三种鱼病病毒的单管RT－PCR检测的阳性对照的制备方法

摘要

本发明是一种病毒性出血性败血症病毒、鱼传染性造血器官坏死症病毒和传染性胰脏坏死症病毒的单管RT－PCR检测的阳性对照的制备方法，其特征在于，分别选取病毒性出血性败血症病毒的G基因、鱼传染性造血器官坏死症病毒的VP基因和传染性胰脏坏死症病毒的N基因作为目的基因片段，将目的基因片段插入pUC57质粒载体，再转染DH5α大肠杆菌，进行体外大量表达，分别扩增出625bp、371bp、206bp的片段。本发明方法制备的阳性对照安全、易保存，避免了现有技术中直接使用病毒感染材料易造成病毒扩散、直接用病毒感染材料提取RNA作阳性对照易降解、不易长期保存等缺陷，便于作为商品化试剂盒的阳性对照，具有很高的实用价值。

说明书

                    技术领域

本发明涉及一种检测水生动物特别是鱼类病毒的阳性对照的制备方法，特别是一种病毒性出血性败血症病毒、鱼传染性造血器官坏死症病毒和传染性胰脏坏死症病毒的单管RT-PCR检测的阳性对照的制备方法。

                    背景技术

病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、鱼传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)和传染性胰脏坏死症病毒(IPNV)是同被列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》的二类传染病，VHS和IHN分别是《中华人民共和国动物防疫法》规定的二类和三类疫病，这三种是国际兽疫局OIE名录中的疾病。IHN和VHS病毒均属于弹状病毒科单链RNA病毒，IHN病毒引起鲑科多种鱼的致死性疾病，通过污染的水、饲料和粪便等传播，幼鱼和鱼苗死亡率可达100％，成鱼感染可终身带毒并散毒，VHS病毒可引起各种年龄的鲑科多种鱼发病，死亡率达80-100％，IPN病毒属双RNA病毒科双链RNA病毒，引起包括鲑科鱼在内的很多水生动物的急性高度传染性疾病。这3种病毒病均是由RNA病毒引起的急性高度传染性疾病，可侵害多种海水和淡水养殖鱼类，在欧、美、日、韩及部分亚洲国家流行，可通过鱼体及所产卵、精液、尿、粪便以及污染的饲料、水等传播，对养殖场造成致命打击，危害非常严重。对上述3病的最好的控制方法是加强对养殖场检测，防止病毒传入鱼群。目前对三种鱼病普遍采用的检测方法是用病料接种敏感鱼及细胞进行病毒增殖，分离纯化病毒，然后用血清中和、免疫荧光和酶联免疫检测方法进行病毒鉴定，其操作步骤复杂繁琐，时间长达2-4周。由于这三种病毒都是RNA病毒，用病毒感染材料提取RNA用于RT-PCR反应，对所用实验耗材如试管、吸管等要求高，处理比较复杂，以消除其中的RNA酶，因为RNA易受环境中RNA酶作用而降解，提取的RNA阳性对照用常规方法只能保存1周左右，直接使用病毒感染材料还易造成病毒扩散，不便作为商品化试剂盒的阳性对照。

                    发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种病毒性出血性败血症病毒、鱼传染性造血器官坏死症病毒和传染性胰脏坏死症病毒的单管RT-PCR检测的阳性对照的制备方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种病毒性出血性败血症病毒、鱼传染性造血器官坏死症病毒和传染性胰脏坏死症病毒的单管RT-PCR检测的阳性对照的制备方法，其特点是，分别选取病毒性出血性败血症病毒的G基因、鱼传染性造血器官坏死症病毒的VP基因和传染性胰脏坏死症病毒的N基因作为目的基因片段，将目的基因片段插入pUC57质粒载体，再转染DH5α大肠杆菌，进行体外大量表达，分别扩增出625bp、371bp、206bp的片段，其中，

插入的VHSV目的基因片段序列是：

agggaagatt cctttgtccc gattcgacca gctcaactca ggtgtcctca

tgaatttgaa gacataaaca agggactggt ttccgtccca actcagatca

tccatctccc gctatcagtc accagcgtct ccgcagtagc gagtggccac

tacctgcaca gagtgactta tcgagtcacc tgttcgacca gcttctttgg

agggcaaacc atcgaaaaga ccatcttgga ggcgaaactg tctcgtcagg

aggccacaaa cgaggcaagc aaggatcacg agtacccgtt cttccctgaa

ccctcctgca tctggatgaa aaacaatgtc cataaggaca taactcacta

ttacaagacc ccaaaaacag tatcggtgga tctctacagc aggaaatttc

tcaaccctga tttcatagag ggggtttgca caacctcgcc ctgtcaaact

cattggcagg gagtctattg ggtcggtgcc acacctaaag cccattgccc

cacgtcggaa acactagaag gacacctgtt caccaggacc catgatcaca

gggtggtcaa ggcaattgtg gcaggccatc atccctgggg actcacaatg

gcatgcacag tgacattctg cgggacagaa tggatcaaga ccgacctggg

ggacctgatc ；

插入的IHNV目的基因片段序列是：

ggcgagttgg ttaacttcaa cgccaacagg ggagtcctgg ccaagatcgg

ggcggtgctt agacccggac agaagctcac caaggctatc tatgggatca

ttctcatcaa cctgtccgac ccagccatcg ctgccagagc caaggcactg

tgcgccatga gactgagcgg gacaggaatg acaatggtgg ggctgttcaa

ccaagccgca aagaacctgg gcgcccttcc agccgacctt ttagaggatc

tgtgcatgaa gtcagtggtg gagtccgcca gacgcattgt cagactgatg

aggatcgtag cagaggcccc aggggtagca gcaaagtacg gtgtcatgat

gagcaggatg ctcggggagg ggtacttcaa ggcctacggg ；

插入的IPNV目的基因片段序列是：

atgagcacac acaaggcaac cgcaacttac ttgagatcca ttatgcttcc

agagactgga ccagcaagca ttccggacga cataacggag agacacatcc

taaaacaaga gacctcgtca tacaacttag aggtctccga atcaggaagt

ggaattcttg tttgtttccc tggagcacca ggatcaaggg tcggtgcaca

ctacaggtgg aatctgaacc agacgggact agagttcgac 。

本发明中的pUC57质粒载体为已知载体，其序列可以通过网络查询，网址www.fermentas.com，或从基因数据库GenBank/EMBLaccession number Y14837找到。

本发明的阳性对照可以置于下列试剂盒，并在下列检测方法中应用来同步检测某些方面鱼传染性造血器官坏死症病毒、传染性胰脏坏死症病毒和病毒性出血性败血症病毒，

试剂盒：由下列物品构成，

(1)阴性对照，不含IHNV、IPNV和VHSV 3种病毒核酸成分的组织提取液，1支；

(2)阳性对照，应用本发明方法制得；

(3)dNTP，1支；

(4)含Mg²⁺的PCR缓冲液，1支；

(5)引物对ihnf/ihnr，各1支；

ihnf为：5’-gttaacttcaacgccaacagg，

ihnr为：5’-tgaagtacccctccccgagcatcc；

(6)引物对ipnf/ipnr，各1支；

ipnf为：5’-ccgcaacttacttgagatccattatgc，

ipnr为：5’-cgtctggttcagattccacctgtagtg；

(7)引物对vhsf/vhsr，各1支；

vhsf为：5’-cgaccagctcaactcaggtgtcc，

vhsr为：5’-ccaggtcggtcttgatccattctgtc；

(8)DNA聚合酶，1支；

(9)逆转录酶，1支；

(10)RNA酶抑制剂，1支；

(11)100％DEPC溶液，1支；

(12)包装盒子1个，泡沫板1块，其大小与包装盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有若干数量的小孔，分别用于放置上述物品。

检测方法：

(1)样品中RNA模板的提取：取易感组织样品匀浆液或可疑病毒感染悬液100-500μl，加入500-800μl Trizol试剂，旋涡30s，加入200μl按24∶1比例配制的氯仿与异戊醇混合液，旋涡30s，10000-15000r/min离心5-3min，取上清，加入等量异丙醇溶液同上离心，取沉淀，加入300μl的70％乙醇溶液同上离心后，去上清，风干，加入50μl的0.01％DEPC水溶液，取2-10μl用于RT-PCR；

(2)RT-PCR预混合液的配制：先按下列术式预先加入各试剂并混合好，各试剂加入前需离心数秒钟，

dNTP                 1μl；

含Mg²⁺的PCR缓冲液，5μl；

引物对ihnf/ihnr      2μl；

引物对ipnf/ipnr，    2μl；

引物对vhsf/vhsr，    2μl；

DNA聚合酶，          0.5μl；

逆转录酶，           0.5μl；

RNA酶抑制剂，        0.25μl；

0.01％DEPC水溶液，  若干；

然后在上述混合液中分别加入：

RNA模板，2-10μl，得RT-PCR预混合液A，总体积50μl；

阴性对照，5μl，得RT-PCR预混合液B，总体积50μl；

阳性对照，5μl，得RT-PCR预混合液C，总体积50μl；

(3)将上述RT-PCR预混合液A、B、C装入PCR反应管，置于基因扩增仪中，如仪器无热盖，加入1-2滴石蜡油封盖，设置RT-PCR循环参数如下，进行扩增：

42℃×30min

95℃×4min

72℃×10min

25℃×1min或结束

(4)扩增反应结束后，取10-15μl加入4μl溴酚蓝混匀，经2％琼脂糖凝胶电泳，电压按5V/cm电泳30-40min后于紫外分析仪下观察，阴性对照和阳性对照正确，样品RNA提取液若在625bp、371bp、206bp处出现条带，则分别为VHSV、IHNV和IPNV阳性，说明待测样品中携带三种病毒，若出现其中之一条带，则对应的病毒检测结果为阳性，否则为阴性。

与现有技术相比，本发明方法制备的阳性对照安全、易保存，避免了现有技术中直接使用病毒感染材料易造成病毒扩散、直接用病毒感染材料提取RNA作阳性对照易降解、不易长期保存等缺陷，便于作为商品化试剂盒的阳性对照。该阳性对照可应用于对IHNV、IPNV和VHSV三种病毒进行定性检测，对三种病毒进行定性检测时，简便快速，特异性好，灵敏度高，可应用于进出境鱼类3种鱼病的检测和养殖场的疫情监测，防制疫病传播流行，具有很高的实用价值。

                      附图说明

附图为本发明的设计结构图。

                    具体实施方式

实施例1。参照附图。一种病毒性出血性败血症病毒、鱼传染性造血器官坏死症病毒和传染性胰脏坏死症病毒的单管RT-PCR检测的阳性对照的制备方法，分别选取病毒性出血性败血症病毒的G基因、鱼传染性造血器官坏死症病毒的VP基因和传染性胰脏坏死症病毒的N基因作为目的基因片段，将目的基因片段插入pUC57质粒载体，再转染DH5α大肠杆菌，进行体外大量表达，分别扩增出625bp、371bp、206bp的片段，其中，

插入的VHSV目的基因片段序列是：

agggaagatt cctttgtccc gattcgacca gctcaactca ggtgtcctca

tgaatttgaa gacataaaca agggactggt ttccgtccca actcagatca

tccatctccc gctatcagtc accagcgtct ccgcagtagc gagtggccac

tacctgcaca gagtgactta tcgagtcacc tgttcgacca gcttctttgg

agggcaaacc atcgaaaaga ccatcttgga ggcgaaactg tctcgtcagg

aggccacaaa cgaggcaagc aaggatcacg agtacccgtt cttccctgaa

ccctcctgca tctggatgaa aaacaatgtc cataaggaca taactcacta

ttacaagacc ccaaaaacag tatcggtgga tctctacagc aggaaatttc

tcaaccctga tttcatagag ggggtttgca caacctcgcc ctgtcaaact

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cacgtcggaa acactagaag gacacctgtt caccaggacc catgatcaca

gggtggtcaa ggcaattgtg gcaggccatc atccctgggg actcacaatg

gcatgcacag tgacattctg cgggacagaa tggatcaaga ccgacctggg

ggacctgatc ；

插入的IHNV目的基因片段序列是：

ggcgagttgg ttaacttcaa cgccaacagg ggagtcctgg ccaagatcgg

ggcggtgctt agacccggac agaagctcac caaggctatc tatgggatca

ttctcatcaa cctgtccgac ccagccatcg ctgccagagc caaggcactg

tgcgccatga gactgagcgg gacaggaatg acaatggtgg ggctgttcaa

ccaagccgca aagaacctgg gcgcccttcc agccgacctt ttagaggatc

tgtgcatgaa gtcagtggtg gagtccgcca gacgcattgt cagactgatg

vaggatcgta cagaggcccc aggggtagca gcaaagtacg gtgtcatgat

gagcaggatg ctcggggagg ggtacttcaa ggcctacggg ；

插入的IPNV目的基因片段序列是：

atgagcacac acaaggcaac cgcaacttac ttgagatcca ttatgcttcc

agagactgga ccagcaagca ttccggacga cataacggag agacacatcc

taaaacaaga gacctcgtca tacaacttag aggtctccga atcaggaagt

ggaattcttg tttgtttccc tggagcacca ggatcaaggg tcggtgcaca

ctacaggtgg aatctgaacc agacgggact agagttcgac 。