乳清蛋白酶法生产血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的方法

摘要

本发明涉及一种利用乳清蛋白酶法生产血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的方法，其主要步骤为乳清蛋白→水化→加热→降至所需要的温度→调pH→加酶→水解→加热钝化酶→脱盐→干燥→产品。

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种利用乳清蛋白酶法生产血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的方法，属于生物技术领域。

【背景技术】

高血压是对人类健康危害极大的一种疾病，潜伏期长。高血压的早期阶段，一般没有明显不适症，直至发生临床迹象心脏病发作、脑血管破裂而导致死亡。据国家高血压研究中心最新统计，我国高血压患者已达1.2亿人，其危害仅次于肿瘤。由于药物疗法存在副作用，天然食物中的降血压功能因子的开发利用将成为今后高血压非药物治疗的重要部分。

乳清蛋白是生产干酪的副产物，占牛乳蛋白质的20％左右，其生物学效价高并且含有丰富的必需氨基酸。乳清蛋白包含有多种生物活性序列，用适当的蛋白酶水解并从乳清蛋白中释放出来之后，成为具有生理活性的肽段(Aubois等，1991；欧洲专利4745506)。大量的文章描述了这类生物活性肽，例如，乳清蛋白中具有抗高血压特性的ACE抑制肽，在一定的条件下，经过酶的处理可以被有效释放(Mullally等，1997；Amhar等，1998；Pihlanto等，2000；Cornelly等，2002)。国外对乳蛋白来源的ACE抑制肽研究有一定的报道，尤其是日本对来源于乳清蛋白、酪蛋白和酸奶中的ACE抑制肽进行了较多的研究，部分取得了较大的进展。国内关于酶解乳清蛋白制取ACE抑制肽的研究未见报道。来自乳蛋白的ACE抑制肽，安全性高、无毒副作用，动物实验证实可使自发性高血压大鼠降低血压。研究表明：通过长期服用ACE抑制肽能够达到预防、抑制、缓解和辅助治疗高血压的作用。因此，开发具有调节血压作用的保健食品具有重要理论意义和应用价值。

【发明内容】

本发明的主要目的是通过酶解法生产ACE抑制肽，这其中的酶的选择是关键，因为ACE抑制肽没有一个固定的结构，应根据酶的专一性从众多的蛋白酶中进行筛选。

乳清分离蛋白(WPI9000)可以在浓度约5％-8％固体物质的范围内被水解，优选的底物浓度为6％。

用胰蛋白酶处理的WPI9000可以在pH7.5到pH9.0被水解，优选地pH8.0。

用中性蛋白酶(neutrase)处理的WPI9000可以在pH5.0到pH8.0被水解，优选地pH7.0。

用碱性蛋白酶(alcalase)处理的WPI9000可以在pH7.0到pH9.0被水解，优选地pH8.5。

用胃蛋白酶处理的WPI9000可以在pH2到pH4被水解，优选地pH3。

用木瓜蛋白酶处理的WPI9000可以在pH6到pH7被水解，优选地pH6.2。

所用酶全部是Novozymes公司生产的

蛋白水解可以在温度范围25-65℃。

加入的酶量可以为1.5％到4.5％。

分别用各种蛋白酶水解乳清蛋白，在底物浓度为6％，E/S为3％条件下水解12小时，反应结束后，进行冷冻干燥，干燥后进行ACE抑制活性的体外检测，测定结果如表1

表1  各种蛋白酶水解物的ACE抑制活性

  所用的蛋白酶  ACE抑制活性(％)  胰蛋白酶  71.51±2.02  中性蛋白酶  82.74±0.93  碱性蛋白酶  90.68±2.83  胃蛋白酶  36.27±1.89  木瓜蛋白酶  66.68±0.36

以水解物ACE抑制活性为指标，由表1筛选出碱性蛋白酶作为水解用酶。

本发明进一步利用正交实验和单因素实验对碱性蛋白酶的水解条件进行优化，建立了pH、水解温度和酶和底物的比例与ACE抑制活性之间的关系，得出碱性蛋白酶的最佳水解条件为pH8.5、底物浓度6％、温度55℃、酶量3％，水解时间为6小时。接着通过脱盐对水解物进行精制，最后通过干燥而得到具有ACE抑制活性的乳清蛋白水解物。

本发明的优点：1、本发明所制取的水解物是只对高血压患者可起到降压作用，对血压正常者无降压作用，因而不会产生降压过度的问题。2、这些水解物是经食用级酶在温和条件下获得的，其安全性极高，无副作用。3、水解物的活性的多样性，除降压功能外，往往同时具免疫促进、降胆固醇、易消化吸收、抗肿瘤等功能。

【附图说明】

图1为本发明生产流程图

【具体实施例】

实施例一、

取6g乳清分离蛋白(WPI9000)，溶于100ml水中，接着在90℃加热10min，降温至37℃调节pH至8.0，接着加入0.16g胰蛋白酶，在37℃恒温水浴振荡器中水解12h，水解过程不断添加0.1NNaOH以保持pH在8.0(上下相差不超过0.1)，水解完之后在85℃加热20min钝化酶，接着冷却后冷冻干燥，取部分干燥物进行ACE抑制活性的体外检测，得出水解物的ACE抑制活性为71.51％±2.02％

实施例二、

取6g乳清分离蛋白(WPI9000)，溶于100ml水中，接着在90℃加热10min，降温至50℃调节pH至7.0，接着加入0.16g中性蛋白酶，在50℃恒温水浴振荡器中水解12h，水解过程不断添加0.1NNaOH以保持pH在7.0(上下相差不超过0.1)，水解完之后在85℃加热20min钝化酶，接着冷却后冷冻干燥，取部分干燥物进行ACE抑制活性的体外检测，得出水解物的ACE抑制活性为82.74％±0.93％。

实施例三、

取6g乳清分离蛋白(WPI9000)，溶于100ml水中，接着在90℃加热10min，降温至60℃调节pH至8.5，接着加入0.16g碱性蛋白酶，在60℃恒温水浴振荡器中水解12h，水解过程不断添加0.1NNaOH以保持pH在8.5(上下相差不超过0.1)，水解完之后在85℃加热20min钝化酶，接着冷却后冷冻干燥，取部分干燥物进行ACE抑制活性的体外检测，得出水解物的ACE抑制活性为90.68％±2.83％。

实施例四

取6g乳清分离蛋白(WPI9000)，溶于100ml水中，接着在90℃加热10min，降温至60℃调节pH至3，接着加入0.16g胃蛋白酶，在60℃恒温水浴振荡器中水解12h，水解过程不断添加0.1N盐酸以保持pH在3(上下相差不超过0.1)，水解完之后在85℃加热20min钝化酶，接着冷却后冷冻干燥，取部分干燥物进行ACE抑制活性的体外检测，得出水解物的ACE抑制活性为36.27％±1.89％。

实施例五

取6g乳清分离蛋白(WPI9000)，溶于100ml水中，接着在90℃加热10min，降温至60℃调节pH至6.2，接着加入0.16g木瓜蛋白酶，在60℃恒温水浴振荡器中水解12h，水解过程不断添加0.1N盐酸以保持pH在6.2(上下相差不超过0.1)，水解完之后在85℃加热20min钝化酶，接着冷却后冷冻干燥，取部分干燥物进行ACE抑制活性的体外检测，得出水解物的ACE抑制活性为66.68％±0.36％。

实验例一、

以碱性蛋白酶为水解用酶，以底物浓度、酶的用量、pH、温度为试验因素，采用L₉(3)⁴正交试验设计，设定水解时间为12小时，筛选最佳的水解条件。有实验结果可知，在本试验选定的水平下，各因素对ACE抑制活性的影响的主次顺序为pH＞底物浓度＞温度＞酶和底物的比例。并有结果可以得出碱性蛋白酶水解乳清蛋白制取ACE抑制肽的最佳组合为pH8.5+6％底物浓度+55℃温度+3％酶量。

实验例二、

在碱性蛋白酶最佳水解条件下(pH8.5+6％底物浓度+55℃温度+3％酶量)水解乳清蛋白，分别在1，2，3，6，9，12，24小时取样，失活酶以后进行冷冻干燥，接着进行ACE抑制活性的测定，在水解过程中，ACE抑制活性随着时间的延长不断升高，到达6小时时，ACE抑制活性达到90％以上，随着水解时间的延长ACE抑制活性变化不大。因此，从ACE抑制活性来看，水解6个小时就可以了。另外对水解过程中水解度的变化进行了测定，结果表明：在反应最初的一个小时内，反应非常迅速，水解度急剧上升。表明在反应开始时，蛋白质被蛋白酶迅速降解，水解度增加明显，反应达到6h时，水解度达到16.92％，随着水解反应时间的继续增加，水解度缓慢增加，因此，从水解度的角度来看，水解6h也比较合适。

实验例三、

取6g乳清分离蛋白(WPI9000)，溶于100ml水中，接着在90℃加热10min，降温至60℃调节pH至8.5，接着加入0.16g碱性蛋白酶，在60℃恒温水浴振荡器中水解6h，水解过程不断添加0.1NNaOH以保持pH在8.5(上下相差不超过0.1)，水解完之后在85℃加热20min钝化酶，接着通过阴阳离子交换树脂进行脱盐，干燥后得到具有ACE抑制活性的乳清蛋白水解物。对具有ACE抑制活性的乳清蛋白水解物基本成分进行分析，结果表明：蛋白质含量大于96％，灰分小于1.5％。