胃癌MDR细胞特异性结合及耐药逆转短肽的筛选

摘要

本文研究目的：利用噬菌体呈现肽库技术，以胃癌药敏细胞及正常胃粘膜上皮永生化细胞为阴性细胞，采用消减筛选结合MTT药物敏感试验的方法，筛选能够特异性结合并逆转胃癌耐药细胞MDR表型的短肽。 研究方法： (1)利用噬菌体随机十二肽库，以正常胃粘膜上皮细胞GES及胃癌药敏细胞SGC7901为阴性吸附细胞，胃癌多药耐药细胞SGC7901/ADR或SGC7901/VCR为筛选靶细胞，进行全细胞消减筛选。 (2)筛选4轮后，随机挑取200个噬茵体克隆，利用单剂量化疗药物MTT体外药物敏感实验初步筛选出能够降低胃癌耐药细胞耐药特性的噬菌体克隆。 (3)筛选出的克隆进行序列测定，并进行短肽序列的同源性分析。 (4)根据序列分析的结果，选择重复次数多或有同源序列的噬菌体克隆，以ELISA法及结合实验鉴定噬菌体与胃癌多药耐药细胞SGC7901/ADR或SGC7901/VCR的结合活性，排除假阳性或无差异结合的噬菌体。 (5)免疫细胞荧光染色鉴定噬菌体与胃癌多药耐药细胞结合的特异性。 (6)人工合成阳性噬菌体呈现短肽，采用细胞结合竞争抑制实验及竞争ELISA验证合成肽对噬菌体与靶细胞结合的竞争性抑制作用。 (7)利用荧光标记的合成肽，以正常胃粘膜上皮细胞GES、多种胃癌药敏细胞、3T3细胞为阴性对照，观察阳性多肽与胃癌耐药细胞结合的特异性。 (8)激光聚焦荧光显微镜检测多肽结合的细胞部位。 (9)能够特异性结合胃癌耐药的阳性噬菌体克隆，利用MTT筛选能高效逆转胃癌多药耐药细胞MDR表型的克隆。 (10)筛选到的噬菌体克隆，合成短肽，利用MTT实验，流式细胞仪，初步探讨其对胃癌多药耐药细胞MDR表型逆转的机制。 (11)荷瘤裸鼠多肽体内靶向实验；荷瘤裸鼠体内药物敏感实验。 研究结果： (1)在4轮的筛选中，每轮均加入2×1011PFU的噬菌体，并滴定每轮洗脱液中的噬菌体数量，计算噬菌体的产率，噬菌体在靶细胞SGC7901/ADR或SGC7901/VCR上出现显著富集，而对照细胞SGC7901、GES则保持低水平的结合或有不同程度的减少。 (2)随机挑选200个噬菌体单克隆进行单剂量化疗药物MTT体外药物敏感实验初步筛选，与无关噬菌体及单用化疗药物相比发现其中161个克隆能够提高化疗药物对细胞的抑制率。 (3)将这161个克隆测序，最终产生50个序列，经BLAST分析，数据库中没有发现与这些短肽序列完全一致的蛋白质分子，与部分蛋白质有较高的同源性。 (4)根据测序及生物信息学分析的结果，选取24个克隆进行ELISA法及结合实验，结果显示GMBP1,GMBP6,GMBP8,GMBP9,GMBP23这5个噬菌体克隆在SGC7901和SGC7901/ADR上有明显的差异性结合；GMBP42,GMBP46这2个噬菌体克隆在SGC7901和SGC7901/VCR上有明显的差异性结合。其中GMBP1噬菌体克隆与SGC7901/VCR和SGC7901/ADR的结合能力均明显高于SGC7901。 (5)免疫细胞荧光染色显示，GMBP1噬菌体在SGC7901/VCR和SGC7901/ADR上的结合明显高于对照细胞SGC7901及GES。 (6)结合竞争抑制实验及竞争ELISA显示，GMBP1噬菌体与SGC7901/VCR和SGC7901/ADR的结合及内化能被其所呈现插入序列的人工合成肽GMBP1竞争抑制。 (7)荧光显微镜显示，标记的多肽FITC-GMBP1能特异性结合于SGC7901/VCR和SGC7901/ADR，而且结合能力明显高于SGC7901，AGS，MKN45，GES和3T3细胞。 (8)激光聚焦显微镜显示，FITC-GMBP1能内化入SGC7901/VCR和SGC7901/ADR，主要分布于胞浆中，并呈局部聚集特点。 (9)荷瘤裸鼠体内靶向实验荧光显微镜检测显示，FITC-GMBP1能特异性的与SGC7901/ADR形成的肿瘤结合，明显高于SGC7901形成的肿瘤，及心、脑、肺、脾、胃、肝、肠等组织。 (10)进一步利用体外药物敏感实验检测，在(4)中发现的7个特异性结合噬菌体克隆，结果显示GMBP8,GMBP42,GMBP46可以降低化疗药物的IC50值，其中GMBP42效果最明显。 (11)MTT实验结果显示GMBP42合成多肽作用的SGC7901/VCR细胞对长春新碱、阿霉素的敏感性显著升高；细胞的生长增殖速度并无明显的改变。 (12)流式细胞仪检测显示GMBP42合成多肽能够增强阿霉素诱导的SGC7901/VCR细胞凋亡；能够使SGC7901/VCR细胞内蓄积和潴留的阿霉素有所增加。 (13)荷瘤裸鼠体内药物敏感实验提示，与随机多肽组SP相比，GMBP42合成多肽能够有效地增强长春新碱的治疗效果。 研究结论： (1)获得了7个在胃癌耐药细胞与胃癌药敏细胞上有差异性结合的噬菌体克隆(GMBP1,GMBP6,GMBP8,GMBP9,GMBP23,GMBP42,GMBP46)，并证实其中的GMBP1噬菌体及其呈现的十二肽GMBP1均能与胃癌耐药SGC7901/VCR和SGC7901/ADR细胞特异性结合，有可能成为胃癌多药耐药诊断的标志分子或治疗的靶向分子，为进一步的研究奠定了实验基础。 (2)发现了3个能够逆转胃癌多药耐药细胞耐药表型的噬菌体克隆(GMBP8,GMBP42,GMBP46)，并证实其中GMBP42多肽能够逆转胃癌耐药SGC7901/VCR细胞的MDR表型，促进阿霉素诱导的凋亡，增加阿霉素的蓄积和潴留，有效地增强长春新碱对荷瘤裸鼠的治疗效果。GMBP42多肽很有可能成为胃癌多药耐药逆转剂的候选分子，为肿瘤多药耐药逆转的基础研究及应用提供有价值的实验基础。

目录

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缩略语表

摘要

前言

文献回顾

第一部分 利用噬菌体随机十二肽库筛选人胃癌多药耐药细胞特异结合及MDR逆转短肽

第二部分 胃癌多药耐药细胞特异性结合噬菌体克隆及短肽的鉴定

第三部分逆转胃癌多药耐药细胞MDR表型短肽的筛选及鉴定

全文小结

参考文献

个人简历

致谢