樟芝菌丝体发酵提取物在制备抗辐射损伤药物中的应用

摘要

本发明公开了一种樟芝菌丝体发酵提取物在制备抗辐射损伤药物中的应用。其中所述樟芝菌丝体发酵提取物，由乙醇提取并干燥后制得；所用菌株为樟芝(Antrodiacamphorata)Ac001，已于2005年9月21日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.1460。本发明还公开了一种利用樟芝菌丝体发酵提取物制备的抗辐射损伤胶囊，由下述组分及重量份组成：樟芝菌丝体发酵提取物20～100；不含蛋白玉米淀粉或药用糊精200～480。

说明书

技术领域

本发明涉及一种樟芝菌丝体发酵提取物的应用，尤其涉及一种樟芝菌丝体发酵提取物在制备抗辐射损伤药物中的应用。

背景技术

随着科学技术及人们生活的现代化，环境污染严重地影响着人们的身体健康。特别是在治疗肿瘤疾病的放化疗过程中，有些药物对人类有相当严重的辐射作用；另外，计算机及移动电话等现代化设施的使用，也对人体的健康威害相当大，因此研究开发抗辐射药物，是非常重要的。

食用真菌在医药和保健方面，具有潜在的巨大作用，如抗过敏、抗发炎、降血压、降低胆固醇、制癌性及抗肿疡活性等作用。

樟芝(Antrodia camphorata)又称牛樟菇，属食用真菌。一般生长在小叶黄樟树的中空心材内壁上，钟状；子实层呈桔红色、味苦。樟芝新品种菌丝体经培养后呈桔红色，肉粉色。显微镜观察，菌丝细长、有隔、具有锁状联合，并有大量的分生孢子，分生孢子因培养条件不同呈桔红色、肉粉色或黄色。

关于樟芝菌丝体培养物的粗提物或是其多糖的药理学或生物活性研究近来取得了一些进展，中国专利01123613.2《樟芝的固体培养方法，所得固体培养物及其产品与用途》；200410008046.4《来自牛樟芝菌丝体的新混合物和化合物及其用途》和200410011142.4《牛樟芝担子菌类的多糖体及其用途》均涉及了樟芝的功效及用途，但是，在所述的专利中，却未见有通过卫星搭载改良品种，以提高其药理功效的报道，也未见利用樟芝改良品种制备提取物，用于制备抗辐射损伤药物的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种樟芝菌丝体发酵提取物在制备抗辐射损伤药物中的应用。

本发明所述樟芝菌丝体发酵提取物在制备抗辐射损伤药物中的应用。

其中，所述樟芝菌丝体发酵提取物由下述方法制得：

(1)取樟芝菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；

(2)用体积百分比为60～95％的乙醇对上述浓缩的发酵液进行萃取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～5倍，以能够使提取液中乙醇浓度达到60～90％；

(3)50～70℃条件下，加热1～2小时；

(4)以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；

(5)将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；

(6)用体积百分比为95％的、4～8倍乙醇浓缩液体积量的乙醇，对上述浓缩乙醇提取液进行12～24小时沉淀处理；

(7)以常规方法分离出沉淀物；

(8)将沉淀物以常规方式真空干燥或低温冷冻干燥，得樟芝菌丝体发酵提取物；

其中，所述樟芝菌丝体发酵全液是指菌丝体和发酵液的滤液；所述樟芝菌丝体为CGMCCNo.1460，该菌株名为樟芝(Antrodia camphorata)Ac001，已于2005年9月21日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNo.1460。

上述樟芝(Antrodia camphorata)Ac001 CGMCC No.1460是通过樟芝子实体分离到的樟芝菌种，送国家航天航空部东方红宇航中心，对其进行了卫星搭载，搭载的条件为：卫星质量为2100公斤，卫星温度为5～28℃，微重力量级10^-3～10^-5，近地点高度200～210公里，远地点高度300～400公里，轨道周期为90分钟，航天飞行18天；在卫星搭载诱变后，经多次活化培养后获得的。

上述樟芝(Antrodia camphorata)Ac001 CGMCC No.1460的发酵培养方法是，将樟芝菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐灭菌压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用樟芝菌丝体发酵全液制备取物。

其中，所述樟芝(Antrodia camphorata)Ac001 CGMCC No.1460的发酵培养方法中，培养温度最适是28～30℃，培养pH最适为6。

其中，上述种子或发酵培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉  1％      葡萄糖      1％

蛋白胨    0.2％    酵母膏      0.2％

硫酸镁    0.1％    磷酸二氢钾  0.05％

利用上述樟芝菌丝体发酵提取物制备的抗辐射损伤胶囊，由下述组分及重量份组成：

樟芝菌丝体发酵提取物20～100；不含蛋白玉米淀粉或药用糊精200～480。

在上述组分及重量份组成中优选：

樟芝菌丝体发酵提取物50～100；不含蛋白玉米淀粉或药用糊精200～450。

在上述组分及重量份组成中最优选：

樟芝菌丝体发酵提取物50；不含蛋白玉米淀粉或药用糊精450。

上述抗辐射损伤胶囊的制备方法是，以所述重量份分别称取樟芝菌丝体发酵提取物、不含蛋白玉米淀粉或药用糊精；均研碎为小于200目的细粉，干燥条件下充分混匀；以每粒胶囊装0.5克的量装入0号胶囊。

其中，所述玉米淀粉或药用糊精的含水量要求在质量百分比9％以下。

利用本发明所述的樟芝菌丝体发酵提取物研究其抗辐射损伤的作用。

实验方法：

小鼠随机分为9组，每组12只，雌雄各半。给各组小鼠灌服相应各种药物，A为空白对照组，B-E为樟芝菌丝体发酵提取物，各组给药剂量分别为mg/(kg bw.d)：50、100、150、200。一天一次，0.5ml/只/天，连续灌服13天后，进行60Co-γ射线全身照射，源距80cm，剂量8Gy，剂量率0.69Gy/min。照射后继续灌药7天，同时观察小鼠外部表现，并记录小鼠死亡数及其存活时间。

实验结果表明：樟芝菌丝体发酵提取物有明显的辐射保护作用。(见表1)

                    表1樟芝菌丝体发酵提取物辐射保护作用效果

  分组  A  B  C  D  E  存活率％  平均存活  时间(天)  8.3  8.45±0.73  41.7  10.43±0.95  50  10.83±0.73  58.3  11±0.89  83.3  12±1.00

附图说明

本发明所述的樟芝(Antrodia camphorata)Ac001，已于2005年9月21日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：北京市中关村中国科学院微生物所内，邮政编码为100080，保藏编号为CGMCC No.1460。

图1樟芝Ac001菌株卫星搭载后电镜观察图

图2樟芝Ac001出发菌株电镜观察图

图3樟芝不同菌种菌丝体干重比较

图4樟芝不同品种液体发酵多糖含量比较

图5樟芝不同菌种酯酶(EST)同工酶谱

图6樟芝菌丝体发酵提取物多糖高效液相色谱

图7樟芝菌丝体发酵提取物糖组成分析

具体实施方式

实施例1：

将樟芝(Antrodia camphorata)通过樟芝子实体分离到的樟芝菌种，送国家航天航空部东方红宇航中心，对其进行卫星搭载，搭载的条件为：卫星质量为2100公斤，卫星温度为5～28℃，微重力量级10^-3～10^-5，近地点高度200～210公里，远地点高度300～400公里，轨道周期为90分钟，航天飞行18天，进行卫星搭载诱变。

樟芝菌种经卫星搭载诱变后，以常规方法对其多次活化培养后，观察形态，比较诱变前后菌株的差异。

①菌丝体形态观察

樟芝菌丝体经平板培养后，通过光镜及环境扫描电镜观察，可以观察到有初生菌丝和次生菌丝存在，初生菌丝壁薄，透明，胞径2.7μm～3.5μm；次生菌丝薄壁、透明微黄，具锁状联合，有分枝，胞径3.1μm～3.9μm；而出发菌株菌丝体宽度仅为2.4～2.7um。

②分生孢子及产孢结构形态观察

通过光镜及ESEM观察发现：樟芝菌丝体在平板培养阶段能够产生分生孢子。

樟芝菌丝体培养阶段产生的分生孢子属内生芽殖型(blastic)中的瓶梗孢了(phialospore)，这类孢子是从一个专门的瓶状产孢细胞上产生的，这个瓶状细胞称为瓶梗(phialide)。产孢细胞的外壁不形成分生孢子的壁。分生孢子淡橘红色，椭圆形，外壁光滑，胞径2.7～3.5μm×5.7～7.7μm；而出发菌株孢子大小仅为4.0～5.2um(见图1、图2)。

可见出发菌株经卫星搭载后，从菌丝形态到孢子大小都产生了较大的变异。

把卫星搭载诱变后樟芝菌株命名为樟芝(Antrodia camphorata)Ac001，送“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCC No.1460。

上述樟芝Ac001菌株菌丝体培养

平板培养：将樟芝Ac001菌株菌丝体接种于平板上，置28℃培养10天。

摇瓶培养：取平板培养的樟芝菌丝体5～10块(1cm²/块)移入500ml三角瓶内，其中装有用下述培养基配方制作的液体培养基，在28℃、pH6的条件下，置于旋转摇床上旋转培养7天，转速为110转/分钟。

所述培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉  1％      葡萄糖      1％

蛋白胨    0.2％    酵母膏      0.2％

硫酸镁    0.1％    磷酸二氢钾  0.05％

发酵罐培养：

培养基同上。将上述三角瓶培养所得到的菌种接种于50L发酵罐的培养基中，在28℃、pH6、发酵罐灭菌压力0.15公斤/平方厘米，通气量以1∶1.0vvw的速率、搅拌速度200转/分钟的条件下，培养7天，即得到樟芝菌丝体发酵全液，其中包括菌丝体及过滤液。

结果：每50升发酵罐发酵完毕后可得发酵全液30～35升。其中菌丝体干重为0.3公斤。发酵全液的比重为1.02。利用樟芝菌丝体发酵全液可制备其提取物。

实施例2：樟芝搭载前与搭载后的菌株培养特性比较

(1)温度比较试验

分析试验结果表明：樟芝Ac001菌丝体的萌发温度范围为6-36℃，比出发菌株(10-32℃)温度范围扩大；樟芝Ac001菌丝体生长的适宜温度范围在24℃-32℃之间(菌落呈橘红色)，而出发菌株适宜的培养温度为28-30℃(菌落呈橘红色)。

(2)pH比较试验

经试验发现；当起始pH在pH3～pH12范围内时，樟芝Ac001菌丝体都能够生长；适宜樟芝菌丝体生长的pH范围是pH5～7；当pH＝7时，培养性状良好。

而出发菌株起始pH在pH4和pH10时菌丝体生长很弱，适宜樟芝菌丝体生长的pH范围是pH6左右。

(3)菌丝体干重比较

樟芝不同品种液体培养过程中，每天取样测其菌丝体干重，结果表明，樟芝Ac001菌株菌丝体日生长量明显高于樟芝原始种，在培养第六、七天两菌株的菌丝体干重达到最高；Ac001菌株平均干重比樟芝原始种高出22.8mg/100ml。(见图3)

(4)多糖含量比较

樟芝不同品种液体培养过程中，每天取样测其多糖含量，结果表明，Ac001菌株在培养第八天多糖含量达到最高峰，而在第十天樟芝原始种才达到高峰；从多糖含量比较看来，Ac001菌株最高可达到28.4mg/ml，樟芝原始种最高只有21.7mg/ml。(见图4)

(5)酯酶同工酶比较

采用樟芝不同品种菌丝体进行酯酶同工酶分析，结果显示，两个品种都具有四条相同的酶带，Rf值分别在0.25、0.55、0.60、0.75期间，Ac001菌株在Rf值0.375处有一条新的酶带。(见图5)

实施例3：樟芝菌丝体发酵提取物的制备

(1)取樟芝菌丝体发酵全液(菌丝体和发酵液的滤液)，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/4；

(2)用体积百分比为70％的乙醇对上述浓缩的发酵液进行萃取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的4倍；

(3)70℃条件下，加热1小时；

(4)以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；

(5)将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5；

(6)用体积百分比为95％的、5倍乙醇浓缩液体积量的乙醇，对上述浓缩乙醇提取液进行20小时沉淀处理；

(7)以常规方法分离出沉淀物；

(8)将沉淀物以常规方式真空干燥或低温冷冻干燥，得樟芝菌丝体发酵提取物。

实施例4：樟芝菌丝体发酵提取物的制备

(1)取樟芝菌丝体发酵全液(菌丝体和发酵液的滤液)，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2；

(2)用体积百分比为75％的乙醇对上述浓缩的发酵液进行萃取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍；

(3)60℃条件下，加热2小时；

(4)以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；

(5)将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5；

(6)用体积百分比为95％的、7倍乙醇浓缩液体积量的乙醇，对上述浓缩乙醇提取液进行16小时沉淀处理；

(7)以常规方法分离出沉淀物；

(8)将沉淀物以常规方式真空干燥或低温冷冻干燥，得樟芝菌丝体发酵提取物。

实施例5：樟芝菌丝体发酵提取物的制备

取樟芝发酵全液30L，在浓缩罐中浓缩至原体积的1/3，接着乘热加入4倍量的80％的乙醇加热萃取，温度控计制在50℃左右，真空度为0.02公斤/平方厘米。

乙醇萃取后，接着采用真空泵将萃取液经180目的过滤器过滤，将原发酵液中的菌丝与液体分离，用纯净水反复冲洗菌丝体3次后，合并滤液，接着在浓缩器中回收萃取液中的乙醇。此时真空度控制在0.02公斤/平方厘米，温度控制在80℃左右。

乙醇回收后剩余的即为樟芝发酵全液萃取液，接着将其进行减压浓缩，浓缩罐温度为50℃，真空度为0.01公斤/平方厘米。将萃取液浓缩至原体积的1/10，比重控制在1.06.

浓缩液冷却至25℃以下时，将其放出，量其体积并置于100L不锈缸桶内，并加入95％的乙醇，加入量是浓缩液体积的6倍，室温下静置24小时。然后用移液管移出乙醇上清液，将固液分离后即可得到樟芝发酵全液乙醇提取物，随即放入真空干燥箱干燥，温度控制在50℃以下，真空度为0.02公斤/平方厘米以下。

干燥后的提取物，粉碎，过200目筛，置低温干燥处保存备用。

上述樟芝菌丝体液体发酵后活性成分的提取与分离是从发酵全液中经萃取后分离所得。

实施例6：樟芝菌丝体发酵提取物多糖分子量及糖组分测试

测试方法：

(1)纯度及分子量测定：

(2)糖组成测定：

取样品10mg溶于2mol/l三氟乙酸中，封管，在氮氧保护下100℃水解2h，水解液加甲醇后真空浓缩至干，再加甲醇如上法再反复两次，少量水溶解，分二部份，一份薄板层析检查有否糖醛酸存在，另一份用硼氢化钠还原，然后乙酰化，气相层析。

测试者：中国科学院上海药物研究所多糖实验室

测试结果：

糖组成分析(见图7)：

樟芝菌丝体发酵提取物样品含阿拉伯糖，木糖，半乳糖及葡糖糖；其摩尔比为1∶1.5∶0.4∶10.5。

样品纯度检测及分子量：

根据HPLC结果(测定条件见图6)该样品至少含五个以上组分；

其中：RT为30.38之分子量为51万

      RT为34.05之分子量为7.7万

      RT为38.20之分子量为1.7万

      RT为38.70之分子量为1.5万

      RT为42.07之分子量为0.5万

实施例7：樟芝菌丝体发酵提取物总三萜含量，总生物碱含量测定

测试者：中国科学院上海药物研究所多糖实验室

测定方法：常规方法(略)

测试结果：

                         总三萜含量(％)            总生物碱含量

樟芝菌丝体发酵提取物      0.32％                    0.22mg/ml

实施例8：樟芝菌丝体发酵提取物氨基酸测定

测试者：莱阳农学院中心实验室

样品处理方法：盐酸水解

分析仪器：日立835-50型高速氨基酸分析仪

测试结果：

ASP天门冬氨酸2.13％；ILE异亮氨酸1.54％；THR苏氨酸   1.15％；

LEU亮氨酸    1.72％；SER丝氨酸  1.27％；TYR酪氨酸   0.79％；

GLU谷氨酸    2.84％；PHE苯丙氨酸0.97％；GLY甘氨酸   1.66％；

LYS赖氨酸    1.08％；ALA丙氨酸  1.53％；NH₃氨(不计)0.59％；

CYS胱氨酸    0.32％；HIS组氨酸  0.40％；VAL缬氨酸   1.20％；

ARG精氨酸    1.26％；MET蛋氨酸  0.61％；PRO脯氨酸   1.27％。

氨基酸总和21.74。

实施例9：樟芝胶囊的制作

樟芝胶囊的原料为樟芝菌丝体发酵提取物，辅料为玉米淀粉。

称取樟芝菌丝体发酵提取物(无吸潮，无结块)50公斤；不含蛋白玉米淀粉(食品公司购买，纯白色，含水量在9％以下)450公斤。均研碎为小于200目的细粉，干燥条件下充分混匀；以每粒胶囊装0.5克的量装入0号胶囊。

胶囊内组份按樟芝菌丝体发酵提取物50mg/粒，玉米淀粉450mg/粒的配方进行配制，球磨机混合均匀后用全自动胶囊罐装机灌装。抛光后用全自动胶囊分装机分装封口(每瓶30粒)，贴标签后即为樟芝胶囊成品。

实施例10：樟芝胶囊的制作

樟芝胶囊的原料为樟芝菌丝体发酵提取物，辅料为药用糊精。

称取樟芝菌丝体发酵提取物(无吸潮，无结块)100公斤；药用糊精400公斤。均研碎为小于200目的细粉，干燥条件下充分混匀；以每粒胶囊装0.5克的量装入0号胶囊。

胶囊内组份按樟芝菌丝体发酵提取物100mg/粒，玉米淀粉400mg/粒的配方进行配制，球磨机混合均匀后用全自动胶囊罐装机灌装。抛光后用全自动胶囊分装机分装封口(每瓶30粒)，贴标签后即为樟芝胶囊成品。

实施例11：樟芝菌丝体发酵提取物抗辐射损伤作用的研究

1.1材料与方法

1.1.1材料

樟芝菌丝体发酵提取物，山东省莱阳农学院药用真菌研究所提供。

实验动物：标准昆明种小鼠，平均体重为20±2克/只。购自山东省青岛市药物检查所。

1.1.2方法

小鼠随机分为9组，每组12只，雌雄各半。给各组小鼠灌服相应各种药物，A为空白对照组，B-E为樟芝菌丝体发酵提取物组，各组给药剂量分别为mg/(kg bw.d)：50、100、150、200。一天一次，0.5ml/只/天，连续灌服13天后，进行60Co-γ射线全身照射，源距80cm，剂量8Gy，剂量率0.69Gy/min。照射后继续灌药7天，同时观察小鼠外部表现，并记录小鼠死亡数及其存活时间。

1.2结果

1.2.1观察：照射后第4天，A组小鼠开始出现被毛蓬乱无光泽，精神不振，采食量下降，眼角有黄白色分泌物，有的出现拉稀，从第5天开始陆续死亡，另外几组无异常。第5天，B组出现精神沉郁，并从第7天开始死亡。C组于第8天开始死亡，而D组和E组分别与第9天和第11天开始死亡。

1.2.2剖检：多数死亡小鼠消瘦、胃肠臌气，有眼屎，阴茎头或阴门部有黄色透明胶状分泌物附着。有的小鼠口鼻流血，除了少数肝脏呈土黄色或肺部轻微淤血外，未见其他明显病变。

1.2.3数据分析：见表1，表2

                      表1樟芝菌丝体发酵提取物辐射保护作用效果

  分组  A  B  C  D  E  存活率％  平均存活  时间(天)  8.3  8.45±0.73  41.7  10.43±0.95  50  10.83±0.73  58.3  11±0.89  83.3  12±1.00

                                表2 14天内小鼠死亡统计表

1.3讨论

实验结果表明，樟芝菌丝体发酵提取物有明显的辐射保护作用。已有研究表明，辐射能破坏人畜造血系统和免疫系统，促使机体细胞癌变；还可导致脾脏重量减小，脾脏细胞数量减少，脾淋巴细胞转化功能降低，并能导致骨髓细胞凋亡。此外，辐射还可破坏生殖系统，导致生殖能力下降。多糖具有免疫调节作用，可激活补体系统，并能促进机体诱生干扰素，增加巨嗜细胞和NK细胞活性，从而提高机体免疫力。同时真菌多糖还能提高机体的造血能力，提高机体内超氧化物歧化酶(SOD)清除自由基的能力，保护机体不受损害。樟芝菌丝体发酵提取物多糖的辐射保护作用可能与改善机体免疫系统有关，机理还有待进一步研究。