柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测引物、探针、固相化试剂盒及其检测方法

摘要

本发明涉及用于柑桔黄龙病菌检测的寡核苷酸引物、柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测探针、固相化试剂盒及其检测方法，它是专门针对柑桔黄龙病亚洲韧皮部杆菌而建立的一种快速检测方法，从制样到检出时间仅需3小时，而且监测灵敏度高、特异性强、稳定可靠。该方法不仅克服了现有的依据症状学的常规诊断方法时有误判、电镜观察法因菌体分布不均容易漏诊、单克隆抗体法因抗体制备难度大，且有非特异反应等不足；而且可以避免常规PCR的假阴性和假阳性。固相化试剂盒操作方便，使用简单；检测方法灵敏度高、特异性强、稳定可靠；适合于进出口柑桔鲜果的口岸检疫；柑桔种苗、接穗等无症带菌材料的调运检疫检验以及非疫区柑桔黄龙病的早期预警监测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术，具体涉及一种对柑桔黄龙病菌(CandidatusLiberibacter asiaticus)的简单、快速、特异、灵敏的固相化分子检测试剂盒，适合于口岸检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

背景技术

柑桔黄龙病(Citrus Huanglongbing Disease，HLB)是一种毁灭性植物病害，被列入国内外重要检疫性病害。该病主要发生于亚洲，非洲40多个国家，国外主要分布于东南亚、南非、东非、阿拉伯半岛及留尼旺岛、印度洋的毛里求斯、马达加斯和南美等地；2004年4月巴西圣保罗、2005年9月美国佛罗里达相继发现HLB。90年代末期我国生产柑桔的17省、市中，有11个省市受黄龙病侵染。

柑桔黄龙病由人工培养的韧皮部杆菌所引起，目前已报道CandidatusLiberibacter asiaticus，Ca.L.africanus和Ca.L.americanus三个暂定种。该病由柑桔木虱(Diaphorina citri)取食新梢以及嫁接带菌接穗在田间传播，随带病(虫)种苗的调运而远距离传播。柑桔发病后轻者影响产量和品质，重者则造成柑桔树的枯死，对于严重发病的产区只有将病树挖除烧毁。病区内，新种植的幼龄树容易感病，且一旦发病就很快衰老死亡，而成龄树感病较轻，发病后还可维持2-3年时间，所以新果园比老果园更快受到摧毁。感病果树的成熟果实变小，畸形，种子败育，无法食用。

受全球性暖冬气候影响，传病虫媒越冬北界逐年北移，同时由于柑桔产业的发展，带病(虫)柑桔种苗的私调乱引增多而导致该病发生面积有逐年扩大的趋势，对我国柑桔产业形成极大威胁，目前除挖除烧毁外，国内外对柑桔黄龙病尚无很好的根除方法，唯有通过设立和建设无病区、加强植物检疫严防病害蔓延和扩散。因此，病害的早期诊断和疫情监测、病原菌鉴定技术对于病害的检验检疫和防范控制、确保柑桔生产安全都具有重要意义。

目前国内外对该病主要采取以下几种方法进行诊断鉴定：(1)根据HLB症状学观测。由于黄龙病症状复杂，易与缺素症状或其他病虫危害症状相互混淆，容易误判。(2)病原菌形态观察，利用电镜切片检查菌体的形态结构。因初期病树组织内病菌数量少，分布不均，检出率低，容易漏诊。(3)免疫学方法，因病原菌抗体制备难度大，且效价较低，并伴有非特异性反应干扰；多适于荧光检测而难未能推广应用。法国率先对HLB进行了PCR分子检验技术研究，利用亚洲韧皮部杆菌的In2.6特征片段设计出特异引物对，建立了柑桔黄龙病菌PCR扩增方法，但因扩增片段过大，扩增结果不够稳定且不能直接区别亚洲和非洲黄龙病菌，必须通过扩增产物的酶切图谱等局限而使得其实际应用受到限制。

继常规PCR技术之后，新兴的实时荧光定量PCR技术凭借其对初始模板量准确定量、灵敏度高、特异性强、闭管操作、简便迅速等优点，已经成为分子生物学主流技术，在植物疫害生物的快速检测和早期诊断中开始崭露头角。国内外已有部分植物病原菌的实时荧光PCR检测技术问世。

实时定量荧光PCR是利用荧光信号伴随着PCR产物的增加而增强的原理，在PCR扩增过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，在99.7％的置信度时计算出大于平均值的荧光值即阈值，然后收集荧光信号增强到预定阈值时的PCR循环次数(即Ct值)，Ct值愈大，表明靶标病原菌的起始菌量或模板拷贝数愈少，反之愈多，该值与PCR反应体系中起始DNA模板量的对数值之间有严格的线性关系。利用柑桔黄龙病菌重组子阳性对照的10x梯度稀释标准品的Ct值绘制成标准曲线，再根据检测样品的Ct值就可以准确地测定靶标病原菌的起始模板拷贝数。

实时荧光PCR根据其产生荧光的原理的不同可以粗分为使用探针和不使用探针的两类方法。前一类的代表是荧光标记探针法，该方法的特异性很高，能较有效的避免常规PCR难于避免的非特异性扩增和假阳性现象，但是它的检测成本相对较高；后一类的代表就是SYBR Green I荧光染料法，这种方法价格相对便宜，由于每一双链DNA分子能和多个SYBR Green I染料分子非特异性结合，荧光信号比前者更强，因此灵敏度也就更高，但该方法同时对引物自身的特异性要求也较高，且要避免形成引物二聚体，造成检测的假阳性，因此设计和优化工作一定要仔细完成。SYBR Green荧光染料与双链DNA分子非特异性结合的问题还可以通过做熔解曲线分析来帮助解决，即通过观察样品和各个对照品的熔解曲线峰值的分布情况来判断扩增曲线中荧光信号的增长是否是由靶序列的扩增引起的。将实时荧光PCR检测方法应用于植物病原细菌的检测，无论在国内外都还是刚刚起步，目前尚无柑桔黄龙病菌的实时荧光PCR检测试剂盒问世，而且现有的试剂盒都必须低温保存和寄送；反应试剂需要自行配制；本专利在精心优化和反复测试的基础上，研制出的可以常温储运的预混冻干固相化试剂盒，具有开启即用，标准统一、简单方便等优点。可以满足口岸调运、农业生产、植保植检部门的科研与检验检疫的快速、准确、安全的基本要求。

发明内容

本发明的目的旨在克服上述现有技术的不足，提出简便快速、准确可靠、灵敏度高、特异性强的检测柑桔黄龙病菌的引物、探针、固相化试剂盒及两种实时荧光PCR检测方法。

实现上述目的的技术方案：

用于柑桔黄龙病菌检测的寡核苷酸引物是，包括：

寡核苷酸引物对：5’-GAAGCTGGTGGAGGTG-3’

                5’-GACTGCCCAACGAAAA-3’        (序列号：NO.1)；

寡核苷酸引物对：5’-TTTCGTTGGGCAGTCT-3’

                5’-ATCGGGTAAAGAAGCA-3’        (序列号：NO.2)；

寡核苷酸引物对：5’-TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA-3’

                5’-ACGAAAAGATCAGATATTCCTCTA-3’(序列号：NO.3)；

寡核苷酸引物对：5’-GAGGTGTAAAAGTTGCCAAA-3’

                5’-CGAAAAGATCAGATATTCCTCTA-3’ (序列号：NO.4)。

本发明提供的一种用于柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针的序列是在5’-AAT CGT CTC GTC AAG ATT GCT ATC CGT GAT ACT AGT ATT-3’两端向上游或下游移动1-4个碱基的区域内形成的探针序列。其较佳的探针的序列是5’-ATCGTCTCGTCAAGATTGCTATCCGTGATACTAG-3’。(探针编号：NO.3)。

本发明提供的另一种用于柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针的序列是在5’-ATC GTC TCG TCA AGA TTG CTA TCC GTG ATA CTA GTA TTA-3’两端向上游或下游移动1-4个碱基的区域内形成的探针序列。其较佳的探针的序列是5’-TCG TCTCGT CAA GAT TGC TAT CCG TGA TAC TAG T-3’。(探针编号：NO.6)。

所述用于柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测的荧光标记寡核苷酸探针，荧光报告基团FAM490标记在5’端，而自身不发光的荧光淬灭基团标记在3’端。在3’端的其自身不发光的荧光淬灭基团可以用Eclipse所代替。

用于柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测的试剂盒，其组成为：样品核酸提取试剂、核酸扩增固相化试剂、无害化定量标准品：HLB重组子阳性对照、健康植株阴性对照。

其中使用SYBR Green实时荧光PCR检测方法的试剂盒所使用的引物为NO.1或NO.2寡核苷酸引物对，而使用荧光标记探针实时荧光PCR检测方法的试剂盒所使用的引物为NO.3和NO.4寡核苷酸引物对，所使用的探针为在5’-AAT CGT CTC GTC AAG ATT GCT ATCCGT GAT ACT AGT ATT-3’两端向上游或下游移动1-4个碱基的区域内形成的探针序列或者在5’-ATC GTC TCG TCA AGA TTG CTA TCC GTG ATA CTA GTA TTA-3’两端向上游或下游移动1-4个碱基的区域内形成的探针序列的荧光标记探针。

柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检体系构建，包括以下步骤：(1)先对柑桔黄龙病菌及其近似种或相关种进行序列比较分析，找出柑桔黄龙病菌不同于其它韧皮部杆菌或相关种的特有的碱基序列；(2)按照SYBR Green荧光染料法和荧光标记探针法中引物和探针的设计原理和设计方法，根据病菌的特异性核酸片段，设计柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测的引物和探针；(3)对所设计的引物和探针进行筛选及反应体系和反应条件的优化，筛选出特异性引物和探针，并优化出合适的反应体系和反应条件。(4)加入权利要求1中的引物和权利要求2、4中所述的探针(SYBR Green仅需要加入引物即可)。(5)加入无害化定量标准品。进行柑桔黄龙病菌实时荧光PCR反应。(6)进行实时荧光PCR反应之前，先使用试剂盒中提供的样品核酸提取试剂从植物样品中提取出纯化的样品总DNA，之后再将其作为模板进入步骤(4)。

采用上述技术方案，本发明突出的技术进步在于：

1、本发明根据亚洲韧皮部杆菌的保守基因序列设计出了适合于柑桔黄龙病菌实时荧光PCR快速检测的特异性引物和探针，只能检出亚洲韧皮部杆菌，特异性强；

2、本发明克服了现有技术不能检测带菌量低的无症样品以及不能区别亚洲菌系和非洲菌系的缺点，灵敏度高、实现了疫害的早期诊断。

3、根据病原菌核糖体基因序列片断，研制出无害化重组子阳性对照，避免了活体疫害生物作为阳性对照可能造成的实验室污染，安全可靠。

4、本发明独创的滤膜富集病原菌直接用于PCR检测的简易制样方法，缩短了制样时间，检测过程只需要3小时，简便迅速，适合柑桔鲜果出入境快速检验检疫。

5、研制的可以常温储运的预混冻干固相化试剂盒，具有开启即用，标准统一、简单方便等优点。

综上所述，采用本发明，能帮助解决大宗带菌柑桔鲜果和种苗接穗等繁殖材料出入境检疫检验，非疫区果园HLB早期预警监测以及不同柑桔黄龙病菌的分子鉴别等事宜，其意义十分重大。

具体实施方式

实施例一：

一种用于柑桔黄龙病菌亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)SYBR Green实时荧光PCR检测的引物序列及试剂盒，用于柑桔黄龙病菌的特异性检测，其组成为：

1.样品核酸提取试剂：TES缓冲液100mL；70％乙醇100mL；核酸洗脱液50mL。

2.核酸扩增固相化试剂：

PCR固相化混合物冻干胶珠，其组分中含有如下试剂：

组分                        终浓度

PCR缓冲液级                 1X；

MgCl₂                      2mmol/L；

dNTPs                       0.3mmol/L；

Taq热启动聚合酶             1Unit/25uL；

引物对                      0.6umol/L；

生物大分子稳定剂            加至23uL；

SYBR Green I荧光染料        10umol/L；

所使用的引物对：5’-GAAGCTGGTGGAGGTG-3’

                5’-GACTGCCCAACGAAAA-3’(序列号：NO.1)。

3.定量标准品：柑桔黄龙病菌无害化阳性对照：柑桔黄龙病菌重组子，冻干品。健康柑桔植株阴性对照。柑桔组织总DNA，冻干品。

4.检测用品：自封式塑料袋；过滤用具(包括复合滤膜的过滤器)；1.5ml塑料微量离心管。

实施例二：

一种用于柑桔黄龙病菌亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)SYBR Green实时荧光PCR检测的引物序列及固相化试剂盒，用于柑桔黄龙病菌的特异性检测，其组成为：

样品核酸提取试剂；核酸扩增固相化试剂；定量标准品：柑桔黄龙病菌无害化阳性对照。

其中引物序列为：5’-TTTCGTTGGGCAGTCT-3’

                5’-ATCGGGTAAAGAAGCA-3’(序列号：NO.2)。

所述样品核酸提取试剂、核酸扩增固相化试剂、定量标准品以及检测用品与实施例一相同。

实施例三：

一种用于柑桔黄龙病菌亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)荧光标记探针实时荧光PCR检测的引物、探针序列及固相化试剂盒，用于柑桔黄龙病菌的快速检测，其组成包括：

1.样品核酸提取试剂：TES缓冲液100mL；70％乙醇100mL；核酸洗脱液50mL。

2.核酸扩增固相化试剂：

PCR固相化混合物冻干胶珠，其组分中含有如下原料：

组分                终浓度

PCR缓冲液           1X；

MgCl₂              2mmol/L；

dNTPs               0.3mmol/L；

Taq热启动聚合酶     1Unit/25uL；

引物对              各0.6umol/L；

荧光标记探针        0.2umol/L；

生物大分子稳定剂    加至23uL；

所使用的引物对为：5’-TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA-3’

                  5’-ACGAAAAGATCAGATATTCCTCTA-3’(序列号：NO.3)；

所使用的荧光标记探针序列为：5’-ATCGTCTCGTCAAGATTGCTATCCGTGATACTAG-3’(探针编号：NO.3)。

3.定量标准品：柑桔黄龙病菌无害化阳性对照冻干品；健康柑桔植株阴性对照冻干品。

4.检测用品：自封式塑料袋；过滤用具(包括复合滤膜的过滤器)；1.5ml塑料微量离心管。

实施例四：

一种用于柑桔黄龙病菌亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)荧光标记探针实时荧光PCR检测的引物、探针序列及固相化试剂盒，用于柑桔黄龙病菌的特异性检测，其组成包括：

样品核酸提取试剂、核酸扩增固相化试剂、定量标准品：柑桔黄龙病菌无害化阳性对照。

其中引物序列为：5’-GAGGTGTAAAAGTTGCCAAA-3’

                5’-CGAAAAGATCAGATATTCCTCTA-3’(序列号：NO.4)。

荧光标记探针序列为：5’-TCGTCTCGTCAAGATTGCTATCCGTGATACTAGT-3’(探针编号：NO.6)。

所述样品核酸提取试剂、核酸扩增固相化试剂、定量标准品以及检测用品与实施例三相同。

上述实施例三、四中所述的探针为优化的探针序列，对应于探针编号NO.3的最长探针序列是：5’-AAT CGT CTC GTC AAG ATT GCT ATC CGT GAT ACT AGT ATT-3’，最短探针序列是：5’-CGT CTC GTC AAG ATT GCT ATC CGT GAT AC-3’；对应于探针编号NO.6的最长探针序列是：5’-ATC GTC TCG TCA AGA TTG CTA TCC GTG ATACTA GTA TTA-3’，最短探针序列是：5’-TCG TCT CGT CAA GAT TGC TAT CCG TGATA-3’。

核酸提取步骤为：

①清理工作台：用医用酒精擦工作台和手以达到灭菌的效果；

②随机的选取柑桔叶片，流水清洗干净，吸水纸擦干，撕取叶片中脉，置于一次性培养皿用剪刀剪碎(样品之间用医用酒精擦拭剪刀后用火焰灼烧防止交叉污染)，分装入1.5mL离心管中，放入的量不要超过离心管的圆锥底部分；柑桔木虱或者柑桔植株的其它部分，应尽量将材料粉碎然后装入1.5mL离心管；

③向每个离心管中加入800uL提取液，混合均匀后静置10min；

④取上清液转入5mL注射器中，再用装有复合过滤膜装置过滤，弃滤液；

⑤用1mL无菌水清洗过滤器1到2次，弃滤液；

⑥用70％乙醇750uL清洗过滤器，弃滤液；

⑦重复步骤⑥直至滤液无明显色素；

⑧滤膜自然干燥15min，以除去残余酒精；

⑨将滤膜浸入50uL核酸洗脱液，剧烈振荡，洗脱的菌体即为后续PCR待测模板。

核酸检测步骤为：

①将实时荧光PCR仪开机设置备用；

②向装有固相化冻干PCR反应混合试剂的八联管中加入23uL恢复液；

③加入2uL待测样品液或待测模板，将试剂盒提供的健康柑桔植株阴性对照加入阴性对照管中，阳性对照管视情况加入无害化阳性对照标准品(一般检测)或者重组子标准品的10x梯度稀释样液(定量检测)，对照样品的用量均为每管2uL；

④混合均匀之后即可直接进行PCR反应；SYBR Green染料法须在PCR反应之后做熔解曲线分析；

⑤待PCR扩增完成、依据扩增数据，分析检测结果。

检测反应的体系中各组分分别为：

(1)SYBR Green I荧光染料法固相化实时荧光PCR体系为实时荧光混合液(含1XPCR缓冲液、2mmol/L MgCl₂、0.3mmol/L dNTP、1Unit Taq酶和0.6umol/L引物对各一和荧光染料1ul)，加大分子稳定剂至23uL，混匀，在-40℃冰箱速冻30分钟，置于真空冷冻干燥装置内冻干至透明胶状物。密封包装常温下保存。使用前加入23ul恢复液，与2uL待测样品混合均匀后，进行PCR扩增。

(2)荧光标记探针法固相化实时荧光PCR体系为核酸扩增混合液15uL(含1x Buffer、2mmol/L MgCl₂、0.3mmol/L dNTPs、1Unit Taq酶、0.6umol/L引物对各一和0.2umol/L探针)，加大分子稳定剂至23uL，混匀预冻，置于真空冷冻干燥装置内冻干至透明胶状物。密封包装常温下保存。使用前加入23ul恢复液，与2uL待测样品混合均匀后，按照要求设置对照样品管，进行PCR扩增。

检测反应条件为：

(1)SYBR Green I荧光染料法：95℃，1min；然后40个循环，每个循环为95℃，15s，59℃，15s，72℃，45s，在每个循环的延伸阶段(72℃)收集荧光；最后72℃，7min。做熔解曲线的反应条件为：95℃，1min；55℃，1min；从55℃开始每升高0.5℃保持10s，连续升高80次(到95℃为止)。

(2)荧光标记探针法：95℃，1min；然后40个循环，每个循环为95℃，5s，59℃，30s，在每个循环的退火/延伸阶段(59℃)收集荧光。

结果判定标准是：

(1)使用荧光标记探针法的反应

若定量PCR仪检测到以柑桔黄龙病菌(亚洲韧皮部杆菌)特异性片段重组质粒DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长；阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号有明显增长，则表示所检测的样品中含有柑桔黄龙病菌；若定量PCR仪检测到以柑桔黄龙病菌特异性片段重组质粒DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号没有明显增长，则表示所检测的样品中不含有柑桔黄龙病菌。

(2)使用SYBR Green I荧光染料法的反应

若出现以下两种情况之一则表示所检测的样品中含有柑桔黄龙病菌：①定量PCR仪检测到以柑桔黄龙病菌特异性片段重组质粒DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号有明显增长，并且在随后进行的熔解曲线分析中，样品具有和阳性对照一样的主峰；②阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光有轻微的荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号有明显增长，并且在随后进行的熔解曲线分析中，样品具有一个和阳性对照相同的主峰以及一个与阴性对照相同的侧峰。

若出现以下两种情况之一则表示所检测的样品中不含有柑桔黄龙病菌：①定量PCR仪检测到以柑桔黄龙病菌特异性片段重组质粒DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号没有增长；②阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光有轻微的荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号也有轻微增长，并且在随后进行的熔解曲线分析中，样品具有一个与阴性对照相同的侧峰。

用于柑桔黄龙病菌检测的寡核苷酸引物与探针包括：

寡核苷酸引物对序列号NO.1：

     5’-GAAGCTGGTGGAGGTG-3’

     5’-GACTGCCCAACGAAAA-3’

寡核苷酸引物对序列号NO.2：

     5’-TTTCGTTGGGCAGTCT-3’

     5’-ATCGGGTAAAGAAGCA-3’

寡核苷酸引物对序列号NO.3：

     5’-TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA-3’

     5’-ACGAAAAGATCAGATATTCCTCTA-3’；

寡核苷酸引物对序列号NO.4：

     5’-GAGGTGTAAAAGTTGCCAAA-3’

     5’-CGAAAAGATCAGATATTCCTCTA-3’

最长的探针序列编号NO.1：

     5’-AAT CGT CTC GTC AAG ATT GCT ATC CGT GAT ACT AGT ATT-3’

最短的探针序列编号NO.2：

     5’-CGT CTC GTC AAG ATT GCT ATC CGT GAT AC-3’

优化的探针序列编号NO.3：

     5’-ATC GTC TCG TCA AGA TTG CTA TCC GTG ATA CTA G-3’

最长的探针序列编号NO.4：

     5’-ATC GTC TCG TCA AGA TTG CTA TCC GTG ATA CTA GTA TTA-3’，

最短探针序列编号NO.5：

     5’-TCG TCT CGT CAA GAT TGC TAT CCG TGA TA-3’，

优化的探针序列编号NO.6

     5’-TCG TCT CGT CA A GAT TGC TAT CCG TGA TAC TAG T-3’

                           序列表

<110>重庆大学

     重庆重大生物技术发展有限公司

     四川渝高科技有限责任公司

<120>柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测引物、探针、固相化试剂盒及其检测方法

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<213>Candidatus Liberibacter asiaticus

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