治疗广泛性焦虑症的中药制剂的质量控制方法

摘要

本发明提供了一种治疗广泛性焦虑症的中药制剂的质量控制方法，所述质量控制方法主要包括性状、检查、鉴别、含量测定项目中的部分或全部；其中性状应符合各制剂项下的有关规定；鉴别是对白芍、刺五加、五味子和菊花的薄层鉴别；检查应符合《中国药典》2000年版一部附录各制剂项下的有关规定；含量测定为对制剂中白芍的含量测定；与现有技术相比，本发明质量控制方法精密度高、重现性好、稳定性好、回收率高、专属性强，测量结果准确，能全面有效地控制本发明制剂的质量，从而保证了该制剂的临床疗效。

说明书

技术领域：本发明涉及一种治疗广泛性焦虑症的中药制剂的质量控制方法，属于对药品进行质量控制的技术领域。

背景技术：随着人类社会的不断进步，人们生活水平的不断提高，焦虑症的发病率呈逐年增长的趋势，据不完全统计焦虑症在我国的发病率每年有2600万人以上，给人们生活工作带来了极大的麻烦。随着人们的工作和生活节奏加快，竞争加剧等诸多因素的影响，发病率还在上升。西医对焦虑症患者采用三环类抗抑郁剂、B-肾上腺受体阻滞剂、单胺氧化酶抑制剂。但这些药物不能很快控制焦虑发作，且使用时间长才使效果稳定，但稍不留意即给病人留下药物依赖的弊端，使很多患者难以接受。现代研究认为焦虑症的发生发展与神经递质、受体、神经内分泌系统、免疫系统、循环系统和基因表达调节等多方面均有关系，而且焦虑症发病机理复杂，临床症侯多样。现有西药抗焦虑谱窄，且毒副作用大；中医药治疗焦虑立足于整体调节，具有理法方药的灵活性和药效的安全性等特点。目前，中医多根据病因病机和临床经验，对病人进行中西医辩证分型，并在此基础上加以中医辨证施治，疗效较好。但多用汤剂入药，存在服用量大，难以迅速及时地服药，影响药效的发挥，患者服用、携带不方便，阻碍了对治疗该病的深入研究和推广。本申请人研究开发的治疗广泛性焦虑症的中药制剂(申请号为200510003111.9)克服了上述不足，其疗效确切，无药物依赖，且贮藏、运输、携带及服用方便。但如果没有严格的质量控制标准，生产出来的产品质量可靠性不高、质量不稳定，从而会影响药品的临床疗效。

发明内容：

本发明的目的在于：提供一种治疗广泛性焦虑症的中药制剂的质量控制方法，本发明根据处方中各味药材的含量、特性及其制备工艺，研究制定了具体可行的鉴别和含量测定方法，以全面有效地控制该中药制剂的质量，从而保证该制剂的临床疗效。

本发明所述治疗广泛性焦虑症的中药制剂是这样构成的：按照重量份计算，它由白芍600-900份、酸枣仁400-700份、牡蛎400-700份、柏子仁300-600份、珍珠母400-700份、刺五加300-600份、百合200-400份、五味子200-400份、熟地黄300-600份、茯苓300-600份、合欢花200-400份和菊花100-300份加入适当辅料制备而成。

治疗广泛性焦虑症的中药制剂的制备方法为：取刺五加、五味子，粉碎成粗粉，用70％乙醇加热回流提取两次，每次2小时，合并醇提液，滤过，减压回收乙醇，浓缩至相对密度约1.10(60℃)的清膏，备用；珍珠母、牡蛎，加水煎煮提取1小时，滤过，滤液另器收集；残渣与白芍、酸枣仁、柏子仁、百合、熟地黄、茯苓、合欢花、菊花八味中药合并，加水煎煮提取三次，每次1小时，合并煎液，滤过，与上述提取液合并，离心，离心药液浓缩至相对密度约1.10(60℃)的清膏，加入上述清膏及适量的矫味剂，合并，混匀，取一部分药液喷雾干燥，制得浸膏粉，再与剩余的药液混合制粒，然后按常规方法制成不同的制剂。

本发明所述质量控制方法主要包括性状、检查、鉴别、含量测定项目中的部分或全部；其中性状应符合各制剂项下的有关规定；鉴别是对白芍、刺五加、五味子和菊花的薄层鉴别；检查应符合《中国药典》2000年版一部附录各制剂项下的有关规定；含量测定为对制剂中白芍的含量测定。

本制剂中白芍的鉴别方法是以芍药苷对照品为对照，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇∶甲酸＝40∶5∶10∶0.2为展开剂的薄层鉴别方法。

本制剂中刺五加的鉴别方法是以异秦皮啶对照品为对照，以环己烷∶氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇＝10∶10∶5∶2为展开剂的薄层鉴别方法。

本制剂中五味子的鉴别方法是以五味子对照药材为对照，以30～60℃石油醚∶甲酸乙酯∶甲酸＝15∶5∶1为展开剂的薄层鉴别方法。

本制剂中菊花的鉴别方法是以绿原酸对照品为对照，以甲苯∶醋酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸∶水＝2∶30∶2∶2∶4的上层液为展开剂的薄层鉴别方法。

鉴别方法包括以下项目的部分或全部：

(1)取本制剂1g，加乙醇20ml，超声10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇∶甲酸＝40∶5∶10∶0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同蓝紫色斑点；

(2)取本制剂10g，加75％乙醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，置分液漏斗中，用氯仿提取2次，每次5ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取异秦皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷∶氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇＝10∶10∶5∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

(3)取本制剂2.5g，加氯仿20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液；另取五味子对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以30～60℃石油醚∶甲酸乙酯∶甲酸＝15∶5∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

(4)取本制剂3.5g，研细，加石油醚20ml，超声处理10分钟，弃去石油醚，药渣挥干，加稀盐酸1ml与醋酸乙酯50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2～5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯∶醋酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸∶水＝2∶30∶2∶2∶4的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。

本制剂中白芍的含量测定方法是以芍药苷对照品为对照，以乙腈∶0.05％磷酸溶液＝15∶85为流动相的高效液相色谱法。

具体的含量测定方法为：

照《中国药典》2000年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈∶0.05％磷酸溶液＝15∶85为流动相；检测波长为230nm；柱温25℃；理论板数按芍药苷峰计算应不低于1300；

对照品溶液的制备  精密称取芍药苷对照品适量，加稀乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  取本制剂0.4g，研细，精密称定，置25ml容量瓶中，加稀乙醇20ml，超声处理1小时，取出，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法  分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂中每克含白芍以芍药苷C₂₃H₂₈O₁₁计，不得少于4mg。

本发明所述质量控制方法包括：

性状：药物或其内容物显黄褐色至棕褐色；气微，味微酸甜；

鉴别：(1)取本制剂1g，加乙醇20ml，超声10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇∶甲酸＝40∶5∶10∶0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同蓝紫色斑点；

(2)取本制剂10g，加75％乙醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，置分液漏斗中，用氯仿提取2次，每次5ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取异秦皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷∶氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇＝10∶10∶5∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

(3)取本制剂2.5g，加氯仿20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液；另取五味子对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以30～60℃石油醚∶甲酸乙酯∶甲酸＝15∶5∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

(4)取本制剂3.5g，研细，加石油醚20ml，超声处理10分钟，弃去石油醚，药渣挥干，加稀盐酸1ml与醋酸乙酯50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2～5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯∶醋酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸∶水＝2∶30∶2∶2∶4的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

检查：应符合《中国药典》2000年版一部附录各制剂项下有关的各项规定；

含量测定：照《中国药典》2000年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈∶0.05％磷酸溶液＝15∶85为流动相；检测波长为230nm；柱温25℃；理论板数按芍药苷峰计算应不低于1300；

对照品溶液的制备  精密称取芍药苷对照品适量，加稀乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  取本制剂0.4g，研细，精密称定，置25ml容量瓶中，加稀乙醇20ml，超声处理1小时，取出，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法  分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂中每克含白芍以芍药苷C₂₃H₂₈O₁₁计，不得少于4mg。

本申请人进行了一系列的试验研究，以确定最佳的质量控制方法，其结果如下：

一、鉴别

本制剂由白芍、酸枣仁、五味子、刺五加等12味中药的提取物及适量辅料制备而成，考虑到处方药味较多，成分复杂，干扰因素多等，选用薄层色谱鉴别方法，主要针对方中君药及具有鉴别特征的药味进行研究。试验结果证明，本发明标准所选用的鉴别方法简便，重现性和专属性良好。

(1)白芍的薄层鉴别：白芍为方中主药，含有芍药苷、苯甲酰芍药苷、没食子酰芍药苷、胡萝卜苷、苯甲酸、挥发油等。其中芍药苷为其主要成分和特征成分，故选择芍药苷为对照品进行薄层色谱鉴别，同时选用缺芍药苷样品为阴性对照品。以《中国药典》(2000年版一部)白芍项下的色谱条件进行鉴别，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂；同时，以氯仿-甲醇(8∶1)为验证系统。分离效果以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)较理想。故白芍的薄层鉴别列入本发明内容。

(2)刺五加的薄层鉴别：刺五加根部含有多种糖苷、还含白桦脂酸、木栓酮、异秦皮啶、苦杏仁苷、多糖类等。其中有效成分为糖苷、异秦皮啶及总黄酮。以《中国药典》(2000年版一部)刺五加项下的色谱条件，选取异秦皮啶对照品进行薄层色谱鉴别，同时选用缺刺五加样品为阴性对照品，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(9∶1)为展开剂，置紫外灯(365nm)下检视，结果分离效果不理想。后参照三类新药“五加生化胶囊”的薄层色谱条件，以环己烷-氯仿-乙酸乙酯-甲醇(10∶10∶5∶2)为展开剂，结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，分离效果好，故选用此方法鉴别刺五加。

(3)五味子的薄层鉴别：五味子的化学成分主要是多种木脂素、挥发油、有机酸等。其中主要特征性成分为五味子甲素。以《中国药典》(2000年版一部)五味子项下的色谱条件，选取五味子对照药材进行薄层色谱鉴别，同时选用缺五味子样品为阴性对照品，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)为展开剂；同时，以甲苯-醋酸乙酯(9∶1)为验证系统，置紫外灯(254nm)下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，分离效果理想。故五味子的薄层鉴别列入本发明内容。

(4)酸枣仁的薄层鉴别：酸枣仁的主要成分为酸枣仁皂苷A、B和三萜类成分，并含多种酸枣仁生物碱，黄酮和氨基酸类。其中主要特征性成分为酸枣仁皂苷A、B。以《中国药典》(2000年版一部)酸枣仁项下的色谱条件，选取酸枣仁皂苷A、B对照品进行薄层色谱鉴别，同时选用缺酸枣仁样品为阴性对照品，分别点于同一硅胶G薄层板上，以水饱和的正丁醇为展开剂，结果分离效果不理想，样品斑点微弱。后又查阅了皂苷的常用鉴别方法，结合本品性质，拟定了酸枣仁的TLC鉴别。实验以氯仿-甲醇-水-乙酸(15∶35∶10∶0.4)为展开剂，喷以10％硫酸乙醇溶液，供试品色谱中，样品与对照品色谱中相对应的斑点不清晰，故酸枣仁的薄层鉴别未列入本发明内容。

(5)菊花的薄层鉴别：菊花的主要有效成分为挥发油和黄酮类。以《中国药典》(2000年版一部)菊花项下的色谱条件，选取绿原酸对照品进行薄层色谱鉴别，同时选用缺菊花样品为阴性对照品，以甲苯-醋酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水(2∶30∶2∶2∶4)的上层液为展开剂，分别点于同一聚酰胺薄膜上，置紫外灯(365nm)下检视。同时，以甲苯-醋酸乙酯-甲醇-水(4∶4∶2∶5)的上层液为验证系统。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，分离效果理想。故菊花的薄层鉴别列入本发明内容。

(6)合欢花的薄层鉴别：合欢花含15种氨基酸，其中以亮氨酸和谷氨酸含量最高；还含有丰富的微量元素、有机酸、蚯蚓解热碱、蚯蚓素等成分。以《中国药典》(2000年版一部)合欢花项下的色谱条件，选取合欢花对照药材进行薄层色谱鉴别，同时选用缺合欢花样品为阴性对照品，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯为展开剂，喷以5％硫酸香草醛溶液，结果分离效果不理想，样品斑点微弱。后又查阅了相关文献，结合本品性质和提取工艺，拟定了合欢花的TLC鉴别，以醋酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)为展开剂，喷以三氯化铝试液，供试品色谱中，样品与对照药材色谱中相对应的斑点颜色一致，但阴性有干扰。故合欢花的薄层鉴别未列入本发明内容。

(7)熟地黄的薄层鉴别：熟地黄的主要成分为5-羟甲基糠醛、环烯醚萜、单萜及其苷类等。其中主要特征性成分为5-羟甲基糠醛。以《中国药典》(2000年版一部)熟地黄项下的色谱条件，选取5-羟甲基糠醛对照品进行薄层色谱鉴别，同时选用缺熟地黄样品为阴性对照品，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯(1∶1)为展开剂，置紫外光灯(254nm)下检视，结果分离效果不理想，样品在与对照品色谱中相对应的位置上无斑点。后又查阅了相关文献，结合本品性质和提取工艺，因5-羟甲基糠醛类成分是脂溶性的，而本品在提取工艺中是水提取，因此选用5-羟甲基糠醛作定性指标不适宜，而熟地黄多糖类成分无相应的对照品，故熟地黄的薄层鉴别未列入本发明内容。

(8)百合的薄层鉴别：百合的主要成分为甾体糖苷、生物碱，还含有5-羟甲基糠醛、环烯醚萜、单萜及其苷类等。以《中国药典》(2000年版一部)百合项下的色谱条件，选取百合对照药材进行薄层色谱鉴别，同时选用缺百合样品为阴性对照品，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以氯仿-甲醇-醋酸乙酯(22∶5∶6)为展开剂，置紫外光灯(254nm)下检视，结果分离效果不理想，样品在与对照药材色谱中相对应的位置上无斑点。后又查阅了相关文献，结合本品性质和提取工艺，因薄层鉴别的成分是脂溶性的，而本品在提取工艺中是水提取，因此选用《中国药典》(2000年版一部)百合项下的色谱条件作定性指标不适宜。又查阅了相关文献，结合本品性质和提取工艺，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲醇(7∶3∶1)为展开剂，置紫外光灯(365nm)下检视，分离效果仍不理想。故百合的薄层鉴别未列入本发明内容。

(9)茯苓的薄层鉴别：茯苓中主要含有β-茯苓聚糖、三帖类化合物、麦角甾醇等。多糖为茯苓的主要有效成分。选取茯苓对照药材进行薄层色谱鉴别，同时选用缺茯苓样品为阴性对照品，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙醚(3∶2)为展开剂，置紫外光灯(365nm)下检视，结果分离效果不理想，样品在与对照药材色谱中相对应的位置上无斑点。故茯苓的薄层鉴别未列入本发明内容。

因珍珠母、柏子仁、牡蛎无对照药材和对照品，故未进行薄层鉴别研究。

二、检查

1.按《中国药典》2000年版一部附录IC颗粒剂通则规定检查。

(1)粒度取三批样品单剂量分装的颗粒剂5袋，照粒度检查法测定，结果不能通过一号筛和能通过四号筛的颗粒和粉末总和均未超过8.0％，见表1。

(2)水分三批样品照水分测定第一法(烘干法)(附录IXH)测定，结果均未过5.0％，符合规定要求，见表1。

(3)溶化性取三批样品测定，结果全部溶化，符合规定要求，见表1。

(4)装量差异取三批样品各10袋测定，结果均未超过±5.0％，符合规定要求，见表1。

                表1  三批样品通则检查结果

批号粒度(％)溶化性水分(％)装量差异(％)0203014.8全部溶化2.4-3.0～3.00203024.8全部溶化2.6-2.0～3.00203034.6全部溶化2.8-2.0～3.0

2.微生物限度按卫生部药品卫生标准规定，口服固体制剂(不含部分生药原粉)每克含细菌数不得超过1000个，霉菌数不得超过100个，不得检出大肠杆菌及活螨。三批样品经检验均符合规定，结果见表2。

              表2  三批样品微生物限度检查结果

批号  细菌数(个/g)  霉菌数(个/g)大肠杆菌活螨020301  ＜10  ＜10未检出未检出020302  ＜10  ＜10未检出未检出020303  ＜10  ＜10未检出未检出

3.砷盐按《中国药典》2000年版一部附录IXF砷盐检查法第二法，标准管溶液含砷5ug/ml，结果见表3。

    表3  三批样品砷盐检查结果

批号  取样量(g)结果020301  2.5  5.0小于百万分之二小于百万分之一020302  2.5  5.0小于百万分之二小于百万分之一020303  2.5  5.0小于百万分之二小于百万分之一

检查三批样品，结果砷盐含量均小于百万分之一，考虑到本制剂砷盐含量很低，此项检查未列入本发明质量标准。

4.重金属  按《中国药典》2000年版一部附录IXE重金属检查法第二法，标准管溶液含铅20ug/ml，检查结果见表4。

表4  三批样品重金属检查结果

批号取样量(g)结果

  020301  1.0  2.0  小于百万分之二十  小于百万分之十  020302  1.0  2.0  小于百万分之二十  小于百万分之十  020303  1.0  2.0  小于百万分之二十  小于百万分之十

检查三批样品，结果重金属含量均小于百万分之十，故此项检查亦未列入本发明质量标准。

三、含量测定

白芍为本处方君药，对本制剂疗效起重要作用，白芍的含量可作为控制本制剂内在质量的一项指标，为含量测定的首选对象。据文献报道，芍药苷含量测定采用高效液相色谱法，能有效地控制与反映质量。

经实验研究，建立起高效液相色谱法测定芍药苷含量。试验对方法学(供试品的提取条件、检测波长、色谱条件、缺芍药苷阴性对照的考察、线性、精密度、重现性、稳定性、加样回收率、样品测定等)进行了系统考察。结果：供试品加稀乙醇20ml，超声处理1小时即可。用芍药苷溶液作为对照，检测波长230nm。精密度试验：供试品溶液连续测定5次，RSD为0.76％。稳定性试验：供试品溶液于制样后8小时内进样5次，每2小时进样一次，RSD分别为0.77％。重现性试验：供试品平行试验5次，RSD为1.18％。加样回收率试验：三个梯度，每一梯度各平行试验2次共6份，结果平均回收率为102.21％；RSD为1.4％。上述试验结果均符合要求，因此列入本发明内容。

1.药味的选择

白芍为方中君药，故考虑测定其中芍药苷含量来控制药品质量，以有效控制产品质量。

2.仪器与试药

仪器：HP-1100高效液相色谱仪(美国惠普)；惠普四元梯度泵；惠普自动进样器；惠普柱温箱；惠普二级管阵列检测器；电子分析天平(十万分之一，德国Satoriüs公司)；SB3200超声波清洗器(50KHz)。

试剂：乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯；稀乙醇照《中国药典》2000年版一部附录102页“稀乙醇”配置，含乙醇浓度为50％。

对照品：芍药苷(中国药品生物制品检定所，含量测定用)，批号(0736-9710)，采用峰面积归一化法计算，芍药苷对照品含量＞98％。

样品：本发明颗粒剂(批号：011201，020301，020302，020303)。

3.色谱条件

(1)色谱柱：Hypersil-ODS C18(125mm×4mm，5μm)；

(2)保护柱：Hypersil-ODS(20mm×2.1mm，30μm)；

(3)流动相：乙腈-0.05％磷酸(15∶85)；

(4)流速：0.6ml/min；

(5)检测波长：230nm；

(6)柱温：25℃；

(7)检测器：惠普二级管阵列检测器。

取对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液，分别进样5μl，结果芍药苷保留时间约7分钟，可使芍药苷完全分离，理论板数按芍药苷峰计算，均不低于1500。阴性在芍药苷对照品出峰时间无色谱峰。

4.溶液的制备

(1)对照品溶液的制备精密称取对照品适量，加稀乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

(2)供试品溶液的制备申请人对供试品溶液的制备方法进行了考察。

①提取溶剂的选择因芍药苷溶于乙醇、甲醇等溶剂，因此在两种极性溶剂中选择。取样品(批号011201)7份，每份约1g，研细，精密称定，分别置25ml容量瓶中，加甲醇、50％甲醇、乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇各20ml，超声处理0.5小时，放冷，加相同溶剂至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，精密量取续滤液5μl，注入液相色谱仪，测定，结果见表5。

   表5  不同提取溶剂对测定结果的影响

  样品号  提取溶剂  芍药苷含量(mg/g颗粒)  1  甲醇  4.176  2  50％甲醇  4.315  3  乙醇  1.386  4  70％乙醇  4.262  5  50％乙醇  4.359  6  30％乙醇  4.183

由表5可见，用50％甲醇与50％乙醇作提取溶剂含量基本一致，故采用50％乙醇作提取溶剂。选择50％乙醇(稀乙醇)作为提取溶媒。

②提取方法的选择  《中国药典》2000年版一部成方制剂“八珍丸”、“逍遥丸(水丸、大蜜丸)”、“猴头健胃灵胶囊”等，几乎所有HPLC法测定芍药苷含量的固体制剂和药材，均采用超声提取法，因此选择超声提取法作为提取方法。

③提取时间的考察  取样品(批号011201)5份，每份约0.8g，研细，精密称定，分别置25ml容量瓶中，加稀乙醇20ml，超声处理15、30、45、60、90分钟，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，精密量取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定，结果见表6。

      表6  提取时间对测定结果的影响

  样品号  提取时间(分钟)  芍药苷含量(mg/g颗粒)  1  15  3.147  2  30  3.755  3  45  4.037  4  60  4.371  5  90  4.320

从表6可见，提取时间以60和90分钟较好，选择超声提取60分钟。

综上所述，供试品溶液的制备方法如下：取本制剂0.4g，研细，精密称定，置25ml容量瓶中，加稀乙醇20ml，超声处理1小时，取出，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，弃去粗滤液，取续滤液，即得。

(3)阴性供试品溶液的制备  按本制剂制备方法，处方中去白芍制成缺白芍阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性供试液。

5.方法学考察

(1)阴性对照试验按供试品溶液制备方法制备阴性供试液，进样分析，结果表明，其他成分对芍药苷测定无干扰。

(2)线性关系的考察精密吸取对照品溶液(0.105mg/ml)2、4、6、10、15μl进样，测定结果见表7，绘制标准曲线。

               表7  线性关系测定数据

 进样量(μg)  0.210  0.420  0.630  1.050  1.575 峰面积(A)  423.8  864.3  1254.9  2060.7  3102.3

结果表明在0.210～1.575μg范围内线性关系良好。

(3)精密度试验取本制剂(批号011201)1份照供试品溶液的制备方法制备供试液，用0.45μm滤膜滤过，精密量取续滤液5μl，注入液相色谱仪，重复进样5次，记录色谱图，测定积分面积，结果见表8。

          表8  方法精密度试验结果

  测定次数  峰面积  平均值  RSD(％)  1  698.6  707.4  0.76  2  709.1  3  712.9  4  708.5  5  709.6

(4)重现性试验  取同一批号样品(批号011201)5份，各精密称定，照供试品溶液的制备方法制备5份供试液，分别注入液相色谱仪，测定芍药苷含量，结果见表9。

                     表9  重现性试验(n＝5)

  样品号  芍药苷含量(mg/g颗粒)  平均含量(mg/g颗粒)  RSD(％)  1  4.417  4.432  1.18  2  4.509  3  4.365  4  4.445  5  4.424

(5)稳定性考察  取样品一份(批号011201)，照供试品溶液的制备方法制备供试液，8小时内进样5次，每2小时进样一次，记录积分面积，见表10。说明供试品溶液在8小时内测定，对含量测定结果无影响。

                  表10  供试品溶液的稳定性考察结果

 测定时间(H)  0  2  4  6  8 RSD(％) 峰面积  699.2  709.6  697.5  697.5  696.9 0.77

(6)加样回收率精密称取已知含量的供试品(批号011201)6份，精密加入对照品适量(三种不同水平，各二份)，按本发明芍药苷含量测定方法进行含量测定，计算回收率，结果见表11。

                        表11  加样回收试验结果表(n＝6)

  样品号 供试品重(g)  加对照品(mg)  回收率(％)  平均回收率(％) RSD(％)

  1  0.2334  1.050  101.51  2  0.2276  1.050  100.56  3  0.2195  0.7875  100.86  102.21  1.40  4  0.2183  0.7875  103.40  5  0.2251  0.525  102.91  6  0.2231  0.525  104.04

6.样品的含量测定

照本发明质量标准含量测定项下的方法，对三批样品供试品进行含量测定，结果见表12。                 表12  3批样品的含量测定结果

  样品号  芍药苷含量(mg/g颗粒)  平均含量(mg/g颗粒)  RSD(％)  1  4.417  4.432  1.18  2  4.509  3  4.365  4  4.445  5  4.424

由表12可见，三批样品平均含量为4.869mg/g，按下浮20％计为3.895mg/g，因此将限度暂订为本制剂含白芍以芍药苷(C₂₃H₂₈O₁₁)计不得少于4mg/g。

与现有技术相比，本发明质量控制方法精密度高、重现性好、稳定性好、回收率高、专属性强，测量结果准确，能全面有效地控制治疗广泛性焦虑症的中药制剂的质量，从而保证了该制剂的临床疗效。

具体实施方式：

本发明的实施例1：

性状：药物或其内容物显黄褐色至棕褐色；气微，味微酸甜；

鉴别：(1)取本制剂1g，加乙醇20ml，超声10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇∶甲酸＝40∶5∶10∶0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同蓝紫色斑点；

(2)取本制剂10g，加75％乙醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，置分液漏斗中，用氯仿提取2次，每次5ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取异秦皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷∶氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇＝10∶10∶5∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

(3)取本制剂2.5g，加氯仿20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液；另取五味子对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以30～60℃石油醚∶甲酸乙酯∶甲酸＝15∶5∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

(4)取本制剂3.5g，研细，加石油醚20ml，超声处理10分钟，弃去石油醚，药渣挥干，加稀盐酸1ml与醋酸乙酯50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯∶醋酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸∶水＝2∶30∶2∶2∶4的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

检查：应符合《中国药典》2000年版一部附录各制剂项下有关的各项规定；

含量测定：照《中国药典》2000年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈∶0.05％磷酸溶液＝15∶85为流动相；检测波长为230nm；柱温25℃；理论板数按芍药苷峰计算应不低于1300；

对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加稀乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备取本制剂0.4g，研细，精密称定，置25ml容量瓶中，加稀乙醇20ml，超声处理1小时，取出，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法  分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂中每克含白芍以芍药苷C₂₃H₂₈O₁₁计，不得少于4mg。

本发明的实施例2：

性状：药物或其内容物显黄褐色至棕褐色；气微，味微酸甜；

鉴别：(1)取本制剂1g，加乙醇20ml，超声10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇∶甲酸＝40∶5∶10∶0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同蓝紫色斑点；

(2)取本制剂3.5g，研细，加石油醚20ml，超声处理10分钟，弃去石油醚，药渣挥干，加稀盐酸1ml与醋酸乙酯50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯∶醋酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸∶水＝2∶30∶2∶2∶4的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

检查：应符合《中国药典》2000年版一部附录各制剂项下有关的各项规定；

含量测定：照《中国药典》2000年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈∶0.05％磷酸溶液＝15∶85为流动相；检测波长为230nm；柱温25℃；理论板数按芍药苷峰计算应不低于1300；

对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加稀乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  取本制剂0.4g，研细，精密称定，置25ml容量瓶中，加稀乙醇20ml，超声处理1小时，取出，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法  分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂中每克含白芍以芍药苷C₂₃H₂₈O₁₁计，不得少于4mg。

本发明的实施例3：

性状：药物或其内容物显黄褐色至棕褐色；气微，味微酸甜；

鉴别：(1)取本制剂10g，加75％乙醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，置分液漏斗中，用氯仿提取2次，每次5ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取异秦皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷∶氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇＝10∶10∶5∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

(2)取本制剂2.5g，加氯仿20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液；另取五味子对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以30～60℃石油醚∶甲酸乙酯∶甲酸＝15∶5∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

含量测定：照《中国药典》2000年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈∶0.05％磷酸溶液＝15∶85为流动相；检测波长为230nm；柱温25℃；理论板数按芍药苷峰计算应不低于1300；

对照品溶液的制备  精密称取芍药苷对照品适量，加稀乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  取本制剂0.4g，研细，精密称定，置25ml容量瓶中，加稀乙醇20ml，超声处理1小时，取出，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法  分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂中每克含白芍以芍药苷C₂₃H₂₈O₁₁计，不得少于4mg。

本发明的实施例4：

性状：药物或其内容物显黄褐色至棕褐色；气微，味微酸甜；

鉴别：(1)取本制剂1g，加乙醇20ml，超声10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各8μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇∶甲酸＝40∶5∶10∶0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同蓝紫色斑点；

(2)取本制剂2.5g，加氯仿20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液；另取五味子对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各8μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以30～60℃石油醚∶甲酸乙酯∶甲酸＝15∶5∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

(3)取本制剂3.5g，研细，加石油醚20ml，超声处理10分钟，弃去石油醚，药渣挥干，加稀盐酸1ml与醋酸乙酯50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯∶醋酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸∶水＝2∶30∶2∶2∶4的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

检查：应符合《中国药典》2000年版一部附录各制剂项下有关的各项规定。

本发明的实施例5：

性状：药物或其内容物显黄褐色至棕褐色；气微，味微酸甜；

鉴别：取本制剂10g，加75％乙醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，置分液漏斗中，用氯仿提取2次，每次5ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取异秦皮啶对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2000年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各8μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷∶氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇＝10∶10∶5∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；

检查：应符合《中国药典》2000年版一部附录各制剂项下有关的各项规定；

含量测定：照《中国药典》2000年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈∶0.05％磷酸溶液＝15∶85为流动相；检测波长为230nm；柱温25℃；理论板数按芍药苷峰计算应不低于1300；

对照品溶液的制备  精密称取芍药苷对照品适量，加稀乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  取本制剂0.4g，研细，精密称定，置25ml容量瓶中，加稀乙醇20ml，超声处理1小时，取出，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法  分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂中每克含白芍以芍药苷C₂₃H₂₈O₁₁计，不得少于4mg。