一种食物中毒菌多联融合毒素及其用途

摘要

本发明涉及一种食物中毒菌多联融合毒素及其用途，属于生物技术领域。肉毒梭菌毒素A基因Hc、金黄色葡萄球菌肠毒素A基因SEA、B基因SEB、大肠杆菌O 157：H7veroB亚基毒素基因VT1B、VT2B，用连接序列linker串联起来形成Hc－VT1B－SEA－VT2B－SEB，及其所编码表达的可溶性食物中毒菌多联融合毒素蛋白及其用途。优点及有益效果在于：得到抗5种细菌毒素的血清抗体，与五种毒素具有非常高的特异性和反应敏感性，同时与一定范围相近型别的毒素有交叉反应，用以解决目前食品检测过程复杂而又较为漫长，缺乏广泛性多联融合毒素试剂盒的问题。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体包括多联融合细菌毒素及其建立方法，成为广谱性免疫学检测方法的开始。

背景技术

食物中毒菌是食品卫生中经常遇到的问题，细菌(毒素)性食物中毒又是最常见的形式之一。对食品中细菌检验的常规方法是在检验时要鉴定每一个细菌(毒素)及其型别，优点是科学准确，但这个过程复杂而又较为漫长，对产毒菌株在分离后再确定是否为产毒株或什么种类的毒素。目前使用的快速检测方法又难以满足检测覆盖面广的要求。在食品中病原或毒素的检测方法学方面，一是寻找精确的检测技术，另一方面是寻找快速检测技术，再就是寻找广泛性的检测技术。对于食品中或其他领域的细菌或细菌毒素还没有广泛意义的检测方法，能够在较短时间内同时判断食品中是否含有可疑食物中毒菌或毒素，而不管哪种菌或毒素；如果阴性就表明在一定范围内该食品安全，如果阳性则需要在限定范围内进一步确定检测。这在食品工业具有重要的经济学意义，在食品卫生与安全上有时甚至比精确检验更有意义。在多联融合细菌毒素的基础上所建立的这种方法有可能成为广谱性免疫学检测方法的开始。

发明内容

本发明提供一种食物中毒菌多联融合毒素及其用途，以解决目前食品检测过程复杂而又较为漫长，缺乏广泛性多联融合毒素试剂盒的问题。本发明采取的技术方案是：

5个毒素基因：肉毒梭菌毒素A基因Hc、金黄色葡萄球菌肠毒素A基因SEA、B基因SEB、大肠杆菌O 157:H7 veroB亚基毒素基因VT_1B、VT_2B，用连接序列linker串联起来形成Hc-VT_1B-SEA-VT_2B-SEB。

Hc-VT_1B-SEA-VT_2B-SEB的核苷酸序列如SEQ ID NO：1。

食物中毒菌多联融合毒素的核苷酸序列，其所编码表达的可溶性食物中毒菌多联融合毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2。

一种抗原，由食物中毒菌多联融合毒素核酸序列表达产生，该表达产生的是基因工程菌表达的可溶性蛋白。

一种抗体，采用该上述抗原，用2mg/次加等体积的完全佛氏佐剂免疫家兔第一次，每隔7天再分别以同样量蛋白和不完全佛氏佐剂免疫家兔4次，测抗体效价后采血获得血清。

上述抗体在制备食品毒素检测试剂盒中的应用。

本发明的优点及有益效果在于：将大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和肉毒梭菌三种菌的5个毒素基因或片段用linker串联起来得Hc-VT_1B-SEA-VT_2B-SEB，2928bp，在pET22-b中获得包涵体和可溶性两种表达产物。免疫家兔，得到抗5种细菌毒素的血清抗体，与五种毒素具有非常高的特异性和反应敏感性，同时与一定范围(同属内)相近型别的毒素有交叉反应，这样就获得了在一定范围内有限交叉的广谱性抗体。为多基因抗原串联及在食物中毒菌或毒素广谱、快速筛检方法的建立奠定了方法学基础。用以解决目前食品检测过程复杂而又较为漫长，缺乏广泛性多联融合毒素试剂盒的问题

附图说明

图1、本发明基因PCR的linker连接和扩增。

图2、SDS-PAGE电泳结果，M：蛋白marker，1、未诱导的HVSVS-pET-226，2、37℃包涵体蛋白上清，3、37℃包涵体蛋白，4、25℃包涵体蛋白上清，5、25℃包涵体蛋白，6、4h/2PTG诱导的HVSVS-pET-226重组质粒。

具体实施方式

实施例1本发明食物中毒菌多联融合毒素的核苷酸序列的制备

材料和方法

1.1菌株

金黄色葡萄球菌A\B(26072，26075)Staphylococcus aureus A\B(26072，26075)，肉毒梭菌A(62A)Clostridium botulinum A(62A)，大肠杆菌O157:H7E.coli O157:H7；other strains：绿脓杆菌Pseudomonasaerugionsa，金黄色葡萄球菌C(C₁，C₂)Staphylococcus aureus C(C₁，C₂)，金黄色葡萄球菌E Staphylococcus aureus E，单核细胞增多性李氏杆菌Listeria monocytogene，小肠结肠耶氏菌(52207)Yersinia enterocolitica(52207)，弗氏耶氏菌Yersinia frederiksenii，中间型耶氏菌Yersiniaintermedia，克氏耶氏菌Yersinia kristensenii，假结核耶氏菌Yersiniapseudotuberculosis，鼠疫耶氏菌Yersinia pestis，副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyticus，亚利桑那沙门氏菌Salmonella arizonae，副伤寒沙门氏菌A Salmonella paratyphi A，副伤寒沙门氏菌C Salmonella paratyphi C，猪霍乱沙门氏菌Salmonella choleraesuis，肠炎沙门氏菌Salmonellaenteritidis，伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium，鸡沙门氏菌Salmonella pullorum，都柏林沙门氏菌Salmonella Dublin，伦敦沙门氏菌Salmonella London，阿伯丁沙门氏菌Salmonella aberdeen，纽波特沙门氏菌Salmonella newport，蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus，枯草杆菌Bacillus subtilis，炭疽杆菌(弱毒株)Bacillus anthracis(low toxic strain)，空肠弯杆菌Campylobacter jejuni，宋内氏志贺氏菌Shigella sonnei，魏氏梭菌Clostridium welcii，肉毒梭菌BClostridium botulinum B，肉毒梭菌CClostridium botulihum，C..

1.2分子克隆

1.2.1引物和连接序列linker：

引物：

P15’-CCA TGG ACC TTT CCA AAT ACG TAG ATA ATC-3’

P25’-CGT GCC CGG ACC CAG TGG CCT TTC TCC CCA TC-3’

P35’-ACT GGG TCC GGG TCC GGG CAC GCC TGA TTG TGT AACTGG-3’

P45’-TGC CCG GAC CCG GAC CAC GAA AAA TAA CTT CGA TGAATC-3’

P55’-TTC GTG GTC CGG GTC CGG GCA GCG AGA AAA GCGAAG AAA-3’

P65’-GCC CGG ACC ACT TGT ATA TAA ATA TAT ATC AAT-3’

P75’-AAG TGG TCC GGG TCC GGG CGC GGA TTG TGC TAA AGGTAA-3’

P85’-TCG CCC GGA CCC GGA CCG TCA TTA TTA AAC TGC ACTTCA-3’

P95’-TGA CGG TCC GGG TCC GGG CGA GAG TCA ACC AGATCC TAA-3’

P105’-CTC GAG TTA TTC AAA TAC CCG AAC AGT AAT ACT-3’Linker：5’-ggt ccg ggt ccg ggc-3’

1.2.2基因组提取

按Vitagene基因组提取说明书分别提取肉毒梭菌毒素A的基因Hc，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3、金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因SEA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4、金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因SEB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5、大肠杆菌O 157:H7 veroB亚基毒素基因VT_1B，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6和大肠杆菌O 157:H7 veroB亚基毒素基因VT_2B，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7。

1.2.3PCR扩增目的基因Hc(肉毒梭菌毒素A的重链无毒性片段)：94℃ 5min，94℃ 1min，68℃ 1min，72℃ 1min，每退火一个循环下降1℃，至33℃，35循环，4℃保存，其它毒素基因的PCR条件：94℃5min，94℃ 1min，43℃(SEA)，48℃(SEB)，57℃(VT_2B)，55℃(VT_1B)，50sec，72℃1min。Hc：1338bp，VT1B：2137bp，VT2B：210bp，SEB：414bp，SEA：699bp。

1.2.3连接毒素基因  Hc1332bp，VT_1B 207bp，VT_2B 210bp，SEA699bp，SEB 414bp，Linker。重组基因全长为2928bp。见图1，第一次PCR：Hc、VT_1B、SEA、VT_2B、SEB，扩增5个基因片段；第二次PCR：VT_1B-SEA、VT_2B-SEB，扩增两个基因连接产物：第三次PCR：VT_1B-SEA-VT_2B-SEB，扩增四个基因连接产物：第四次PCR：Hc-VT_1B-SEA-VT_2B-SEB，扩增五个基因连接产物。

该重组基因Hc-VT_1B-SEA-VT_2B-SEB的核苷酸序列如SEQ ID NO：1。

经测序表明重组毒素基因分别为原基因或部分基因序列。实施例2本发明重组毒素的表达与纯化

Hc-VT_1B-SEA-VT_2B-SEB基因，以下简称HVSVS，pET-22b表达载体、在宿主菌E.coli DH5α中分别在37℃或25℃、1～6h，或者过夜表达，1mmol/L IPTG诱导。在pET-22b表达载体表达的可溶性蛋白经SDS-PAGE电泳后，切下目的蛋白带，回收后作为免疫原。见图2。

HVSVS在pET-22b中37℃、4h的表达形式为可溶性(5.29％)和包涵体(4.69％)两种，以1mmol/L IPTG诱导。25℃时几乎全是可溶性表达蛋白(9.9％)。表达蛋白分子量为112.33kDa。大部分可溶性蛋白位于胞浆，小部分位于细胞周质。

该食物中毒菌多联融合毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2。实施例3抗重组毒素抗体的制备

用TE(pH8.0)缓冲液将表达菌体沉淀悬起，用超声波将表达菌体打碎后，离心，去沉淀；上清装入透析袋中，用PEG20000透析浓缩2h，浓缩后的上清经SDS-PAGE电泳后切下目的蛋白带，于匀浆器中使之浆化，用2倍的TE(pH8.0)缓冲液混匀，置4℃12h，期间振摇3～4次，然后用10000r/min离心20min，上清即为融合毒素HVSVS表达蛋白。用紫外分光光度计测定蛋白浓度。用纯化的可溶性表达蛋白2mg/次加等体积的完全佛氏佐剂用注射器混匀法混匀或完全乳化后免疫家兔第一次，采取背部皮下多点注射法。以后每间隔7天再分别以同样量蛋白和不完全佛氏佐剂混合后免疫家兔4次。最后一次免疫7天心脏采血，37℃ 1h，使血液凝固，再放4℃过夜，使血块收缩。10000g离心10min分离获得血清。用琼脂扩散或ELISA方法测抗体效价后按常规采血获得血清。

实施例4抗体特性鉴定

用琼脂扩散试验和ELISA测定抗体效价：琼脂扩散用1.8％琼脂，血清分别稀释0^×，2^×，4^×，8^×，16^×，32^×等几个稀释倍数，24～48h后观察抗原抗体沉淀带的情况；ELISA方法用pH9.6的包被液稀释5种天然毒素几个稀释度，每孔加100μL，然后分别测定其敏感度。用同属内的毒素和29种其它常见食源性病原菌做特异性检测。见表1。

                       表1抗体特异性(OD_490nm)

  菌株或毒素  O157  VT1  VT2  Hc  C.b_A  C.b_B  C.b_C  HVSVS  OD_490nm  阴性对照  菌株或毒素  OD_490nm  阴性对照1  1.003  0.262  SEA  2.402  0.321  2.979  0.366  SEB  2.412  0.323  2.144  0.302  A  0.803  0.353  2.322  0.352  B  0.674  0.298  2.337  0.377  E  0.418  0.293  1.059  0.399  C₁  0.613  0.324  1.088  0.414  C₂  0.698  0.292  2.916  0.307  -  -  -

注：A、B、E、C₁、C₂为金黄色葡萄球菌，C.b_A，C.b_B，C.b_C为肉毒梭菌。

琼脂扩散试验表明，V T_1B为64^×，其它毒素的抗体效价均为16^×。ELISA试验结果表明，V T_1B为51200^×，SEA为6400^×，VT_2B为12800^×，Hc为6400^×，SEB为6400^×。可溶性表达蛋白和包涵体免疫家兔产生的抗体效价几乎相同。与相关毒素属以外的毒素和其它26种常见食源性病原菌培养物没有明显可见的ELISA反应，但与在这三种菌属内的毒素有一定的交叉反应。抗体与对应毒素的ELISA反应敏感性分别为Hc31.25ng/mL，VT_1B3.75ng/mL，SEA125.00ng/mL，VT_2B7.50ng/mL，SEB62.50ng/mL。

实施例5模拟食物样品的检测

将5种产毒菌种培养物与牛奶混合，制备成5个稀释系列，血清被稀释成3000^×，用ELISA测定模拟食物样品，每个稀释系列模拟样品30份。

对于乳的模拟样品的共150份样品的ELISA检测均出现了阳性结果，而对照并有杂菌干扰的样品均为阴性。不同稀释度测定结果表明，ELISA的检测敏感性可达4×10^-2ng毒素/mL乳。见表2

                表2模拟样品(乳)ELISA敏感性测定

 毒素  稀释  阴性  对照  4(μg)  4×10^-1  4×10^-2  4×10^-3  4×10^-4 BoNTs SEA SEB VT  2.02  2.22  2.13  2.73  2.00  2.10  2.10  2.42  1.60  1.50  1.60  2.00  1.40  1.40  1.43  2.00  0.70  0.65  0.70  1.60  0.15  0.20  0.18  0.80

实施例6食品中细菌毒素ELISA检测试剂盒

试剂和材料

1、聚苯乙烯塑料微量组织培养板

2、包被液(pH9.6moL碳酸盐缓冲液)

3、洗涤液(pH7.4、0.01moLPBS)

4、保温液(含BSA0.1g，0.05％PBS-Tween-20/100mL)

5、底物溶液：①pH5.0，0.2moL的磷酸盐—柠檬酸缓冲液；②用磷酸盐—柠檬酸缓冲液100mL，现用现配，加入邻苯二胺(OPD)40mg，30％H2O20.15mL

6、终止液(2moLH2SO4)

7、血清抗体(3000倍稀释)

8、酶标羊抗兔抗体(1∶400倍稀释)

操作方法

1.样品处理

乳类食品：鲜奶可直接作为样品，如果浓稠的用PBS稀释2倍。

肉类食品：将肉粉碎后用PBS稀释3倍，取上清作为测定样品。

2.抗原包被：用百百液做10倍稀释后，每孔加100μL，不家抗原作空白对照，4℃过夜。

3.洗涤：用洗涤液洗涤3次，每次浸润3分钟，沥干。

4.将保温液稀释的血清每孔加100μL，37℃1小时。

5.同样洗涤3次。

6.加入酶标二抗100μL/孔，37℃1小时。

7.同样洗涤3次。

8.加入底物，100μL/孔，置暗盒内显色20分钟。

9.加入终止液50μL/孔，静止5分钟。

10.490nm测OD值。与阴性值相差两倍以上即为阳性。

<110>吉林大学畜牧兽医学院

<120>食物中毒菌多联融合毒素

<130>liuzs2005

<160>7

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>2928

<212>DNA

<213>人工

<400>1

atggaccttt ccaaatacgt agataatcaa agattattat ctacatttac tgaatatatt    60

aagaatatta ttaatacttc tatattgaat ttaagatatg aaagtaatca tttaatagac    120

ttatctaggt atgcatcaaa aataaatatt ggtagtaaag taaattttga tccaatagat    180

aaaaatcaaa ttcaattatt taatttagaa agtagtaaaa ttgaggtaat tttaaaaaat    240

gctattgtat ataatagtat gtatgaaaat tttagtacta gcttttggat aagaattcct    300

aagtatttta acagtataag tctaaataat gaatatacaa taataaattg tatggaaaat    360

aattcaggat ggaaagtatc acttaattat ggtgaaataa tctggacttt acaggatact    420

caggaaataa aacaaagagt agtttttaaa tacagtcaaa tgattaatat atcagattat    480

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ataaatggaa gattaataga tcaaaaacca atttcaaatt taggtaatat tcatgctagt    600

aataatataa tgtttaaatt agatggttgt agagatacac atagatatat ttggataaaa    660

tattttaatc tttttgataa ggaattaaat gaaaaagaaa tcaaagattt atatgataat    720

caatcaaatt caggtatttt aaaagacttt tggggtgatt atttacaata tgataaacca    780

tactatatgt taaatttata tgatccaaat aaatatgtcg atgtaaataa tgtaggtatt    840

agaggttata tgtatcttaa agggcctaga ggtagcgtaa tgactacaaa catttattta    900

aattcaagtt tgtatagggg gacaaaattt attataaaaa aatatgcttc tggaaataaa    960

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ataacaaata aatgcaaaat gaatttacaa gataataatg ggaatgatat aggctttata    1200

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tggggagaaa ggccactggg tccgggtccg ggcacgcctg attgtgtaac tggaaaggtg    1380

gagtatacaa aatataatga tgacgatacc tttacagtta aagtgggtga taaagaatta    1440

tttaccaaca gatggaatct tcagtctctt cttctcagtg cgcaaattac ggggatgact    1500

gtaaccatta aaactaatgc ctgtcataat ggagggggat tcagcgaagt tatttttcgt    1560

ggtccgggtc cgggcagcga gaaaagcgaa gaaataaatg aaaaagattt gcgaaaaaag    1620

tctgaattgc agggaacagc tttaggcaat cttaaacaaa tctattatta caatgaaaaa    1680

gctaaaactg aaaataaaga gagtcacgat caatttttac agcatactat attgtttaaa    1740

ggctttttta cagatcattc gtggtataac gatttattag tagattttga ttcaaaggat    1800

attgttgata aatataaagg gaaaaaagta gacttgtatg gtgcttatta tggttatcaa    1860

tgtgcgggtg gtacaccaaa caaaacagct tgtatgtatg gtggtgtaac gttacatgat    1920

aataatcgat tgaccgaaga gaaaaaagtg ccgatcaatt tatggctaga cggtaaacaa    1980

aatacagtac ctttggaaac ggttaaaacg aataagaaaa atgtaactgt tcaggagttg    2040

gatcttcaag caagacgtta tttacaggaa aaatataatt tatataactc tgatgttttt    2100

gatgggaagg ttcagagggg attaatcgtg tttcatactt ctacagaacc ttcggttaat    2160

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ttactgcaaa gtgctcagtt gacaggaatg actgtcacaa tcaaatccag tacctgtgaa    2460

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caatttctat actttgactt aatatattct attaaggaca ctaagttagg gaattatgat    2700

aatgttcgag tcgaatttaa aaacaaagat ttagctgata aatacaaaga taaatacgta    2760

gatgtgtttg gagctaatta ttattatcaa tgttattttt ctaaaaaaac gaatgatatt    2820

aattcgcatc aaactgacaa acgaaaaact tgtatgtatg gtggtgtaac tgagcataat    2880

ggaaaccaat tagataaata tagaagtatt actgttcggg tatttgaa                 2928

<210>2

<211>976

<212>PRT

<213>人工

<400>2

Met Asp Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser Thr Phe

1               5                   10                  15

Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg

            20                  25                  30

Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile

        35                  40                  45

Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile

    50                  55                  60

Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn

65                  70                  75                  80

Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp

                85                  90                  95

Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr

            100                 105                 110

Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu

        115                 120                 125

Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys

    130                 135                 140

Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr

145                 150                 155                 160

Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn

                165                 170                 175

Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser

            180                 185                 190

Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp

        195                 200                 205

Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu

    210                 215                 220

Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn

225                 230                 235                 240

Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln

                245                 250                 255

Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr

            260                 265                 270

Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly

        275                 280                 285

Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu

    290                 295                 300

Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys

305                 310                 315                 320

Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val

                325                 330                 335

Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val

            340                 345                 350

Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

        355                 360                 365

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys

    370                 375                 380

Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile

385                 390                 395                 400

Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp

                405                 410                 415

Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp

            420                 425                 430

Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu Gly Pro

        435                 440                 445

Gly Pro Gly Thr Pro Asp Cys Val Thr Gly Lys Val Glu Tyr Thr Lys

    450                 455                 460

Tyr Asn Asp Asp Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Gly Asp Lys Glu Leu

465                 470                 475                 480

Phe Thr Asn Arg Trp Asn Leu Gln Ser Leu Leu Leu Ser Ala Gln Ile

                485                 490                 495

Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys Thr Asn Ala Cys Hi s Asn Gly Gly

            500                 505                 510

Gly Phe Ser Glu Val Ile Phe Arg Gly Pro Gly Pro Gly Ser Glu Lys

        515                 520                 525

Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gln

    530                 535                 540

Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys

545                 550                 555                 560

Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln His Thr

                565                 570                 575

Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu

            580                 585                 590

Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys

        595                 600                 605

Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly Gly

    610                 615                 620

Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp

625                 630                 635                 640

Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp Leu

                645                 650                 655

Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn Lys

            660                 665                 670

Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg Tyr Leu

        675                 680                 685

Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val

    690                 695                 700

Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn

705                 710                 715                 720

Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg

                725                 730                 735

Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His Ile Asp

            740                 745                 750

Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser Gly Pro Gly Pro Gly Ala Asp Cys Ala Lys

        755                 760                 765

Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Glu Asp Asp Thr Phe Thr Val

    770                 775                 780

Lys Val Asp Gly Lys Glu Tyr Trp Thr Ser Arg Trp Asn Leu Gln Pro

785                 790                 795                 800

Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys Ser

                 805                 810                 815

Ser Thr Cys Glu Ser Gly Ser Gly Phe Ala Glu Val Gln Phe Asn Asn

            820                 825                 830

Asp Gly Pro Gly Pro Gly Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu

        835                 840                 845

Leu His Lys Ser Ser Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val

    850                 855                 860

Leu Tyr Asp Asp Asn His Val Ser Ala Ile Asn Val Lys Ser Ile Asp

865                 870                 875                 880

Gln Phe Leu Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu

                885                 890                 895

Gly Asn Tyr Asp Asn Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala

            900                 905                 910

Asp Lys Tyr Lys Asp Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr

        915                 920                 925

Tyr Gln Cys Tyr Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His Gln

    930                 935                 940

Thr Asp Lys Arg Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn

945                 950                 955                 960

Gly Asn Gln Leu Asp Lys Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu

                965                 970                 975

<210>3

<211>1338

<212>DNA

<213>肉毒梭菌毒素A

<400>3

atggaccttt ccaaatacgt agataatcaa agattattat ctacatttac tgaatatatt    60

aagaatatta ttaatacttc tatattgaat ttaagatatg aaagtaatca tttaatagac    120

ttatctaggt atgcatcaaa aataaatatt ggtagtaaag taaattttga tccaatagat    180

aaaaatcaaa ttcaattatt taatttagaa agtagtaaaa ttgaggtaat tttaaaaaat    240

gctattgtat ataatagtat gtatgaaaat tttagtacta gcttttggat aagaattcct    300

aagtatttta acagtataag tctaaataat gaatatacaa taataaattg tatggaaaat    360

aattcaggat ggaaagtatc acttaattat ggtgaaataa tctggacttt acaggatact    420

caggaaataa aacaaagagt agtttttaaa tacagtcaaa tgattaatat atcagattat    480

ataaacagat ggatttttgt aactatcact aataatagat taaataactc taaaatttat    540

ataaatggaa gattaataga tcaaaaacca atttcaaatt taggtaatat tcatgctagt    600

aataatataa tgtttaaatt agatggttgt agagatacac atagatatat ttggataaaa    660

tattttaatc tttttgataa ggaattaaat gaaaaagaaa tcaaagattt atatgataat    720

caatcaaatt caggtatttt aaaagacttt tggggtgatt atttacaata tgataaacca    780

tactatatgt taaatttata tgatccaaat aaatatgtcg atgtaaataa tgtaggtatt    840

agaggttata tgtatcttaa agggcctaga ggtagcgtaa tgactacaaa catttattta    900

aattcaagtt tgtatagggg gacaaaattt attataaaaa aatatgcttc tggaaataaa    960

gataatattg ttagaaataa tgatcgtgta tatattaatg tagtagttaa aaataaagaa    1020

tataggttag ctactaatgc atcacaggca ggcgtagaaa aaatactaag tgcattagaa    1080

atacctgatg taggaaatct aagtcaagta gtagtaatga agtcaaaaaa tgatcaagga    1140

ataacaaata aatgcaaaat gaatttacaa gataataatg ggaatgatat aggctttata    1200

ggatttcatc agtttaataa tatagctaaa ctagtagcaa gtaattggta taatagacaa    1260

atagaaagat ctagtaggac tttgggttgc tcatgggaat ttattcctgt agatgatgga    1320

tggggagaaa ggccactg                                                  1338

<210>4

<211>699

<212>DNA

<213>金黄色葡萄球菌肠毒素A

<400>4

agcgagaaaa gcgaagaaat aaatgaaaaa gatttgcgaa aaaagtctga attgcaggga    60

acagctttag gcaatcttaa acaaatctat tattacaatg aaaaagctaa aactgaaaat    120

aaagagagtc acgatcaatt tttacagcat actatattgt ttaaaggctt ttttacagat    180

cattcgtggt ataacgattt attagtagat tttgattcaa aggatattgt tgataaatat    240

aaagggaaaa aagtagactt gtatggtgct tattatggtt atcaatgtgc gggtggtaca    300

ccaaacaaaa cagcttgtat gtatggtggt gtaacgttac atgataataa tcgattgacc    360

gaagagaaaa aagtgccgat caatttatgg ctagacggta aacaaaatac agtacctttg    420

gaaacggtta aaacgaataa gaaaaatgta actgttcagg agttggatct tcaagcaaga    480

cgttatttac aggaaaaata taatttatat aactctgatg tttttgatgg gaaggttcag    540

aggggattaa tcgtgtttca tacttctaca gaaccttcgg ttaattacga tttatttggt    600

gctcaaggac agtattcaaa tacactatta agaatatata gagataataa aacgattaac    660

tctgaaaaca tgcatattga tatatattta tatacaagt                           699

<210>5

<211>414

<212>DNA

<213>金黄色葡萄球菌肠毒素B

<400>5

gagagtcaac cagatcctaa accagatgag ttgcacaaat cgagtaaatt cactggtttg    60

atggaaaata tgaaagtttt gtatgatgat aatcatgtat cagcaataaa cgttaaatct    120

atagatcaat ttctatactt tgacttaata tattctatta aggacactaa gttagggaat    180

tatgataatg ttcgagtcga atttaaaaac aaagatttag ctgataaata caaagataaa    240

tacgtagatg tgtttggagc taattattat tatcaatgtt atttttctaa aaaaacgaat    300

gatattaatt cgcatcaaac tgacaaacga aaaacttgta tgtatggtgg tgtaactgag    360

cataatggaa accaattaga taaatataga agtattactg ttcgggtatt tgaa          414

<210>6

<211>213

<212>DNA

<213>大肠杆菌O157:H7 veroB

<400>6

atggatacgc ctgattgtgt aactggaaag gtggagtata caaaatataa tgatgacgat    60

acctttacag ttaaagtggg tgataaagaa ttatttacca acagatggaa tcttcagtct    120

cttcttctca gtgcgcaaat tacggggatg actgtaacca ttaaaactaa tgcctgtcat    180

aatggagggg gattcagcga agttattttt cgt                                 213

<210>7

<211>210

<212>DNA

<213>大肠杆菌O 157:H7 veroB

<400>7

gcggattgtg ctaaaggtaa aattgagttt tccaagtata atgaggatga cacatttaca    60

gtgaaggttg acgggaaaga atactggacc agtcgctgga atctgcaacc gttactgcaa    120

agtgctcagt tgacaggaat gactgtcaca atcaaatcca gtacctgtga atcaggctcc    180

ggatttgctg aagtgcagtt taataatgac                                     210