海绵共附生微生物群落总DNA的快速提取方法

摘要

一种海绵共附生微生物群落总DNA的快速提取方法，先将海绵样品切成小块，悬浮于TE缓冲液中放置冰上直接研磨，完成海绵组织的裂解，然后在得到的TE悬浮海绵裂解物中，加入溶菌酶、十二烷基磺酸纳及蛋白酶K处理，离心后加入Tris－饱和酚抽提，然后依次采用Tris－饱和酚、氯仿、异戊醇溶液及氯仿、异戊醇溶液提取，再依次加入NaCl及异丙醇得到DNA沉淀，洗涤后溶解于TE缓冲液，采用RNA酶消解RNA，最后琼脂糖凝胶电泳分析检测提取的DNA样品。本发明可在一般实验室快速、方便地得到大片段的海绵共附生微生物的群落总DNA样品，可满足基于核酸的海绵共附生微生物种群结构与多样性分析的需要。

说明书

技术领域

本发明涉及一种海绵共附生微生物群落总DNA的快速提取方法，具体涉及一种适合海绵共附生微生物种群结构组成与多样性分析的微生物群落总DNA提取方法。属于海洋生物的分子技术领域。

背景技术

海绵是目前发现的海洋活性物质最多的海洋生物之一。海绵体内聚集了大量的共附生微生物，一般可以达到海绵体积的40％以上。海绵共附生微生物被认为是一些海绵活性物质的真正制造者。由于目前依赖于分离培养的微生物研究方法仅能揭示不到1％的微生物信息，99％以上的环境微生物是目前还不能分离得到的，因此依赖于分离培养的研究方法不可能揭示海绵共附生微生物的组成信息。基于核酸的分子技术为我们揭示海绵丰富的共附生微生物组成信息以及从基因水平利用相关海绵功能基因提供了可能。例如：基于16S rDNA的克隆文库及变性梯度凝胶电泳(DGGE)等方法已经成为揭示复杂微生物区系结构的有力工具；基于宏基因组DNA的功能基因筛选、克隆表达途径为利用海绵及其共附生微生物功能基因资源提供了可能。然而，这些都是建立在高质量的基因组总DNA提取技术之上的。因此必须首先建立高效和高质量的DNA提取方法。

对于海绵共附生微生物总DNA提取，一般有两条路线：一是先分离微生物后再进行DNA提取，另外一种是直接对海绵组织进行裂解提取DNA。对于前者，因为许多微生物共生或寄生在海绵细胞内或者细胞间的中质层内，很难使微生物与海绵细胞分离。即使能够分离也非常耗时，需要特殊设备或试剂，易引起不必要的降解。对于后者，目前采用的直接对海绵组织进行裂解提取DNA的方法具有以下不足：一般都需要液氮、特殊缓冲液、复杂的化学试剂或专用试剂盒，不适合一般实验室采用；同时，提取步骤一般非常繁琐；第三，这些方法对于不同海绵样品(往往具有不同的骨针结构)的通用性不太理想。

以微生物区系组成和多样性揭示为目的的核酸样品一定要能体现原位的微生物多样性信息，因此采用的DNA提取方法一定要尽量使所有微生物的DNA都能释放出来，并避免不必要的DNA降解。海绵独特的骨骼结构决定了DNA提取的困难。如何提取到高质量的能够反映原来微生物多样性的DNA样品非常重要，但目前还没有关于海绵共附生微生物群落总DNA提取的简便技术。因此，非常有必要开发一种适合不同海绵样品的快速、不易引起DNA降解的海绵共附生微生物群落DNA提取方法，来满足基于核酸的海绵共附生微生物种群结构与多样性分析的需要。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种适合于不同海绵样品的海绵共附生微生物群落总DNA的快速方便的提取方法，能简便而高效的提取海绵共附生微生物群落总DNA，使DNA充分释放，避免降解，满足多样性分析的需要。

为实现这一目的，本发明基于机械破碎完成海绵组织的裂解。然后经溶菌酶、SDS(十二烷基磺酸纳)及蛋白酶K处理，然后依次采用Tris(三羟甲基氨基甲烷)-饱和酚、氯仿、异戊醇的混合溶液及氯仿、异戊醇混合溶液提取，再加入氯化钠及异丙醇得到DNA沉淀。采用RNA酶消解RNA后用琼脂糖凝胶电泳分析检测提取的DNA样品。

本发明的方法具体包括如下步骤：

1、直接机械研磨裂解海绵组织：将海绵样品在无菌条件下切成小块，加入由三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸钠配制的pH值为8.0-8.2的TE缓冲液，于冰块上直接研磨5-30分钟使海绵组织块破碎裂解变成均匀的悬浮液。

2、细胞破壁与DNA释放：取海绵组织悬浮液，离心弃上清后，加入TE缓冲液悬浮沉淀，振荡混匀后离心弃上清，再加TE缓冲液悬浮沉淀，并加入溶菌酶混匀后于35-40℃水浴处理。再加十二烷基硫酸钠及蛋白酶K混匀后45-50℃水浴处理，离心取上清，加入等体积的Tris-饱和酚充分混匀处理，离心后取上清。

3、海绵共附生微生物群落总DNA提取：在上述上清中加入1-1.5倍体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合液进行处理，Tris-饱和酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1，离心取上清后，再加入1-1.5倍体积的氯仿、异戊醇混合液进行处理，氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；离心取上清后，再加入0.1-0.2倍体积的5M NaCl和1-1.5倍体积的异丙醇沉淀DNA；去除异丙醇后加入70-75％的乙醇洗涤沉淀，离心弃去乙醇，干燥后沉淀中加入TE和不含DNA酶的RNase酶在35-40℃水浴处理消解RNA；最后琼脂糖凝胶电泳分析检测提取的DNA样品。

采用本发明的方法可以在3小时内得到大片段(长度达21kb以上)的海绵共附生微生物的群落总DNA样品。适合作为DGGE(变性梯度凝胶电泳)指纹分析海绵共生微生物种群结构与多样性的16S rDNA-PCR扩增的高质量模板，同时也适合作为基因文库构建的样品DNA。

附图说明

图1为本发明的技术路线流程图。

图2为本发明实施例中四种海绵共附生微生物的总DNA的琼脂糖凝胶图。

图3为本发明实施例中四种海绵共附生细菌的16S rDNA扩增结果。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

实现本发明方法的技术路线如图1所示，首先获得海绵样品，机械研磨裂解、海绵组织并使细胞破壁释放DNA，提取海绵共附生微生物群落总DNA。提取的DNA样品可以用作微生物种群结构组成与多样性分析。

本发明在具体实施时，按以下步骤进行：

1.海绵组织的机械研磨裂解

取海绵样品5克，无菌条件下切成2mm³小块，转移放置在冰浴中的研钵中，加入由10mM的Tris和1mM的EDTA配制的TE缓冲液(pH＝8.0)，直接研磨破碎裂解海绵组织，时间在6-12分钟左右，直到海绵组织块变成均匀的悬浮液。

2.细胞破壁与DNA释放

(1)取300μl海绵组织的悬浮液到1.5ml的离心管中，10,000rpm离心5min，弃上清。

(2)加入1mlTE(pH 8.0)悬浮沉淀，涡悬振荡器上振荡30S后，10,000rpm离心5min，弃上清，并重复该步骤一次。

(3)加640μlTE(pH 8.0)悬浮沉淀，并加入200μl溶菌酶混匀(10mg/ml)，37℃水浴30min。

(4)再加240μl 10％的SDS及20μl 10mg/ml的蛋白酶K混匀，55℃水浴30min。

(5)12,000rpm离心10min，每管取0.5ml的上清入另一无菌1.5ml离心管内，并加入等体积的Tris-饱和酚充分混匀。

3.海绵共附生微生物群落总DNA的提取

(1)13,000rpm离心10min，取上清入另一无菌1.5ml离心管内，用Tris-饱和酚重复抽提一次。

(2)将上清取入另一无菌1.5ml离心管内，加入等体积的Tris-饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀。

(3)13,000rpm离心5min，取上清，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀。

(4)13,000rpm离心5min，取上清，加入0.1倍体积的5M NaCl，再加入1-1.5倍体积的异丙醇，轻轻混匀，在-20℃冰箱放置30min。

(5)14,000rpm离心15min，弃去异丙醇，加入500μl 70％的乙醇洗涤沉淀。

(6)13,000rpm离心10min，弃去乙醇，风干，沉淀加入30μlTE缓冲液，再加入不含DNA酶的RNase酶5μl，37℃水浴10min。

(7)1.0％的琼脂糖凝胶电泳，EB(溴化乙锭)染色检测。

采用本发明的方法对我国南海细薄星芒海绵、皱皮软海绵、贪婪倔海绵和澳大利亚厚皮海绵四种海绵进行了总DNA的提取，获得了高质量的基因组总DNA样品，结果见图2。图2中A、B、C、D分别为细薄星芒海绵、皱皮软海绵、贪婪倔海绵和澳大利亚厚皮海绵，‘M’指λDNA/EcoRI+HindIII ladder，‘阳’指阳性对照(E.coli总DNA)；6和9是研磨时间(分钟)。

通过16S rDNA的PCR扩增来验证以上提取的总DNA质量。将获得的总DNA样品采用TE缓冲液进行系列稀释后直接用于16S rDNA的PCR扩增取得了很好的结果，具体实施方法和结果如下：

以总DNA为模板，采用引物8f(5’-GGA GAG TTT GAT CA/CT GGC T-3’)与798r(5’-CCA GGG TAT CTA ATC CTG TT-3’)扩增海绵细菌DNA的16S rDNA片段。

体系及反应条件如下：9μL 10xPCR缓冲液(50mmol/LTris-HCl(pH8.2)，18mmol/L MgCl₂，500mmol/L KCl，0.1％甘油，1％的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚))，10pmol的引物8f及10pmol的引物798r，2μL10mmol/L(每种碱基浓度)d NTP，1μL纯的基因组DNA及2.5U Super Taq酶，用无菌去离子水补充体积至50μL。

PCR反应程序如下：94℃预变性5min，80℃保持1min，加入Super Taq酶。接着按(94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min)25次循环，72℃延伸2min完成扩增。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色观察。结果见图3。图3中，A细薄星芒海绵、B皱皮软海绵、C贪婪倔海绵、D澳大利亚厚皮海绵。从图3可以看出，16S rDNA条带很纯，扩增特异性很强，没有出现任何杂带污染。说明用直接研磨法提取到的海绵微生物总DNA具有很好的纯度，可用于分子生物学研究。因此本发明用于海绵及其共附生微生物总DNA的提取是可行的。