴定,比较三种细胞上的回收噬菌体量。结果发现,从SGC7901/ADR上回收的内化的AN2噬菌体滴度是无关噬菌体的34倍,是对照细胞SGC7901的32.4倍、GES的14.8倍。而从SGC7901和GES细胞上回收的内化的AN2噬菌体与无关噬菌体无明显差异(见图5)。
1.4.2.体外结合竞争抑制实验
为明确AN2噬菌体是否通过其表面呈现的GMBP1短肽特异结合于SGC7901/ADR,可以利用GMBP1的人工合成肽对AN2噬菌体的特异性结合进行干预,通过以体外活细胞结合内化实验进行竞争抑制实验。体外活细胞结合内化竞争抑制实验:与体外细胞结合内化实验相似,收获14组对数生长期的SGC7901/ADR1×107,6个实验组细胞先与浓度分别为50μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM的合成肽GMBP1(上海生工公司)及随机多肽(12肽),分别与1×1010pfu的AN2噬菌体4℃孵育2h,blocking buffer为对照组。然后洗脱、回收并滴定结合噬菌体。计算合成肽GMBP1对AN2噬菌体结合内化的竞争抑制率:抑制率=(对照组回收噬菌体的数量或OD值-实验组回收噬菌体的数量或OD值)/对照组回收噬菌体的数量或OD值×100%,作出抑制率-合成肽浓度曲线。结果随着GMBP1浓度的增高,抑制率逐渐上升,在10-50μM时,抑制率维持在较高水平,表明GMBP1合成肽对AN2噬菌体在SGC7901/ADR上的结合内化有竞争抑制作用(见图6)。
1.4.3.AN2噬菌体及其GMBP1合成肽结合特异性的免疫荧光检测
采用免疫荧光技术鉴定AN2噬菌体与SGC7901/ADR结合的特异性,以SGC7901作对照。细胞爬片经正常血清封闭后,先与AN2噬菌体1×1010pfu 37℃孵育2h,振荡洗涤5min×6次,然后依次与鼠抗M13单体(购于美国Pharmacia公司)、FITC标记的抗鼠IgG二抗孵育、DAPI染色。PBS代替噬菌体,作阴性对照。于荧光显微镜下观察比较结果显示,AN2噬菌体在SGC7901/ADR上呈阳性,而对照细胞为阴性(见图7)。
采用免疫荧光技术鉴定GMBP1合成肽与SGC7901/ADR结合的特异性。SGC7901/ADR及SGC7901细胞爬片经正常血清封闭后,加入AN2噬菌体1×1010pfu和100μl 10μM的GMBP1,另一组单独加入AN2噬菌体1×1010pfu,37℃孵育2h,振荡洗涤5min×6次,然后依次与鼠抗M13单体(购于美国Pharmacia公司)、FITC标记的抗鼠IgG二抗孵育、DAPI染色。于荧光显微镜下观察比较。结果发现,加入GMBP1的SGC7901/ADR呈弱阳性或阴性,而SGC7901加入GMBP1或不加入GMBP1的无明显差别,均呈阴性或弱阳性,这表明,GMBP1短肽确实能够特异性结合于胃癌多药耐药细胞SGC7901/ADR,而与胃癌药敏细胞未见明显结合(见图8)。
综合上述结果,AN2、AN46、AN49、AN410、AM410这5个噬菌体克隆在SGC7901和SGC7901/ADR上有明显的差异性结合;VN4、VN23、VM2这3个噬菌体克隆在SGC7901和SGC7901/VCR上有明显的差异性结合。其中AN2、AN46、AN49、AN410、AM410、VN4、VN23、VM2噬菌体克隆相应的短肽GMBP1、GMBP6、GMBP8、GMBP9、GMBP23、GMBP30、GMBP42、GMBP46均能够抑制其与耐药肿瘤细胞的结合。
1.5 8个差异结合噬菌体及其呈现短肽对于逆转耐药特异性鉴定
对于上述实验证实的有差异明显结合的8个噬菌体克隆AN2、AN46、AN49、AN410、AM410、VN4、VN23、VM2逆转耐药特性进行鉴定。以VN23噬菌体呈现短肽GMBP42为例,利用MTT体外药物敏感性实验,裸鼠体内药物敏感实验鉴定其对于胃癌多药耐药细胞耐药特异性逆转的作用。其它噬菌体克隆或短肽的鉴定,以同样方法进行。
1.5.1 8个差异结合噬菌体及其呈现短肽MTT体外药物敏感性实验
收获对数生长中期的SGC7901/VCR细胞,按照每孔8×103个细胞/200μL接种入96孔板,置于细胞培养箱内培养过夜。分为3组,各组中每孔分别加入100μl10μM的GMBP42,以同样剂量的随机多肽及100ul PBS作为对照,每组再加入不同浓度的长春新碱(0.5ug/ml,1ug/ml,2ug/ml,4ug/ml),继续培养3天。每孔加新鲜配制MTT溶液(5g/L)20μL,37℃继续培养4小时;小心吸弃孔内培养上清,每孔加入150μL的DMSO,振荡10min,使结晶物充分溶解;波长490nm,在全自动酶标仪仪上测各孔光吸收值,取每4个重复孔A值的平均数,计算细胞的存活率:细胞存活率=(实验组A值-空白对照组A值)/(阴性对照组A值-空白对照组A值)×100%;以第四军医大学统计学教研室的Nosa统计软件计算细胞对每种药物的IC50值,并进行显著性检验。结果显示,GMBP42多肽能够逆转SGC7901/VCR的耐药特性,与随机多肽及PBS相比有明显差异,且有统计学意义。(表4)
MTT体外药物敏感性实验还显GMBP8;GMBP46也能够逆转胃癌耐药细胞的耐药特性,降低其IC50值,与无关噬菌体及随机多肽相比有明显差异,且有统计学意义(p<0.05)。而GMBP1;GMBP6;GMBP9;这3个克隆对于SGC7901/VCR和SGC7901/ADR的耐药特性无明显影响,与无关噬菌体及随机多肽结果近似。
1.5.2噬菌体短肽裸鼠体内药物敏感性实验
收集胃癌耐药细胞SGC7901/VCR细胞,消化液消化使细胞分散,用无血清培养基离心洗涤两次,计数活细胞数,调整细胞数,将细胞悬浮于PBS中。用注射器抽取细胞悬液接种于裸鼠的腋下,含活细胞数2×106。12只4周龄雌性BALB/c裸鼠分成4组在背部皮下接种SGC7901/VCR细胞。两周后瘤体可触及时(其大小约0.3~0.4cm),第1组尾静脉注射PBS作为空白对照,第2组尾静脉注射500mg/kg5-FU(每日1次),连续5d;第3组尾静脉注射500mg/kg 5-FU+200μM随机多肽(每日1次),连续5d;第4组尾静脉注射500mg/kg 5-FU+200μM GMBP42(每日1次),连续5d;于第6天处死部分小鼠,游标卡尺测量肿瘤大小。
结果显示,GMBP42能够逆转SGC7901/VCR的耐药特性,肿瘤体积明显小于单加5-FU、随机多肽及PBS组,且有统计学意义(p<0.05)(表5)。GMBP8;GMBP46裸鼠体内药物敏感性实验,也证实其能够逆转胃癌耐药细胞的耐药特性,缩小肿瘤体积,与随机多肽组、单用药物组及PBS组相比有明显差异,且有统计学意义(p<0.05)。
2.技术效果
本发明噬菌体随机肽库联合MTT药物敏感实验,体外筛选全细胞,或得到能与胃癌多药耐药细胞特异结合及逆转耐药的短肽GMBPs,经细胞ELISA、体外细胞结合实验、体外结合竞争抑制实验、免疫荧光检测等方法进行鉴定,证实GMBPs短肽与胃癌多药耐药细胞结合的特异性,而且MTT体外药物敏感实验及裸鼠体内药物敏感实验证实,GMBPs短肽能够逆转胃癌多药耐药细胞的耐药特性。这表明,本发明所建立的利用噬菌体多肽联合MTT体外药敏试验体外筛选,获得胃癌多药耐药细胞特异结合及逆转耐药的短肽模型是一种成功的模型,可以作为人胃癌多药耐药细胞膜表面耐药相关分子研究的技术平台。经氨基酸序列的同源性分析,在目前蛋白质数据库中未发现含有与本发明氨基酸序列完全一致的蛋白分子,因此本发明具有唯一性。这表明,这些短肽的发现,在胃癌的诊断、靶向治疗、多药耐药逆转治疗以及胃癌多药耐药相关分子机制的研究等方面,具有的潜在的应用价值及理论研究意义。现可用于以下几个方面:
1.肿瘤多药耐药细胞特异性结合及逆转耐药生物活性短肽的筛选
以正常细胞及肿瘤药敏细胞为阴性消减细胞,与原始肽库共孵育(原始肽库购于New England Biolabs公司),取未结合的噬菌体再和肿瘤耐药细胞共孵育,回收结合噬菌体,扩增后投入下一轮筛选,4轮后挑取噬菌体单克隆,直接进行单一药物浓度的MTT药物敏感试验筛选,得到的能降低肿瘤耐药细胞生存率的噬菌体克隆,再进行DNA序列测定及同源性分析。并利用噬菌体细胞结合实验、免疫细胞/组织化学染色、细胞结合竞争抑制实验、免疫荧光检测等方法鉴定了噬菌体克隆的结合特异性,同时利用MTT体外药敏实验、裸鼠体内药物敏感实验确定噬菌体克隆表达多肽的逆转耐药特性。为寻找肿瘤多药耐药细胞新的靶向药物、特异性逆转耐药的分子以及新的肿瘤多药耐药相关膜分子,提供了新的思路和方法。
2.胃癌诊断试剂盒的研制
将本发明中发现的特异性结合短肽与荧光物质、同位素等物质偶联,研制开发用于胃癌诊断的试剂盒,如果在更大标本范围内通过鉴定,有望成为胃癌耐药程度的诊断及判断胃癌预后的一种途径。
3.胃癌耐药细胞的靶向药物构建
对于有特异性结合能力,但没有生物学活性短肽,可以用它作为针对胃癌多药耐药细胞的靶向工具,用于胃癌多药耐药的靶向治疗,比如构建如下的胃癌靶向药物。
胃癌耐药细胞靶向性毒性复合肽的构建:将本发明中这些特异性短肽与白喉毒素、假单胞菌外毒素、产气荚膜梭状芽胞杆菌肠毒素等毒素分子相连接,利用特异性短肽将毒素导入胃癌多药耐药细胞,达到杀死胃癌多药耐药细胞的目的。
4.胃癌多药耐药逆转短肽药物的构建
将对胃癌多药耐药逆转具有生物学活性的短肽,直接研发具有逆转耐药作用的短肽药物。
5.GMBPs短肽结合靶分子的研究
通过对胃癌耐药细胞cDNA表达文库的筛选或亲和层析等方法,可以用GMBPs短肽为诱饵钓取其结合靶分子或其编码基因,从而阐明短肽与胃癌耐药细胞特异性结合的分子基础,并进一步研究此靶分子的功能,如果该靶分子在胃癌多药耐药发生中发挥重要作用,有可能成为胃癌治疗新的靶分子。
3.附图说明:
图1是噬菌体肽库体外筛选流程图
它表示与GES细胞、SGC7901细胞不结合的噬菌体再与SGC7901/ADR或者SGC7901/VCR共孵育,回收并扩增与其结合的噬菌体,重复进行四轮筛选。
图2是四轮筛选中噬菌体在SGC7901/ADR或SGC7901/VCR上逐渐富集图示
R1→R4,从SGC7901/ADR或SGC7901/VCR回收的噬菌体滴度增加了105-106倍。
图3是17个噬菌体克隆与SGC7901/ADR结合特异性的ELISA鉴定结果图示
17个噬菌体克隆中,AN2、AN41、AN46、AN49、AM410这5个克隆能特异性结合于SGC7901/ADR。
图4是7个噬菌体克隆与SGC7901/VCR结合特异性的ELISA鉴定结果
7个噬菌体克隆中,VN4、VN23、VM2这3个克隆能特异性结合于SGC7901/VCR。
图5是体外活细胞结合实验结果图示
AN2噬菌体在SGC7901/ADR上的回收量分别是对照细胞SGC7901组、GES组的32.4、14.8倍。这提示AN2噬菌体与SGC7901/ADR具有特异结合活性。
图6是细胞结合竞争抑制实验
活细胞结合竞争抑制实验及竞争ELISA实验均表明,随着GMBP1合成肽浓度的增高,抑制率不断上升,当GMBP1浓度在10-50μM时,抑制率维持在较高水平,这表明GMBP1合成肽对AN2噬菌体在SGC7901/ADR上的结合活性有竞争抑制作用。
图7是AN2噬菌体与SGC7901/ADR结合特异性的免疫荧光检测(×400)
SGC7901/ADR呈阳性,胞膜、胞浆发出绿色荧光,而SGC7901为阴性。这表明AN2噬菌体能特异结合于SGC7901/ADR上。胞核由DAPI染成蓝色。
图8是GMBP1合成肽对于AN2噬菌体与胃癌SGC7901/ADR细胞结合特异性阻断的免疫荧光检测(×400)
对于SGC7901/ADR细胞加入AN2噬菌体同时加入GMBP1合成肽,人胃癌SGC7901/ADR呈阴性,而未加入GMBP1合成肽呈阳性。
而SGC7901细胞加不加入GMBP1合成肽均为阴性。这表明GMBP1合成肽能特异结合于胃癌SGC7901/ADR细胞,并能阻断AN2噬菌体与SGC7901/ADR的结合。胞核由DAPI染成蓝色。
表4是VCR作用于加有多肽GMBP42、对随机多肽和PBS的SGC7901/VCR细胞株的细胞生存率(%)及IC50值。
*p<0.05 表4
加有GMBP42多肽的SGC7901/VCR细胞在同等药物浓度时,生存率及IC50值明显低于加对照噬菌体、随机多肽及只加长春新碱的SGC7901/VCR细胞,并有统计学差异(p<0.05)。说明VN23噬菌体多肽GMBP42对于SGC7901/VCR细胞的耐药特性有逆转作用。
表5是裸鼠体内药物敏感试验
多肽GMBP42对荷瘤小鼠肿瘤的影响。给药6天后5-FU+GMBP42组小鼠肿瘤直径明显小于PBS组、单加5-FU组及5-FU+随机多肽组,并有统计学差异(p<0.05)。
*p<0.05 表5
机译: 分离的重组多核苷酸,核酸序列,人gh变体,用于筛选怀疑患有gh功能异常的患者的筛选方法,用于执行筛选方法的合适试剂盒,gh1变体的用途,对变体特异的抗体,组成,载体,宿主细胞,用于制备由序列,载体或细胞编码或表达的gh,氨基酸序列或蛋白质变体的方法
机译: 对人IL-13具有结合特异性的抗体分子,包含它们的组合物,编码它们的dna序列,克隆载体和宿主细胞,其制备方法和用途
机译: 特异性结合α-肿瘤坏死因子(TNF-α)的免疫抑制剂包括兔子的CDR和人的框架序列,编码的核酸,Huesbed细胞,含有该成分的化合物,并用于治疗或预防TNF-Alf A引起的疾病。