一种抑制1A6/DRIM基因表达的小干扰RNA及其作用位点

摘要

本发明公开了一种抑制1A6/DRIM基因表达的小干扰RNA及其作用位点。小干扰RNA抑制1A6/DRIM基因表达的一个作用位点，是双链寡核苷酸序列，其自5′→3′方向的链具有序列表中序列1的核苷酸序列。抑制1A6/DRIM基因表达的小干扰RNA，是由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成的双链RNA：正义链具有序列表中序列2的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列3的核苷酸序列。本发明的抑制1A6/DRIM基因表达的小干扰RNA可用于治疗1A6/DRIM基因表达阳性的胃癌和乳腺癌。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抑制1A6/DRIM基因表达的小干扰RNA及其作用位点。

背景技术

乳腺癌的发病率在世界范围呈逐渐升高的趋势，在我国已达到52/10万。乳腺癌的术后复发转移严重影响乳腺癌病人的预后，对乳腺癌复发转移的高危人群进行个体化治疗是改变乳腺癌病人预后的关键手段。胃癌是严重威胁人类健康的重大疾病，在我国肿瘤发病中居第3位。要想改善胃癌病人的预后也需要针对病人基因表达情况进行个体化治疗。

RNA干扰(RNA interference)是近年来广泛应用于沉默基因表达的一个有效而特异的新技术(Lipardi，C.，Wei，Q.，& Paterson，B.M.RNAi as randomdegradative PCR：siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degradedto generate new siRNAs.Cell 107，297-307(2001)；Nykanen，A.，Haley，B.& Zamore，P.D.ATP requirements and small interfering RNA structure in theRNA interference pathway.Cell 107，309-321(2001)；Elbashir，S.M.et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in culturedmammalian cells.Nature 411，494-498(2001))。人们发现在动物和植物细胞中天然存在长为19nt或21nt的小双链RNA，这些小双链RNA能将特异基因的mRNA降解成小的片段，起到基因沉默作用，这样的小双链RNA称为小干扰RNA(smallinterfernce RNA，siRNA，or RNA interference，RNAi)。SiRMA可用于研究基因的功能，同时由于其特异性强，效果好，对肿瘤基因进行沉默具有预防和治疗肿瘤的应用前景。

柯杨，徐国威等首先从一对胃癌细胞系中通过差异显示技术分离得到肿瘤相关基因1A6(柯杨，徐国威，Koichi H，等.化学致癌作用靶基因的分离与测序，中国科学，1996，26：85-91)；Schwirzke M从乳腺癌细胞系中分离得到DRIM(Schwirzke M，Gnirke A，Bork P，Tarin D，Weidle UH(1998)：DifferentialGene Expression in Mammary Carcinoma Cell Lines：Identification of DRIM，a New Gene Down-Regulated in Metastasis.Anticancer Res 18，1409-22)。BLAST分析发现1A6与DRIM是同一基因，将该基因命名为1A6/DRIM。Xing X，DuX等对1A6/DRIM的启动子的研究已发表在Gene杂志上(Xing X，Du X，Lu Z，NingT，Su X and Ke Y.Characterization of the promoter of 1A6/DRIM，a novelcancer-related gene and identification of its transcriptional activator.Gene，2005，344：161-169)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供小干扰RNA抑制1A6/DRIM基因表达的一个作用位点。

本发明所提供的小干扰RNA抑制1A6/DRIM基因表达的一个作用位点，是双链寡核苷酸序列，其自5′→3′方向的链具有序列表中序列1的核苷酸序列。

序列表中的序列1由19个核苷酸组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

本发明的第二个目的是提供一个抑制1A6/DRIM基因表达的小干扰RNA。

本发明所提供的抑制1A6/DRIM基因表达的小干扰RNA，名称为1A6/DRIM^siRNA，是由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成的双链RNA：正义链具有序列表中序列2的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列3的核苷酸序列。

序列表中的序列2由19个核苷酸组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中的序列3由19个核苷酸组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

上述抑制1A6/DRIM基因表达的小干扰RNA的编码cDNA(1A6/DRIM^siRNA)的也属于本发明的保护范围。

抑制1A6/DRIM基因表达的小干扰RNA的1A6/DRIM^siRNA编码cDNA具体可由具有下述核苷酸序列的有义链和反义链组成：有义链(正义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中序列4的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中序列5的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中序列4由47个脱氧核苷酸组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列5由47个脱氧核苷酸组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

含有1A6/DRIM^siRNA的编码基因的表达载体、细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种抑制胃癌和乳腺癌的药物。

本发明所提供的抑制胃癌和乳腺癌的药物，它们的活性成分是上述抑制1A6/DRIM基因表达的小干扰RNA或携带所述抑制1A6/DRIM基因表达的小干扰RNA编码基因的表达载体，如pSUPER-2-8。

上述药物中还可含有佐剂DDA和/或MPL和/或Quil-A和/或RIBI佐剂和/或saline(生理盐水)或其它佐剂，如铝佐剂，福氏佐剂等。

本发明的药物可制成注射液、粉剂、膏剂、纳米制剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照基因药物/寡核苷酸药物领域的方法制备。

上述药物的用量一般为20-200μg 1A6/DRIM^siRNA或含有1A6/DRIM^siRNA编码基因的表达载体/kg体重/天，疗程为10至20天，或在每次放射治疗或化疗前12-24小时用一次。

本发明的实验表明1A6/DRIM在85％的乳腺癌中表达，在低转移的乳腺癌中1A6/DRIM表达率为68％，而在高转移的乳腺癌中1A6/DRIM表达率为100％；1A6/DRIM^siRNA可抑制1A6/DRIM的表达，使高转移乳腺癌细胞的侵袭力显著下降。在胃癌的发生过程中，1A6/DRIM的表达可作为胃癌发生发展的预警信号，1A6/DRIM表达阳性的胃粘膜癌前病变发展为胃癌的风险较1A6/DRIM表达阴性的胃粘膜癌前病变的风险高10倍，而1A6/DRIM^siRNA通过抑制1A6/DRIM的表达显著抑制了胃癌细胞的增殖。本发明的抑制1A6/DRIM基因表达的小干扰RNA可用于治疗1A6/DRIM基因表达阳性的胃癌和乳腺癌。

附图说明

图1为1A6/DRIM基因在肿瘤细胞内的表达

图2为免疫组化检测1A6/DRIM基因在胃癌肿瘤组织中的表达照片

图3为免疫组化检测1A6/DRIM基因在乳腺癌组织中表达的照片

图4为1A6/DRIM^siRNA转染胃癌细胞BGC-823细胞的Western Blotting图谱

图5为1A6/DRIM的表达被1A6/DRIM^siRNA抑制后细胞增殖能力下降

图6为转染s2-8后高转移乳腺癌细胞MDA-MB231的细胞侵袭力实验结果

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、1A6/DRIM基因在肿瘤中的表达特点

一、单克隆抗体6D9的制备

单克隆抗体6D9按照1998年赵虹的学位论文“新的肿瘤相关基因1A6的功能研究”描述的方法制备，主要步骤如下：

1、表达载体pGEX1893的构建：将1A6/DRIM的第7000至8640bp的1641bp片段(Schwirzke M，Gnirke A，Bork P，Tarin D，Weidle UH(1998)：DifferentialGene Expression in Mammary Carcinoma Cell Lines：Identification of DRIM，a New Gene Down-Regulated in Metastasis.Anticancer Res 18，1409-22)经DNA重组技术克隆到原核表达载体pGEX-5X-1(Promema)中，得到表达载体pGEX1893，DNA序列分析证明序列及阅读框架正确，构建了原核表达载体pGEX1893。

2、GST-1A6/DRIM重组蛋白的诱导、表达及纯化：将表达质粒pGEX1893导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，用IPTG诱导，用无转化质粒的大肠杆菌BL21(DE3)样品作对照，取大肠杆菌全裂解液、大肠杆菌裂解上清和包含体提取物，行SDS-PAGE胶电泳，用考马斯亮兰染色，pGEX1893在大肠杆菌BL21(DE3)中表达分子量约82kD的目的蛋白，并且以包含体形式存在，用碱变性、电洗脱法提取包含体重组蛋白得到了GST-1A6/DRIM融合蛋白。

3、单克隆抗体的制备、鉴定：用上述纯化的GST-1A6/DRIM融合蛋白常规免疫Balb/c小鼠，效价达10^-4时，将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。HAT选择培养第5天，杂交瘤细胞生长，融合率为60％。融合后通过ELISA筛选与GST-1A6/DRIM融合蛋白反应强阳性的单克隆。选出能稳定分泌抗GST-1A6/DRIM融合蛋白的杂交瘤细胞株，体外连续培养2个月以上及液氮冻存4个月后，仍能稳定分泌单克隆抗体。将上述杂交瘤细胞株扩大培养，均能诱导Balb/c小鼠产生抗人1A6/DRIM的腹水。腹水中抗体用高盐-Protein A Sepharose-4B柱进行层析纯化，用ELISA检测纯化的抗体，结果表明纯化的抗体能与融合蛋白GST-1A6/DRIM特异反应，表明得到抗1A6/DRIM的单克隆抗体，将其命名为6D9。

二、利用单克隆抗体6D9检测1A6/DRIM基因在肿瘤中的表达

提取宫颈癌Hela，白血病细胞K-562，淋巴瘤细胞U266(American Type CellCollection)，前列腺癌细胞PC-3m，乳腺癌细胞MCF-7，高转移乳腺癌细胞MDA-MB231，鼠成纤维细胞NIH3T3和胃癌细胞BGC-823的细胞核和细胞浆蛋白，经SDS-PAGE分离转移至PVDF膜上，以6D9为一抗，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗(中山公司)进行Western Blotting检测1A6/DRIM的表达。同时以抗β-actin的抗体(中山公司)为一抗检测β-actin，作为上样对照；以抗DNA拓扑异构酶TopoI的抗体(Santa Cruz公司)为一抗检测DNA拓扑异构酶TopoI，作为细胞核标记物。结果如图1所示，表明1A6/DRIM基因在宫颈癌Hela，白血病细胞K-562，前列腺癌细胞PC-3m，乳腺癌细胞MCF-7，高转移乳腺癌细胞MDA-MB231和胃癌细胞BGC-823的细胞核内表达。图1中，N为细胞核蛋白，C细胞浆蛋白。

用抗1A6/DRIM的抗体6D9对胃癌和正常胃粘膜组织进行免疫组织化学分析，结果如图2所示，表明1A6/DRIM基因在胃癌组织中的表达率远大于在正常胃粘膜组织组织中的表达率(表达率为1A6/DRIM染色阳性的胃癌肿瘤细胞占所有胃癌肿瘤细胞的百分数)。其中，免疫组织化学染色方法如下：

1、石蜡切片常规脱蜡：二甲苯3次，每次60min→100％乙醇两次，每次3min→→95％乙醇3min→75％乙醇3min→1×PBS；3％H₂O₂室温10min阻断内源性过氧化物酶；

2、抗原微波修复：切片放入0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中修复抗原，92℃-98℃至少维持10min后室温冷却20-30min；1×PBS洗3次每次5min，10％正常羊血清37℃封闭1小时；吸去羊血清，加入抗1A6/DRIM的抗体6D9(1∶200)4℃放置8小时；1×PBS洗3次每次5min，加入生物素标记的羊抗鼠IgG(中山公司)，37℃作用30min；1×PBS洗3次每次5min，加入辣根过氧化物酶标记的三抗链霉卵白素(HRP-Strepavidin)(中山公司)，37℃作用30min；1×PBS洗3次每次5min，DAB避光显色5～10min，用水冲洗终止反应，10％苏木精复染，1％盐酸-酒精分色；逐级酒精脱水、二甲苯透明(75％乙醇3min→95％乙醇3min→100％乙醇→二甲苯两次，每次3min)；中性树胶加盖玻片封片。

用抗1A6/DRIM的抗体6D9利用免疫组化的方法，对胃癌高发现场10年前瞻性随访的人群胃镜样本染色，发现在不同阶段的进展组中，早期1A6/DRIM阳性者发展成肿瘤的几率明显大于10年中非进展者(表1)，表明1A6/DRIM在胃的癌前病变中的表达与其预后高度相关，提示1A6/DRIM可以作为胃癌前病变转归的一个预测指标。

表11A6/DRIM基因在进展性和非进展性胃粘膜疾病中的表达

  分组  例数  表达1A6/DRIM的例数及表达率  进展组  肠化生→萎缩性胃炎  肠化生→胃癌  萎缩性胃炎→胃癌  非进展组  肠化生→肠化生  萎缩性胃炎→萎缩性胃炎  107  43  24  40  101  65  36  68(63.6％)a  25(58.1％)b  14(58.3％)c  29(72.5％)d  36(35.6％)  20(30.8％)  16(44.4％)

a：P＜0.001(X2＝12.229)，与非进展组比较；b：P＜0.01(X2＝7.984)，与肠化生→肠化生组比较；c：P＜0.05(X2＝5.641)，与肠化生→肠化生组比较；d：P＜0.05(X2＝6.557)，与萎缩性胃炎→萎缩性胃炎比较；表达率为表达1A6/DRIM的例数与总例数的比值。

用抗1A6/DRIM的抗体6D9进行免疫组化分析乳腺癌组织和正常乳腺组织中1A6/DRIM基因的表达情况，结果表明1A6/DRIM在乳腺癌组织中的表达显著上调(图3，棕色为阳性染色)，1A6/DRIM的表达与乳腺癌的转移高度相关(表2)，1A6/DRIM在85％的乳腺癌中表达，在低转移的乳腺癌中1A6/DRIM表达率为68％，而在高转移的乳腺癌中1A6/DRIM表达率为100％。表2中，“-”表示1A6/DRIM不表达“+”、“++”、“+++”分别表示1A6/DRIM表达强度依次增强。

表2.1A6/DRIM在高转移乳腺癌和低转移乳腺癌组织中的表达情况

  1A6/DRIM表达强  度  表达1A6/DRIM的  非转移乳腺癌例数  及百分率  表达1A6/DRIM  的转移乳腺癌  例数及百分率  P值  -  10(31.3％)  0  +  8(25.8％)  4(17.4％)  ++  10(31.3％)  15(65.2％)  +++  3(9.6％)  4(17.4％)  总病例  31  23  P＝0.003

经x2(Chisquare)检验，高转移与低转移组1A6/DRIM的表达存在显著性差异(p＝0.003)。

实施例2、1A6/DRIM^siRNA抑制1A6/DRIM基因的表达

一、1A6/DRIM^siRNA的转染

1、1A6/DRIM^siRNA的设计合成

SiRNA的设计合成：根据RNA干扰的原理，在1A6/DRIM基因的mRNA序列上选择可能的具有抑制1A6/DRIM蛋白质表达的siRNA序列，选择条件如下：选择范围在蛋白质编码区的终止密码前100bp内，5端以AA开始3端以TT结尾的长19nt的序列，最后选择了如下序列：5’-GCCATAGCCTGAAAGATTT-3’。设计小干扰1A6/DRIM^siRNA(s2-8)，s2-8的正义链为：5′-gccauagccu gaaagauuu-3′(序列2)；反义链为5′-aaaucuuuca ggcuauggc-3′(序列3)。阴性对照siRNA(s-NC)正义链序列为：5’-ACU ACC GUU GUU AUA GGU G-3’，反义链为：5’-ACC UAU AACAAC GGU AGU-3’。

小干扰1A6/DRIM^siRNA(s2-8)和s-NC按常规方法化学合成，经PAGE纯化。

2、1A6/DRIM^siRNA的转染

将s2-8通过LipofectAMINE²⁰⁰⁰(Invitrogen公司产品)转染胃癌细胞系BGC-823或高转移乳腺癌细胞系MDA-MB231细胞，同时将阴性对照s-NC转染细胞。转染48，72，96，120和144小时分别提取细胞蛋白，经SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上，用抗1A6/DRIM单克隆抗体6D9进行Western Blotting检测1A6/DRIM的表达，同时以抗β-actin的抗体(中山公司)为一抗检测β-actin，作为上样对照。实验结果显示在转染后48、72、96、120至144小时，1A6/DRIM^siRNA在BGC-823和MDA-MB231细胞中均能抑制1A6/DRIM的表达。其中，1A6/DRIM^siRNA抑制1A6/DRIM基因在BGC-823中的表达结果如图4所示。图4中，s2-8表示s2-8转染的细胞，s-NC表示s-NC转染的细胞。

s2-8或s-NC转染BGC-82348小时后，分别将500个细胞接种于6mm培养皿，进行克隆形成实验，并用抗1A6/DRIM单克隆抗体6D9进行Western Blotting检测1A6/DRIM的表达，以抗β-actin的抗体为一抗检测β-actin，作为上样对照。结果表明转染s2-8的BGC-823克隆形成能力降低，1A6/DRIM的表达量降低，说明内源1A6/DRIM的表达被抑制后BGC-823细胞的生长被抑制(图5)。图5中，a为s2-8或s-NC转染BGC-823细胞后，克隆形成实验结果；823-s-NC为转染s-NC的BGC-823细胞，823-s2-8为转染s2-8的BGC-823细胞。图5中b为s2-8或s-NC转染BGC-82348小时后的Western blot分析结果，823为未转染的BGC-823细胞，823-s-NC为转染s-NC的BGC-823细胞，823-s2-8为转染s2-8的BGC-823细胞，β-actin为上样对照。图5中c为三次克隆形成实验结果的总结，823-s-NC为转染s-NC的BGC-823细胞，823-s2-8为转染s2-8的BGC-823细胞。

3、细胞侵袭实验--Matrigel穿膜侵袭实验

取s2-8或s-NC转染48小时后的高转移乳腺癌细胞MDA-MB231(ATCC)，消化后进行活细胞计数，用含0.1％血清的DMEM培养液将细胞浓度调整至6×10⁴个/ml。在Matrigel Invasion Chamber(BD公司产品)中加入含3×10⁴个细胞的细胞悬液500μl，在Matrigel Invasion Chamber的下面加入0.75ml的含10％血清的DMEM培养液，37℃，5％CO2孵育箱中培养24h。吸去上室液体，湿棉签擦去膜表面未侵袭的细胞及Matrigel，生理盐水漂洗，稍干，甲醇固定30min，常规H.E.染色。每组设3个平行样本，计数每张膜的穿膜细胞数。每组实验平行两孔进行，实验重复3次，将实验结果进行统计学分析。同时并用抗1A6/DRIM单克隆抗体6D9对s2-8或s-NC转染48小时后的高转移乳腺癌细胞MDA-MB231进行WesternBlotting检测1A6/DRIM的表达，以抗β-actin的抗体为一抗检测β-actin，作为上样对照。Western Blotting检测结果如图6中A所示，表明转染s2-8的MDA-MB231的1A6/DRIM的表达量降低，β-actin为上样对照。细胞侵袭实验结果如图6中B和表3所示，转染s2-8的高转移乳腺癌细胞MDA-MB231体外侵袭能力下降，MDA-MB231内源性1A6/DRIM的表达被抑制后，细胞侵袭力下降10倍(表3)，说明抑制1A6/DRIM的表达对乳腺癌细胞的转移起到显著抑制作用。图6中，MDA-MB231-s2-8为转染s2-8的高转移乳腺癌细胞MDA-MB231，MDA-MB231-s-NC为转染s-NC的高转移乳腺癌细胞MDA-MB231；A为Western Blotting检测1A6/DRIM的抑制情况，B为具有侵袭力的细胞的穿过Matrigel Invasion Chamber的细胞染色。

                        表3、细胞侵袭力实验结果

  MDA-MB231-s2-8  MDA-MB231-s-NC  侵袭细胞数平均值±  标准差  4.6±2.1  46±8.5  P＜0.01

二、1A6/DRIM^siRNA表达载体的转染

1.1A6/DRIM^siRNA表达载体的构建

根据构建siRNA载体pSUPER(Invitrogen公司)的要求，合成如下两条寡核苷酸：正义链：5’-GATCCCC GCC ATA GCC TGA AAG ATTT ttcaagaga AAAT CTT TCAGGC TAT GGC GGG-3’，反义链：5’-AGCTTTTCCAAAAA GCC ATA GCC TGA AAG ATTTtctcttgaa AAAT CTT TCA GGC TAT GGC GGG-3’。siDNA链上游和下游分别加了BglII粘性末端和Hind III粘性末端。按常规方法由奥科公司合成1A6/DRIM^siDNA寡核苷酸序列。将正义链和反义链经退火反应形成5’端BglII粘性末端和3’端HindIII粘性末端的双链DNA。

pSUPER质粒经BamH I和Hind III酶切后，用T4DNA连接酶与以上的双链DNA连接(4℃，12h)，转化DH5α菌株，涂含有50mg/L氨苄青霉素(Amp)的LB培养平板，取单菌落摇菌测序。提取序列正确的菌落中的质粒，得到在BamH I和HindIII识别位点间插入有1A6/DRIM^siDNA的结构正确的质粒pSUPER2-8，即为1A6/DRIM^siRNA表达载体。

2.细胞转染

将质粒pSUPER2-8通过LipofectAMINE²⁰⁰⁰(Invitrogen公司产品)转染胃癌细胞系BGC-823或高转移乳腺癌细胞系MDA-MB231细胞，同时设一阴性对照pSUPER-NC(Invitrogen)，即携带不与任何人的基因配对的无关siDNA的载体质粒转染细胞。转染48，72，96，120和144小时分别提取细胞蛋白，经SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上，用抗1A6/DRIM单克隆抗体6D9进行Western Blotting检测1A6/DRIM的表达，同时以抗β-actin的抗体(中山公司)为一抗检测β-actin，作为上样对照。实验结果显示在转染后48、72、96、120至144小时，1A6/DRIM^siRNA在BGC-823和MDA-MB231细胞中均能抑制1A6/DRIM的表达。转染pSUPER2-8的抑制效果与转染s2-8的相同。

pSUPER2-8或pSUPER-NC转染BGC-82348小时后，分别将500个细胞接种于6mm培养皿，进行克隆形成实验，并用抗1A6/DRIM单克隆抗体6D9进行WesternBlotting检测1A6/DRIM的表达，以抗β-actin的抗体为一抗检测β-actin，作为上样对照。结果表明转染pSUPER2-8的BGC-823克隆形成能力降低，1A6/DRIM的表达量降低，说明内源1A6/DRIM的表达被抑制后BGC-823细胞的生长被抑制。转染pSUPER2-8的抑制效果与转染s2-8的相同。

4、细胞侵袭实验-Matrigel穿膜侵袭实验

取pSUPER2-8或pSUPER-NC转染48小时后的高转移乳腺癌细胞MDA-MB231(ATCC)，消化后进行活细胞计数，用含0.1％血清的DMEM培养液将细胞浓度调整至6×10⁴个/ml。在Matrigel Invasion Chamber(BD公司产品)中加入含3×10⁴个细胞的细胞悬液500μl，在Matrigel Invasion Chamber的下面加入0.75ml的含10％血清的DMEM培养液，37℃，5％CO₂孵育箱中培养24h。吸去上室液体，湿棉签擦去膜表面未侵袭的细胞及Matrigel，生理盐水漂洗，稍干，甲醇固定30min，常规H.E.染色。每组设3个平行样本，计数每张膜的穿膜细胞数。每组实验平行两孔进行，实验重复3次，将实验结果进行统计学分析。同时并用抗1A6/DRIM单克隆抗体6D9对pSUPER2-8或pSUPER-NC转染48小时后的高转移乳腺癌细胞MDA-MB231进行Western Blotting检测1A6/DRIM的表达，以抗β-actin的抗体为一抗检测β-actin，作为上样对照。Western Blotting检测结果表明转染pSUPER2-8的MDA-MB231的1A6/DRIM的表达量降低，β-actin为上样对照。转染pSUPER2-8的抑制效果与转染s2-8的相同。细胞侵袭实验结果表明转染pSUPER2-8的高转移乳腺癌细胞MDA-MB231体外侵袭能力下降，MDA-MB231内源性1A6/DRIM的表达被抑制后，细胞侵袭力下降10倍，说明抑制1A6/DRIM的表达对乳腺癌细胞的转移起到显著抑制作用。

                   序列表

<160>5

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gccatagcct gaaagattt                                                        19

<210>2

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gccauagccu gaaagauuu                                                    19

<210>3

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

aaaucuuuca ggcuauggc                                                  19

<210>4

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gccatagcct gaaagatttt tcaagagaaa atctttcagg ctatggc                   47

<210>5

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gccatagcct gaaagatttt ctcttgaaaa atctttcagg ctatggc                   47