具有全新空间构象且功效增强的重组干扰素、其制备方法及应用

摘要

本发明提供了一种具有全新空间构象且功效增强、副作用更低可大剂量使用的重组干扰素(rSIFN－co)或其功能等同物。其特征是其体外药效学显示它不仅能抑制乙型肝炎病毒的DNA复制，而且能抑制表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，其细胞学毒性仅为临床现用干扰素的1/8但抗病毒活性却是临床现用干扰素的5－20倍，同时在人体内具有更高更广谱更长时间的生物学应答反应，可明显抑制肿瘤的增生和转移。本发明还提供了此种重组干扰素或其功能等同物的人工基因编码、基因的载体、人工基因编码的表达系统。最后，本发明还提供了本发明重组干扰素或其功能等同物的生产方法及所述干扰素的各种应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域。具体而言，本发明涉及一种具有全新空间构象且功效增强、副作用更低可大剂量使用的重组干扰素或其功能等同物，以及含有所述干扰素或其功能等同物的组合物和药用组合物。本发明还涉及所述重组干扰素或其功能等同物的生产方法，在制备预防及治疗病毒性疾病和治疗肿瘤的药物中的应用。

背景技术

干扰素是由多种细胞产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白。正常情况下组织或血清中不含干扰素，只有在某些特定因素的作用下才能诱使细胞产生干扰素。根据干扰素的产生细胞、受体和活性等综合因素将其分为2种类型：I型和II型。

I型干扰素的主要诱生剂是病毒及人工合成的双链RNA。I型干扰素又称为抗病毒干扰素，其生物活性以抗病毒为主，共有3种形式：IFNα、IFNβ、IFNω。II型干扰素又称为免疫干扰素或IFNγ，主要由T细胞产生，其生物活性是参与免疫调节，是体内重要的免疫调节因子。

干扰素的生物活性有较严格的种属特异性，I型干扰素的抗病毒作用较强，对多种病毒如DNA病毒、RNA病毒均有抑制作用，但这种效应不是直接的，而是通过对宿主细胞的作用引起的。

近年来，世界上的许多公司都在致力于干扰素的研究，也有这方面的许多报道。例如，美国专利4,695,623和4,897,471公开了新型人干扰素多肽，所述干扰素的氨基酸序列含有天然产生的α-干扰素亚型多肽每一位点上发现的共同或占优势的氨基酸，因此所述干扰素被称之为共有干扰素(IFN-con)。公开的氨基酸顺序命名为IFN-con1、IFN-con2、及IFN-con3。也公开了编码IFN-con的工程基因的制备及所述基因在大肠杆菌中的表达。重组IFN-con与或者白细胞干扰素或其它重组I型干扰素比较的体外研究证实，IFN-con表现出显著高的抗病毒、抗增殖及天然杀伤细胞活性。

美国专利5,372,808公开了应用共有人干扰素治疗疾病的方法。与先前已批准上市的α-干扰素如INTRON_A(IFN-α2b，美国先灵宝雅公司产品)相比，所述共有人干扰素产生较低的副作用。美国食品与药品监督管理局(FDA)已于1997年底批准了美国安进公司(Amgen)生产的共有干扰素用于临床丙肝病人的治疗，其商品名为干复津(interferonalfacon-1)。

对乙型肝炎病人的诊断，当检测出表面抗原(HBsAg)阳性和e抗原(HBeAg)阳性者即可判定为乙型肝炎患者。目前临床上已采用各种类型的人α型干扰素对慢性乙型肝炎患者进行治疗，其作用机理是：干扰素与细胞的特异性受体结合而发挥其抗病毒DNA和RNA合成作用，包括对某些酶诱导作用阻止受病毒感染细胞中病毒的复制。但所有的干扰素体外药效学显示均只能抑制病毒DNA和RNA，不能直接抑制HBsAg与HBeAg的分泌。而且由于副作用大而不能大剂量使用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种具有全新空间构象且功效增强、副作用更低可大剂量使用的重组干扰素(下文将之简称为rSIFN-co)或其功能等同物。

本发明另一目的在于提供此种重组干扰素或其功能等同物的人工编码基因。

本发明再一目的在于提供一个含有本发明重组干扰素或其功能等同物的基因的载体。

本发明再一目的在于提供一个含有本发明重组干扰素或其功能等同物的基因的载体的表达系统。所述的表达系统例如可以是适当的宿主细胞。该宿主细胞可以是真核细胞，也可以是原核细胞，例如E.Coli。

本发明再一目的在于提供本发明重组干扰素的生产方法，其中包括将通过密码子偏爱性设计的人工基因序列插入到适当表达载体中，并引入到合适的宿主，在适当的条件下培养表达并分离纯化本发明重组干扰素的步骤。本发明还包括提供通过该方法生产的重组干扰素。

本发明再一目的在于提供一种含有本发明重组干扰素或其功能等同物及适当药用载体的药物组合物。

本发明再一目的在于提供本发明重组干扰素或其功能等同物在制备预防及治疗病毒性疾病和治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明的另一个目的在于提供一种预防及治疗病毒性疾病和治疗肿瘤的方法。

本发明的再一个目的在于提供一种高效力或低副作用的干扰素，其是通过改变该干扰素的空间构象而得到的。

为实现上述目的，本发明具体包括如下几个方面：

在本发明的第一方面，提供了一种重组干扰素或其功能等同物，其中所述干扰素具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，并且其具有与干复津不同的空间构象，所述干复津同样具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。

在本文中使用的术语“功能等同物”是指一种基于序列表中序列2所示的氨基酸，根据给定表达系统的优化密码子重新设计的DNA所编码的蛋白质或肽，并且在功能上与本发明重组干扰素相似的分子。所述给定表达系统包括但不限于E.Coli表达系统、酵母表达系统、CHO表达系统。它可以是一种缺失体，替代物或是由原序列突变而成的衍生物。另外，本发明也试图涵盖本发明重组干扰素的模拟分子。模拟分子可以是一种肽、多肽或小分子化合物。

本发明重组干扰素(rSIFN-co)是通过基因重组技术制得的，其氨基酸序列的DNA编码序列是根据大肠杆菌(E.Coli)密码子偏爱性对野生型序列进行调整并人工合成cDNA而得的。

本重组干扰素被认为具有独特的空间三维结构。在一个具体的实施方案中，本发明的重组干扰素在190-250nm范围内的圆二色谱显著不同于在同样条件下测得的干复津的圆二色谱。在250-320nm范围内的圆二色谱与文献所报道的干复津的圆二色谱也显著不同。请参见附图6。

此外，本发明的重组干扰素在肌肉注射给体重指数为20-27范围内的人体后，以采血时间对受试人体血清中的2-5A寡聚核苷酸酶浓度作图，所得曲线下的峰面积显著大于在同一条件下注射干复津所获得的曲线下的峰面积。所述曲线一般表现为双峰，虽然该双峰的形态、高度、双峰之间的峰距可能因人的不同而有所差异。有时，所述双峰之间的峰距和两峰的高度差异并不特别显著，甚至其形态接近于梯形峰，但是，在肌肉注射给体重指数为20-27范围内的人体后，以采血时间对受试人体血清中的2-5A寡聚核苷酸酶浓度作图，所得曲线下的峰面积显著大于在同一条件下注射干复津所获得的曲线下的峰面积。此外，本发明的干扰素在注射给人体后其在人体内的半衰期比干复津在人体内的半衰期更长。

已进行的实验的结果还证实，本发明的重组干扰素具有比目前投入临床使用的其它任何干扰素(包括，干复津)更强的效力。所述的效力包括针对病毒，也包括针对肿瘤的。

预期本发明的重组干扰素对多数的病毒均有效。所述病毒包括，但不限于，乙肝病毒、丙肝病毒、野生型HIV或其耐药株、天花病毒、SARS病毒、埃博拉病毒、EB病毒、细胞黑色素病毒、单纯性疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、其它疱疹病毒、巨细胞病毒、乳头瘤病毒、痘病毒、细小核糖核酸病毒、鼻病毒、腺病毒、RNA病毒、I型人T细胞白血病病毒、II型人T细胞白血病病毒或III型人T细胞白血病病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、轮状病毒、禽流感病毒及其感染人的变异株、流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、人合胞体病毒-1、人合胞体病毒-2、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、登革热、黄热病、布塔托罗病毒。其中，本发明的重组干扰素对于乙肝病毒、丙肝病毒、野生型HIV或其耐药株、天花病毒、SARS病毒、埃博拉病毒、单纯性疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、流感病毒、禽流感病毒及其感染人的变异株的效力很显著。例如，对于乙型肝炎病毒而言，本发明的重组干扰素不仅能抑制乙型肝炎病毒的DNA复制而且还能抑制乙肝病毒表面抗原和e抗原的分泌，抑制乙肝病毒核心抗原DNA复制的效力与干复津相比提高约一倍。

预期本发明的重组干扰素对多数的肿瘤均有效。所述肿瘤包括，但不限于，皮肤癌、基底细胞癌及恶性黑素瘤、肾细胞癌、肝癌、甲状腺癌、鼻咽癌、固状肿瘤、前列腺癌、胃癌、食道癌、直肠癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、浅表膀胱癌、血管瘤、表皮样癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤、血癌、急性血癌、慢性血癌、毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴腺瘤、多发性骨髓瘤、卡波基肉瘤、红血球过多病。其中，实验已经证实，本发明的重组干扰素对于恶性黑素瘤、肾细胞癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病等肿瘤表现出显著的效力。

此外，无论是用于预防或治疗病毒性疾病还是用于治疗肿瘤，已证实本发明的重组干扰素与其它任何干扰素(含干复津)相比具有更高的抗病毒活性和更低的副作用。例如，本发明的重组干扰素不但具有强于临床现用干扰素20倍的抗病毒活性，以及明显强于重组人α型干扰素的抗肿瘤增生作用；其还极大地降低了毒副作用并可安全的大剂量使用(每剂用量可＞1000万IU)，使需要大剂量用药干扰素的部分病毒性疾病或肿瘤的成功治疗成为可能。

本发明重组干扰素的体外药效学显示它不仅能抑制乙型肝炎病毒的DNA复制，而且能抑制表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，其细胞学毒性仅为临床现用干扰素的1/8但抗病毒活性却是临床现用干扰素的5-20倍，同时在人体内具有更高更广谱更长时间的生物学应答反应，可明显抑制肿瘤的增生和转移。并且由于极大的降低了毒副作用，使需要大剂量用药的部分病毒性疾病或肿瘤的成功治疗成为可能。

在本发明的第二方面，提供了一种DNA序列，其包括编码序列表中序列2所示氨基酸序列的核苷酸序列，该核苷酸序列是根据大肠杆菌密码子偏爱性对野生型序列进行调整并人工合成cDNA而得的。为是该核苷酸序列得到表达，可以将其置于适当的启动子控制之下。优选所述的启动子包括，但不限于PBAD启动子。设计人工基因是一种公知的方法。在此之前，对于合成核苷酸序列及其它分子生物学技术已经有多种方法的描述。如：Joseph Sambrook and David W.Russell，Molecular Cloning(分子克隆)：A laboratory Manual，December 2000，publ ished by Cold Spring HarborLaboratory Press.对密码子偏爱性的详细探论可在美国专利第4695623中的第6栏，第41行-第7栏第35行中读到。因此，根据确定的氨基酸序列，利用大肠杆菌密码子偏爱性重新设计rSIFN-co的cDNA编码序列并人工合成。序列表中的序列1和序列3就是根据大肠杆菌密码子偏爱性而设计并人工合成的这种核苷酸序列的具体例子。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，其含有上述本发明的DNA序列。优选该载体为一种表达载体，更优选为一种能在E.Coli中表达目标肽或蛋白的表达载体。

一个具体的实例为图5中示出的质粒pHY-5。该质粒pHY-5是使用基因重组技术将rSIFN-co的cDNA序列克隆入大肠杆菌的高效表达载体pBAD18中而得的。质粒pHY-5是通过L-阿拉伯糖诱导/活化表达调控机制，激活载体中的强P_BAD启动子，导致下游的rS1FN-co基因高效表达。

这一阿拉伯糖诱导/活化表达调控系统比通常遗传工程生产中所采用的温控、pH调控、IPTG诱导等系统有明显的优点：(1)通常采用的几种调控系统都是以“去阻遇”的形式解除对功能启动子的抑制作用，从而启动子可介导下游基因的表达。改变温度、pH值本身以及加入IPTG诱导物等都对启动子无直接激活作用。在我们采用的系统中，阿拉伯糖与阻遏蛋白(AraC)结合后，不仅解除了对P_BAD启动子的抑制作用，同时“阿拉伯糖-AraC复合物”又可直接激活P_BAD启动子介导下游基因的表达。所以阿拉伯糖诱导/活化调控系统是一种比其它几种系统更有效的大肠杆菌高效表达系统；(2)P_BAD启动子活化的程度与加入的L-阿拉伯糖剂量成线性关系。这样可以直接通过改变阿拉伯糖浓度而调节外源基因产物的表达量。这一特性对改变包涵体的形成等非常有意义。加入阿拉伯糖比改变温度/pH等更容易直接控制外源基因产物在大肠杆菌中的表达；(3)L-阿拉伯糖来源丰富，价廉、无毒性，这克服其它诱导物如IPTG在这方面的缺点。(Guzman，L.M et al：Tight regulation，modulation，and high-level express-ion by vectors containingthe arabinose P_BAD promoter.J.Bacteriol.1995，177：4121～4130.)。

虽然在本文中详细讨论的启动子是P_BAD，正如本领域的一般技术人员所知的其它可诱导启动子如：热休克启动子，也可能被用于本发明。

在本发明的第四方面，提供了一种含有上述本发明载体的宿主细胞。该宿主细胞例如为E.Coli。

在发明的第五方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明的重组干扰素或其功能等同物以及任何可药用的载体。在本文中使用的术语“可药用的载体”是指任何标准的药用载体。例如公知的适当的载体包括但不仅限于磷酸盐缓冲液及各种润湿剂。其它载体可能包括用于片剂、颗粒剂及胶囊等的添加剂。典型的载体常含有如：淀粉、乳液、糖、某种类型的粘土、明胶、硬脂酸及其盐类如：硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物油脂、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。这些载体中的成分可用公知的传统方法调制。

相应地，本发明的药物组合物可以被制成各种剂型。例如，可将本发明重组干扰素制备成常见的制剂形式，诸如：注射剂、喷雾剂、冻干剂、缓释剂、长效制剂、片剂、胶囊、口服液、贴剂、栓剂、溶液制剂，推荐的剂型为注射剂、喷雾剂、冻干剂，给药方式可皮下、肌肉或静脉注射，或喷雾给药如鼻腔喷雾或用呼吸机给药。

在本发明的第六方面，提供了一种治疗疾病的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用有效量的本发明重组干扰素或其功能等同物。所述干扰素可以通过喷雾设备给予，例如通过图15所示的用于鼻腔给药的喷雾器给药，也可以通过呼吸机给药或通过通过粘膜给予。其它推荐的给药方式包括注射方式，例如通过静脉注射、肌肉内注射或皮下注射给药。

本文中使用的术语“有效量”是指在本发明的重组干扰素本身或含有该重组干扰素的药物组合物施用给被治疗的个体后，该个体产生症状的减轻、缓解或好转所需要的最小的干扰素量。该有效量可能因被治疗患者的年龄、体重、疾病的种类、疾病的严重程度、患病时间的长短、体质状况等因素而有所不同。临床医生或药剂师可以结合本文公开的内容并根据实际的情况合理确定该有效量的范围。例如，对于以注射方式对成人给药而言，如果用于治疗病毒性疾病，该有效剂量一般为每次注射5μg-30μg，优选9μg-15μg，一周3次，24周一个疗程；如果用于治疗肿瘤，该有效剂量一般为每次注射9μg-50μg，优选9μg-30μg，一周3次，24周一个疗程。

在本发明的治疗方法中，所述的干扰素或其功能等同物还可与其它抗肿瘤药物或抗病毒药物联合使用。也可以与其它各种治疗疾病的方法联合使用。

在本发明的第七方面，提供了一种生产本发明重组干扰素或其功能等同物的方法，包括下列步骤：

(a)将编码序列表中序列2所示氨基酸序列的核苷酸序列引入适当的表达载体中并使所述的核苷酸序列置于适当启动子的控制之下；

(b)将步骤(a)构建的载体引入宿主，并在适当的表达条件下进行表达，得到包涵体；

(c)收集并纯化步骤(b)得到的包涵体；

(d)对步骤(c)获得的包涵体进行变性和复性；以及

(e)对复性后的产物依次进行透析和离子层析。

在本发明制备重组干扰素的方法中，优选所述的离子层析步骤依次包括HS阳离子层析和铜离子层析。

如上文所述，在步骤(a)中使用的核苷酸序列是根据大肠杆菌密码子偏爱性对野生型序列进行调整并人工合成cDNA而得的，优选该序列是序列表中序列3所示的核苷酸序列。所述适当的启动子包括但不限于P_BAD。作为一个实例，本发明构建的一个表达载体是pHY-5，该载体的宿主是大肠杆菌，其表达诱导剂是阿拉伯糖。通过对该菌株在适宜的条件下的培养发酵，收获菌体，超声波破菌并反复洗涤得包涵体，通过包涵体的变性、复性及分离纯化工艺，获得了大量高纯度的与所有已知干扰素相比具有独特空间构象且功效增强、副作用更低可大剂量使用的rSIFN-co用于本发明的研究和临床治疗。

根据需要，在所述离子层析步骤之后，还可进一步包括将已纯化的干扰素冻干的步骤。

在本发明的第八方面，提供了本发明的重组干扰素或其功能等同物在制备用于预防及治疗病毒性疾病和治疗肿瘤的药物中的应用。具体而言，包括在制备治疗乙型肝炎、肿瘤、严重急性呼吸道综合症(SARS)或由病毒感染引起的上呼吸道疾病、流感病毒引起的疾病、埃博拉(Ebola)病毒引起的疾病、艾滋病和治疗其他目标个体病毒性疾病的药物中的应用。所述的其他目标个体病毒性疾病包括：甲型肝炎、丙型肝炎、其它类型的肝炎。

预期本发明的重组干扰素还可以制备用于预防及治疗下列病毒引起的疾病的药物：EB病毒、细胞黑色素病毒、单纯性疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、其它疱疹病毒、巨细胞病毒、乳头瘤病毒、痘病毒、细小核糖核酸病毒、鼻病毒、腺病毒、RNA病毒、I型人T细胞白血病病毒、II型人T细胞白血病病毒或III型人T细胞白血病病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、轮状病毒、副流感病毒、麻疹病毒、人合胞体病毒-1、人合胞体病毒-2、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、登革热、黄热病、布塔托罗病毒。

本发明提供的上述应用中所针对的肿瘤包括：

  皮肤癌  基底细胞癌  恶性黑色素瘤  肾细胞癌  肝癌

  恶性肿瘤  甲状腺癌  鼻咽癌  实体瘤  前列腺癌  胃癌  食道癌  结直肠癌  胰腺癌  乳腺癌  卵巢癌、浅表性膀胱癌  血管瘤  鳞状细胞癌  宫颈癌  非小细胞肺癌  小细胞肺癌  神经胶质瘤  恶性血液病  白血病  急性白血病  慢性白血病  慢性粒细胞白血病  多毛细胞白血病  淋巴瘤  多发性骨髓瘤  真性红细胞增多症  其他  卡波济氏肉瘤

通过以下例子将有助于更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员应该知道，下文讨论的具体方法和结果仅仅是对本发明的例证，本发明的保护范围由权利要求书确定，而不受具体实例的限制。

附图说明

图1是根据rSIFN-co的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性设计的rSIFN-co编码cDNA序列及其推导的氨基酸序列。

图2是本发明rSIFN-co的另一种编码cDNA序列。

图3是pLac T7克隆载体质粒图。

图4是pBAD18表达载体质粒图。

图5是表达质粒pHY-5的构建程序图。

图6-A是干复津(interferon alfacon-1)的波长范围为250nm-190nm的圆二色谱图。

图6-B是参考文献“Journal of Interferon and Cytokine Research.16：489-499(1996)”记载的干复津(interferon alfacon-1)的圆二色谱图。

图6-C是本发明rSIFN-co的波长范围为320nm-250nm的圆二色谱图。

图6-D是本发明rSIFN-co的波长范围为250nm-190nm的圆二色谱图。

图7显示的是本发明rSIFN-co晶体I。

图8显示的是本发明rSIFN-co晶体II。

图9显示的是本发明rSIFN-co晶体I的X-射线衍射图谱。

图10显示的是不同干扰素对乙肝病毒基因表达及核心抗原基因抑制的比较。

图11是注射本发明rSIFN-co与干复津(interferon alfacon-1)不同采血时间比较寡聚核苷酸酶浓度(2-5A浓度)所作的曲线图。

图12A是显示给药本发明rSIFN-co后，受试者体温变化曲线。实验A分为两组，A1组(结果显示在图12A1)和A2组(结果显示在图12A2)。该图的结果显示在A1组和A2组之间的结果没有显著性差异。

图12B是显示给药干复津后，受试者体温变化曲线。实验B也分为两组，B1组(结果显示在图12B1)和B2组(结果显示在图12B2)。该图的结果显示在B1组和B2组之间的结果没有显著性差异。但是，将图12A和图12B显示的结果进行比较，实验A和实验B的结果之间差异显著，实验A组比实验B组的体温低约0.5摄氏度。

图13显示的是本发明rSIFN-co对流感病毒传染性抑制实验的结果。

图14-A显示的是本发明rSIFN-co对野生性HIV传染性抑制实验的结果。

图14-B显示的是本发明rSIFN-co对变异耐药性HIV传染性抑制实验结果。

图15显示的是一种用于鼻腔给药本发明rSIFN-co喷雾剂的设备以及该喷雾剂设备使用说明。

图16A-图16H显示的是下文给出的例十五中将详细描述的患者1的诊断报告书。该图显示了本发明干扰素结合手术和化疗手段对癌症患者的显著疗效。

具体实施方式

例一：

根据已发表的干复津(interferon alfacon-1)编码DNA序列及推断的氨基酸序列资料(Klein ML，Bartley TD，Lai PH，et al.，Structural characterizationof recombinant consensus interferon-alpha.Journal of Chromatography，1988；454：205-215)，见图1，我们利用大肠杆菌优先表达密码子(The Wisconsin Package，byGenetics Computer Group，Inc.Copyright 1992，Medison，Wisconsin，USA)，在保证氨基酸序列不变的情况下，对其DNA编码序列进行了分子设计，然后人工合成其rSIFN-co全长cDNA编码基因。

为了获得大量高纯度的rSIFN-co蛋白用于研究和临床治疗，我们采用重组DNA技术将rSIFN-co全长cDNA序列克隆到大肠杆菌高效表达载体中去，然后利用L-阿拉伯糖诱导/活化表达调控机制激活载体中的强PBAD启动子介导下游的rSIFN-co基因高效表达。

大肠杆菌cDNA序列的合成

rSIFN-co cDNA序列的重新设计

为了在大肠杆菌中得到高效表达，根据已发表的干复津的氨基酸序列采用大肠杆菌优先密码子对全长rSIFN-co核苷酸编码序列进行分子设计，由新设计的rSIFN-co cDNA序列推断其编码氨基酸序列与干复津氨基酸序列完全-致，见图1。

合成rSIFN-co cDNA序列

rSIFN-co cDNA 5′-端和3′-端半分子的合成

用PCR方法直接合成rSIFN-co cDNA 5′-端280bp(I片段)和3′-端268bp(II片段)两个cDNA半分子。片段I的3′-端与片段II的5′-端有41bp的核苷酸序列重叠互补。

化学合成如下寡聚脱氧核苷酸片段

Oligomer A：

5’ATGTGCGACCTGCCGCAGACCCACTCCCTGGGTAACCGTCGTGCTCTGATCCTGCTGGCTCA

GATGCGTCGTATCTCCCCGTTCTCCTGCCTGAAAGACCGTCACGAC3’

Oligomer B：

5’CTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAGAGGTTCGACGGTAACCAGTTCCAGAA

AGCTCAGGCTATCTCCGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGACCTTC3’

Oligomer C：

5’GCTGCTGGTACAGTTCGGTGTAGAATTTTTCCAGCAGGGATTCGTCCCAAGCAGCGGAGGAG

TCTTTGGTGGAGAACAGGTTGAAGGTCTGCTGGATCATTTC3’

Oligomer D：

5’ATCCCTGCTGGAAAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCTTGCG

TTATCCAGGAAGTTGGTGTTGAAGAAACCCCGCTGATGAAC3’

Oligomer E：

5’GAAGAAACCCCGCTGATGAACGTTGACTCCATCCTGGCTGTTAAAAAATACTTCCAGCGTAT

CACCCTGTACCTGACCGAAAAAAAATACTCCCCGTGCGCTTGGG3’

Oligomer F：

5’TTATTCTTTACGACGCAGACGTTCCTGCAGGTTGGTGGACAGGGAGAAGGAACGCATGATTT

CAGCACGAACAACTTCCCAAGCGCACGGGGAGTATTTTTTTTCGGTCAGG3’

(2)PCR反应

PCR反应I合成rSIFN-co 5′-端半分子：用寡聚脱氧核苷酸片段B作为模板，A和C两个寡聚脱氧核苷酸片段作为引物，进行PCR反应合成长度为280bp的rSIFN-co 5′-端半分子产物。

PCRI反应混合物：        (单位：μl)

  无核酸酶消毒蒸馏水                           39  10×Pfu反应缓冲液(美国Stratagen公司生产)     5  dNTP混合物(每-dNTP浓度为2.5mmol/L)           2  A片段引物(25μmol/L)                         1

  C片段引物(25μmol/L)                         1  B片段模板(1μmol/L)                          1  Pfu DNA聚合酶(美国Stratagen公司生产)(25U/μl)1

                                  (总体积 50μl)

PCR I反应周期：

95℃ 2′→(95℃ 45″→65℃ 1′→72℃ 1′)×25周期→72℃ 10′→4℃

PCR反应II合成rSIFN-co 3′-端半分子：用寡聚脱氧核苷酸片段E作为模板，D和F两个寡聚脱氧核苷酸片段作为引物，进行PCR反应合成长度为268bp的rSIFN-co 3′-端半分子产物。

PCRII反应混合物：                  (单位：μl)

  无核酸酶消毒蒸馏水                           39  10×Pfu反应缓冲液(美国Stratagen公司生产)     5  dNTP混合物(每-dNTP浓度为2.5mmol/L)2  D片段引物(25μmol/L)                         1  E片段引物(25μmol/L)                         1  F片段模板(1μmol/L)                          1  Pfu DNA聚合酶(美国Stratagen公司生产)(25U/μl)1

                                (总体积 50μl)

PCRII反应条件和周期同PCRI

rSIFN-co全长cDNA分子的组装

采用“重叠-延伸PCR”方法将上述PCR合成的I和II片段组装在一起从而得到完整的rSIFN-co cDNA全长分子序列。并且在其5′-端和3′-端分别引入NdeI和PstI限制性酶切位点，以便于将rSIFN-co cDNA序列克隆到质粒载体中去。

(1)化学合成引物

Oligomer G：5’ATCGGCCATATGTGCGACCTGCCGCAGACCC3’

Oligomer H：5’ACTGCCAGGCTGCAGTTATTCTTTACGACGCAGACGTTCC3’

(2)“重叠-延伸PCR”反应

PCR反应混合物：               单位(μl)

                                               38  无核酸酶消毒蒸馏水  10×Pfu反应缓冲液(美国Stratagen公司生产)     5  dNTP混合物(每一dNTP浓度为2.5mmol/L)          2  引物G(25μmol/L)                             1  引物H(25μmol/L)                             1 ^*片段I PCR产物(1μmol/L)                     1 ^*片段IIPCR产物(1μmol/L)                     1  Pfu DNA聚合酶(美国Stratagen公司生产)(25U/μl)1

                                (总体积 50μl)

注：用美国Stratagen公司生产的StrataPrep PCR纯化试剂盒将PCR产物先进行分离纯化，然后溶于消毒蒸馏水中。

PCR反应条件及周期同前述PCRI。

rSIFN-co基因的克隆及序列分析

选用pLac T7质粒作为rSIFN-co cDNA基因克隆的载体。pLac T7质粒是经pBluescript IIKS(+)质粒(美国Stratagen公司生产)改造而成，其质粒图谱见图3。

用StrataPrep PCR纯化试剂盒(美国Stratagen公司生产)将含rSIFN-c0全长cDNA PCR产物进行纯化，然后用NdeI和PstI进行酶切；同时将pLac T7质粒进行NdeI和PstI双重酶切。将这二种酶切DNA片段在1％琼脂糖胶上进行电泳分离，然后用美国Promoga公司的Winzard DNA纯化试剂盒从胶中回收，纯化507bp长的rSIFN-co DNA片段和2.9kb的质粒酶切DNA片段。将二者经T4DNA连接酶催化连接成重组质粒。将连接反应混合物转化DH5α感受态细胞(美国Gibco公司生产)。经37℃过夜培养后，挑选阳性重组菌落，命名为pHY-1。

按DNA序列分析试剂盒(SequiThermTM Cycle Sequencing Kit，购自美国Epicentre Technologi es公司)说明书进行DNA序列测定反应，其中引物为通用T7和T3引物，DNA测序结果显示其与理论设计相符。

纯化的重组rSIFN-co蛋白进行N-末端16个氨基酸序列测定，测定结果与图1N-末端氨基酸理论序列结果一致。其结果为：N端Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-其N-末端的甲硫氨酸(Met)在成熟蛋白中被切除。

表达载体的构建、转化、酶切鉴定及其遗传稳定性

表达载体的构建、转化

将大肠杆菌表达载体pBAD18质粒，见图4，先经Nde I酶解，使质粒线性化(Linearized)，然后用Xba I进行充分酶解。经1％琼脂糖凝胶电泳，再用德国QIAGEN公司生产的QIAEXII试剂盒纯化，得到pBAD18经NdeI和XbaI消化的4.8kb片段。

与此同时将pHY-1质粒进行Nde I和Xba I双酶切，同样经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，纯化出715bp大小的序列片段。将上述4.8kb的pBAD18片段与715bp的rSIFN-co和pBAD18酶切片段在T4DNA连接酶催化下连接成重组质粒，其构建过程见图5。将连接反应物转化DH5α感受态细胞，然后将转化细胞涂于LB-Amp琼脂平板，置37℃培养过夜。

阳性克隆菌株的筛选

随机从上述LB平板中挑起单个细菌菌落，用核酸内切酶酶解，PCR分析的方法筛选含rSIFN-co全长编码序列的重组质粒菌株。将其中一个PCR阳性重组质粒命名为pHY-5。将含有pHY-5质粒的菌株命名为PVIII，扩增后加入甘油冻存液冻存于-80℃备用。

rSIFN-co基因在E.coli中的高效表达

在pHY-5质粒中，rSIFN-co基因处于强启动子P_BAD的调控之中，而P_BAD又受Ara C蛋白的调控。Ara C是由位于同一质粒中的ara C基因编码的蛋白质。在没有阿拉伯糖存在的情况下，Ara C二聚体与O₂及I₂结合形成一个210bp的环。这一结构导致转录的完全抑制。当加入阿拉伯糖时，Ara C二聚体与O₂脱离，并转而与I₁和I₂结合，解除对转录的抑制。阿拉伯糖结合失活、抑制、及激活P_BAD启动子的转录，从而刺激P_BAD介导高水平的rSIFN-co表达。rSIFN-co表达量可达菌体总蛋白的50％。

例二

重组干扰素(rSIFN-co)的分离纯化

工程菌的发酵

将工程菌种接种在LB培养基中，37℃，摇瓶振荡(200rpm)培养过夜(约18小时)，细菌培养液中加入50％浓度为30％的甘油混匀分装成1ml每支，-20℃保存，作为生产菌种。

生产菌种按1％的比例接入LB培养基(1L中含有蛋白胨10g，酵母膏5 g，氯化钠10g)，37℃，200rpm培养过夜，作为I级种子菌。I级种子菌再按10％的比例加入RM培养基(1L中含有酪蛋白20g，氯化镁1mmol/L(0.203g)，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾3g，氯化钠0.5g，氯化胺1g)中，37℃，pH 7.0，发酵至OD₆₀₀值2.0左右加入阿拉伯糖(20％)至终浓度0.02％诱导，4小时后收菌，离心。菌体沉淀用适量缓冲液A(100mmol/L Tri s盐酸pH7.5-10mmol/L EDTA-100mmol/L氯化钠)重混悬，置-20℃冷冻过夜，取出融化后，匀浆机破菌，离心，再用缓冲液B(50mmol/L Tris盐酸pH 7.5-1mol/L尿素-10mmol/L EDTA-0.5％Triton X-100)、缓冲液C(50mmol/LTris盐酸pH 7.5-2mol/L尿素-10mmol/L EDTA-0.5％Triton X-100)分别洗涤沉淀两次，再用蒸馏水洗涤一次，得到包涵体。

变性及复性

用6mol/L盐酸胍(或尿素)溶解包涵体得到稍浑浊的变性液，10000rpm高速离心，取上清测定变性液的蛋白浓度。按终蛋白浓度0.3mg/ml，分三次将变性液加入已配制好的复性液(0.5mol/L精氨酸-150mmol/L Tris盐酸pH 7.5-0.2mmol/L EDTA)中，并在4℃连续搅拌过夜(约18小时)。然后，依次用10倍体积的10mol/L、5mol/L的PB缓冲液及蒸馏水透析。透析完毕，用2mol/L的醋酸-醋酸钠(pH 5.0)调pH，静置，过滤。

纯化

HS阳离子层析：

首先，柱体先用20mmol/L的醋酸-醋酸钠(pH 5.0)平衡，以30ml/min的速度上样，用20个柱体积的20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH 5.0)，洗脱杂蛋白。接着，用5个柱体积含0.15mol/L氯化钠的20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH 5.0)，洗脱杂蛋白。然后，再用3个柱体积含0.18mol/L氯化钠的20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH 5.0)，洗脱杂蛋白。最后，用含0.25mol/L氯化钠的20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH 5.0)解离目标蛋白。

铜离子亲和层析(chelating sepharose^TM fast flow)：

将HS解离蛋白液加入0.2mol/L、pH 6.6的PB缓冲液及4mol/L的氯化钠调到含1mol/L氯化钠，pH 6.0后，备上样。柱体用含1mol/L氯化钠的50mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.5)平衡，以1ml/min的速度上样。接着，用50mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)，洗脱杂蛋白；再用50mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.0)，洗脱杂蛋白；然后，再用50mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH 3.6)，解离目标蛋白。

样品浓缩：将螯合柱解离目标蛋白液稀释30倍，并调pH 5.0上HS，以含0.5mol/L氯化钠的PB缓冲液(pH 7.0)解离，收集即得本发明重组干扰素原液。其物化参数如下表所列。

在某些情况下，如果要求样品纯度更高可通过分子筛(sephacryl S-100)进一步纯化。

所得蛋白质原液的一些物化参数

  测试项目  方法  结果  蛋白质相对含量测定  Lowry法  99.43％  蛋白质纯度测定  非还原SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-  聚丙烯相酰胺凝胶电泳)HPLC分析  99.9％  分子量测定  还原型SDS-PAGE电泳  18.59-18.83  (Kda)  外源DNA残留测定  用DNA标记及检测试剂盒  低于10ng/剂量  抗生素残留测定  按″生物制品化学及其他检定方法″进行  无抗生素残留  细菌内毒素测定  按″生物制品细菌内毒素试验规程″进行  等电点测定  等电聚焦电泳  在5.5-6.5范围内  空间构象  圆二色谱法  见附图6-A～6-D

注：

“生物制品化学及其他检定方法”、“生物制品热原质试验规程”、“生物制品细菌内毒素试验规程”皆可在《中国生物制品规程》，潘正安、张兴辉、段志兵等；中国生物制品标准化委员会；化学工业出版社；2000年版中找到。

例三

本发明重组干扰素(rSIFN-co)与干复津(interferon alfacon-1)的空间构象差别

利用圆二色谱法比较本发明重组干扰素(rSIFN-co)与干复津(interferonalfacon-1)的空间构象差别。

采用圆二色谱仪J-500C，设定测定灵敏度为2m°/cm，光程为0.20cm，测定干复津样品在波长范围为190nm-250nm内的圆二色谱；所述干复津样品含30μg/ml干复津，5.9mg/ml NaCl，3.8mg/ml Na₂PO₄，pH 7.0。其结果如图6A所示。

采用圆二色谱仪J-500C，设定测定灵敏度为2m°/cm，光程为2cm，测定本发明重组干扰素(rSIFN-co)样品在波长范围为250nm-320nm内的圆二色谱；所述干扰素样品含0.5mg/ml rSIFN-co，5.9mg/ml NaCl，3.8mg/mlNa₂PO₄，pH 7.0。其结果如图6C所示。

采用圆二色谱仪J-500C，设定测定灵敏度为2m°/cm，光程为0.20cm，测定本发明重组干扰素(rSIFN-co)样品在波长范围为190nm-250nm内的圆二色谱；所述干扰素样品含30μg/ml rSIFN-co，5.9mg/ml NaCl，3.8mg/mlNa₂PO₄，pH 7.0。其结果如图6D所示。

比较图A-图D，可以看出，本发明重组干扰素(rSIFN-co)与干复津(interferon alfacon-1)具有不同空间三维结构。

例四

重组干扰素(rSIFN-co)晶体生长及晶体学参数测定

本发明重组干扰素(rSIFN-co)的晶体研究。经过系统的摸索与实验，目前已获得两种晶体，见附图7，附图8。

1、晶体生长

rSIFN-co蛋白用纯水溶解至终浓度3mg/ml。最初的结晶条件搜索使用Hampton公司的Hampton Research Crystal Screen I and II。采用气象悬滴扩散法，池液500μl，液滴1μl蛋白+1μl池液，温度为293K。最初搜索得到两种不同类型的小晶体，通过优化后的晶体条件列于下表。

                 rSIFN-co蛋白结晶条件

  条件  I  II  缓冲剂  0.1M Tris-Hel  PH＝8.75  0.1M HEPES  PH＝7.13  沉淀剂  17.5％(w/v)PEG550 MME  10％(w/v)PEG6K  添加剂  0.1M Nacl  3％(w/v)MPD  温度  293K  293K  晶体大小(mm)  0.2×0.2×0.1  0.6×0.02×0.02  晶体照片  图7  图8

2、数据采集及处理

晶体I已用于X-射线衍射数据收集和初步晶体学分析，并完成晶体学参数测定。衍射数据收集在常温进行，将晶体I(条件I)封入薄壁石英管中。使用BrukerAXS Smart CCD探测器，光源采用Nonius FR591旋转阳极靶X光发生器产生的CuKα射线(λ＝1.5418_)。光源功率2千瓦(40kv×50mA)，波长1.00_，曝光时间60秒，Δφ＝2°，晶体到探测器之间的距离为50mm。数据处理使用Bruker公司的Proteum程序包。晶体的衍射图谱(局部)见附图9。处理结果见下表。

                   晶体学参数测定结果

      晶胞参数

                 a(_)             82.67

                 b(_)             108.04

                 c(_)             135.01

                 α(_)            90.00

                 β(_)            90.00

                 γ(_)            98.35

      空间群                       P2或P2₁

      分辨率                       5_

      不对称单位分子数             10

          溶剂含量                 57.6％

另外，按照已发表的十几种其它干扰素蛋白的结晶条件，也尝试了将rSIFN-co进行结晶，但均未有晶体长出。而与rSIFN-co最为相近的(一级结构87％同源)huIFN-α2b的结晶条件非常复杂，经过三次接种晶体长到0.5×0.5×0.3mm时分辨率为2.9_，空间群也为P21，晶胞也很大，一个不对称单位有6个分子，溶剂含量约60％。

例五

本发明重组干扰素(rSIFN-co)抑制HBV-DNA的复制及HBsAg和HbeAg

1.试验材料

1.1受试药：本发明重组干扰素(rSIFN-co)，冻干制剂，蛋白含量9μg/支，由四川省生物工程研究中心提供。于4℃冰箱保存。

溶剂及配制方法：受试药物配制时向每支原料瓶内加入0.5ml细胞培养液，溶解后，再根据所设不同剂量组浓度差异用MEM培养液调配。现用现配。

1.2阳性对照药：安进公司生产的干复津(interferon alfacon-1)，9μg/支；先灵保雅公司生产的干扰能(IFN-α2b)，30μg/支。

1.3 2.2.15细胞：乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(Hep G2)的2.2.15细胞系，美国Mount Sinai医学中心构建。

1.4试剂：Eagles MEM干粉、G-418(Geneticin)、酵母t-RNA、蛋白酶K，美国GIBCO公司产品；胎牛血清，美国Hyclone Lab公司产品；L-谷氨酰胺，京科化学试剂公司进口分装；HBsAg，HBeAg固相放射免疫测定盒，购自中国同位素公司北方免疫试剂研究所；卡那霉素，华北制药厂产品；聚乙二醇，瑞典Fluka产品；d-³²P-dTCP，北京亚辉生物医学工程公司产品；二氧化碳孵箱，美国Shel-Lab产品；γ-计数仪，德国BECKMAN产品；扫描仪：MICROTEK产品；gel-pro analyzer软件：MEDIA Cybemetice_产品；

1.5细胞培养液及试剂配制：MEM培养液100ml：含胎牛血清10％，谷氨酰胺0.03％，G418 380μg/ml，卡那霉素50U/ml。

2.试验方法

2.12.2.15细胞培养：在长满2.2.15细胞的培养瓶内加0.25％胰酶，37℃消化3分钟，加培养液吹散，1∶3传代，10天长满。

2.2药物对细胞毒性试验

实验分无药物细胞对照组和不同药物浓度药物组。细胞消化，配制成每毫升10万个细胞，接种培养板，96孔板每孔200μl，37℃5％CO₂培养24小时，细胞长成单层后进行实验。本发明重组干扰素用培养液配制成18μg/ml溶液，2倍稀释加入96孔细胞培养板，每浓度3孔，每4天换同浓度药液，以观察细胞病变为指标，8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制％。按ReedMuench法计算半数有毒浓度(TC₅₀)和最大无毒浓度(TC₀)。

$>{}_{}$

A＝log＞50％药物浓度    B＝log＜50％药物浓度    C＝log稀释倍数

2.3对HBeAg、HBsAg抑制试验

试验设HBeAg、HBsAg阳性对照组，阴性对照组，细胞对照组及不同药物浓度药物组。2.2.15细胞每毫升70万个接种24孔细胞培养板，每孔1ml，37℃5％CO2培养24小时，试验药液无毒浓度以下3倍稀释，5个稀释度分别为9.0、3.0、1.0、0.33、0.11和0.056μg/ml，每浓度1孔，37℃5％CO₂培养，每4天换原浓度药液培养，第8天时收获培养液，-20℃冰冻保存。试验重复三批，分别测定HBsAg和HBeAg。HBsAg和HBeAg测定采用中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品，固相放射免疫测定盒测定，方法见说明书，用γ-计数仪测定每孔cpm值。

药物效果计算：计算细胞对照及每浓度cpm均值及标准差，P/N值如抑制百分率(％)，半数有效浓度(IC₅₀)及选择指数(SI)。

②计算药物抑制抗原半数有效浓度(IC₅₀)：

$>{}_{}$

A＝log＞50％药物浓度    B＝log＜50％药物浓度    C＝log稀释倍数

③本发明重组干扰素在2.2.15细胞培养内对HBsAg和HBeAg的选择指数(S1)，按其对细胞毒性指标细胞病变(S1)计算。

④以t检验法计算各稀释度HBsAg、HBeAg和对照组间cpm的差别的统计学意义。

2.4 对2.2.15细胞DNA抑制实验

2.2.15细胞上清中HBV-DNA提取：2.2.15细胞每毫升70万个接种6孔细胞培养板，每孔3ml，接种后24小时加入干扰素，每4天换原浓度药液培养，加药后培养第8天收取上清液，加入聚乙二醇沉淀，离心去上清，加蛋白酶K裂解细胞，加入酵母t-RNA，等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇抽取2次，高速10,000g离心，取上清，加无水乙醇沉淀核酸，真空抽干，重溶于TE缓冲液中作样品。

斑点杂交：①点样：取20ul(DNA含量25ug)，加变性液变性，用中和液将其中和，并以20X SSC缓冲液对倍稀释至1∶128倍稀释于硝酸纤维素膜上，膜置室温晾干后放置在80℃烤箱中干烤，以固定DNA。②预杂交：将硝酸纤维素膜装于塑料袋中加预杂交液6ml，置水浴中预杂交2小时。③杂交：加入5×10⁷cpmα-³²p-dCTP标记的变性HBV-DNA探针，于42℃水浴中杂交14-18小时。④洗膜：以0.1×SSC/0.1％SDS分别在室温和65℃洗膜。⑤放射放射自显影：吸干膜上流动水分，夹片、曝光。以常规方法冲洗X光片。扫描仪扫描光片，用gel-pro软件测定密度，计算抑制率及IC₅₀。

Southernblot：①2.2.15细胞内HBV-DNA提取：2.2.15细胞加药后培养8天，吸除培养液收取细胞，加入细胞裂解液，裂解细胞，等体积苯酚：氯仿：异戊醇抽提2次，高速10,000g离心，取上清，加无水乙醇沉淀核酸，真空抽干，重溶于20μl TE缓冲液中；②电泳：加入6X DNA样品缓冲液，将样品加于1.5％琼脂糖胶上电泳，IV/em，恒压，14-18小时；③变性、杂交：将胶分别浸于HCl、变性液、中和液中；④转膜：按程序将DNA转至Hybond-N膜上。同斑点杂交一同进行烤膜、杂交、曝光。扫描仪扫描光片，以gel-pro凝胶分析软件分析相对密度，计算抑制率及IC₅₀。

3、统计与分析

各组数据以平均数(x)±标准差(S)表示，以Student t检验检测各组均数差异显著性。细胞培养毒性按Reed Muench法计算半数有毒浓度(TC₅₀)和最大无毒浓度(TC₅₀)。对HBV-DNA抑制效果按所列公式计算，对HBsAg和HBeAg抑制效果以gel-pro凝胶分析软件分析光片相对密度，计算抑制率及IC₅₀。

4、试验结果

4.1在2.2.15细胞培养中的细胞毒性

为观察rSIFN-co对乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌2.2.15细胞的毒性，在接种2.2.15细胞后24小时，加2倍稀释药液。试验自18μg/ml开始：9、4.5、2.25、1.13......μg/ml 7个稀释度，4天换一次药，维持8天，第八天用显微镜观察细胞病变，镜检CPE，TC₅₀的结果分别为本发明重组干扰素：18μg/ml、干复津：9μg/ml、干扰能：3μg/ml。结果见表1。

         表1本发明重组干扰素在2.2.15细胞培养中对细胞的毒性

  实验   批次  实验   方法  不同药物浓度(μg/ml)细胞病变   TC₅₀   μg/ml   IC₅₀   μg/ml  18  9  4.5  2.25  1.13  0.56  0.28  0  1  CPE    破坏％  2  2  2  50  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  18  9  2  CPE    破坏％  2  2  2  50  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  18  9

二批平均                                                                                18±0      9±0

表2 干复津在2.2.15细胞培养中对细胞的毒性

  实验  批次  实验  方法  不同药物浓度(μg/ml)细胞病变  TC₅₀  μg/ml  IC₅₀  μg/ml  9  4.5  2.25  1.13  0.56  0.28  0  1  CPE    破坏％  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  ＞9  ＞9  2  CPE    破坏％  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  ＞9  ＞9

二批平均                                                                               ＞9±0        ＞9±0

表3干扰能在2.2.15细胞培养中对细胞的毒性

  实验  批次  实验  方法  不同药物浓度(μg/ml)细胞病变  TC₅₀  μg/ml  IC₅₀  μg/ml  3  1.5  0.75  0.37  0.18  0.09  0  1     CPE    破坏％  2  2  2  50  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  3  1.5

4.2对2.2.15细胞培养中HBsAg和HBeAg表达的作用

4.2.1本发明重组干扰素在对HBsAg和HBeAg的作用

本发明重组干扰素9、3、1、0.33和0.11μg/ml加入2.2.15细胞培养体系中，第8天观察其对HBeAg和HBsAg的表达效果。结果见表4。

4.2.1.1对HBeAg的抑制率

三批试验rSIFN-co 9、3、1、0.33和0.11μg/ml各浓度组对2.2.15细胞培养上清第8天上清液HBeAg的平均抑制率分别为46.0±5.25％、40.57±6.08％、19.8±4.40％、8.85±9.44％、5.73±5.85％。本发明重组干扰素对HBeAg的IC₅₀分别为：6.02、3.64、3.94μg/ml，平均为：4.5±1.32μg/ml。

4.2.1.2对HBsAg的抑制率

三批试验rSIFN-co 9、3、1、0.33和0.11μg/ml各浓度组对2.2.15细胞培养第8天上清液HBsAg的平均抑制率分别为44.8±6.6％、27.9±2.41％、6.30±5.46％、2.57±4.45％、4.23±6.90％。本发明重组干扰素对HBsAg的IC₅₀分别为：6.42、6.12、6.94μg/ml，平均为：6.49±0.42μg/ml。对2.2.15细胞TC₅₀为18μg/ml，选择指数SI分别为3.96和2.77。

           表4本发明重组干扰素对HBeAg和HBsAg的作用

第一批实验：HBeAg

  浓度(μg/ml)  第一孔  第二孔  第三孔  平均抑制率(％)  9.0  3.0  1.0  0.33  0.11  细胞对照  9026  9616  9822  15770  19172  14576  8976  12082  16002  19306  22270  16578  10476  10098  12800  16824  18934  16876          40.71          33.80          19.58          0.50  IC₅₀   6.03μg/ml

HBsAg

  浓度  第一孔  第二孔  第三孔  平均抑制率(％)  9.0  3.0  1.0  0.33  0.11  细胞对照  7706  8856  10818  10744  10672  11030  7240  7778  10720  11114  9352  12088  7114  9476  10330  10570  10810  12026         37.23         25.70         9.32         7.72         12.26  IC₅₀  6.42μg/ml

第二批实验：HBeAg

  浓度  第一孔  第二孔  第三孔  平均抑制率(％)

  9.0  3.0  1.0  0.33  0.11  细胞对照  7818  10344  12296  15364  17386  16288  8516  10628  14228  17414  13632  18170  9350  9160  13262  16188  15406  18176          51.20          42.75          24.41          6.97          11.80  IC₅₀   3.66μg/ml

HBsAg

  浓度  第一孔  第二孔  第三孔  平均抑制率(％)  9.0  3.0  1.0  0.33  0.11  细胞对照  5784  7150  9830  13942  12418  11624  6198  8534  11212  12368  11634  12022  5792  8318  10210  13478  11352  10940          48.61          30.60          9.63          0          0.51  IC₅₀   6.11μg/ml

第三批实验：HBeAg

  浓度  第一孔  第二孔  第三孔  平均抑制率(％)  9.0  3.0  1.0  0.33  0.11  细胞对照  9702  8914  16312  15080  21928  13428  9614  10032  12688  12814  15366  24112  8110  8870  13934  13288  15728  13348          46.10          45.34          15.63          19.07          5.56  IC₅₀   3.82μg/ml

HBsAg

  浓度  第一孔  第二孔  第三孔  平均抑制率(％)  9.0  3.0  1.0  0.33  0.11  细胞对照  5616  8542  11420  12656  13142  11954  6228  8590  11360  11582  12336  10660  5346  7096  11394  13110  13342  10874            48.67            27.65            0            0            0  IC₅₀     6.94μg/ml

HBeAg平均IC₅₀为4.54±1.32μg/ml，TC₅₀为18μg/ml，选择指数为3.96

HBsAg平均IC₅₀为6.49±0.42μg/ml，TC₅₀为18μg/ml，选择指数为2.77

4.2.2干复津对HBeAg和HBsAg的作用

干复津9、3、1、0.33和0.11μg/ml加入2.2.15细胞培养体系中，第8天测定培养液HBsAg和HBeAg滴度，计算抑制效果，结果见表5。

4.2.2.1对HBeAg的抑制率

三批试验干复津各浓度组对2.2.15细胞培养第8天上清液HBeAg的平均抑制率分别为：9μg/ml抑制14.37±4.33％、3μg/ml抑制7.4±4.13％、1μg/ml抑制3.7±2.0％、0.33μg/ml、0.11μg/ml无抑制。最高浓度9μg/ml仅抑制14.37±4.33％。

4.2.2.2对HBsAg的抑制率

三批试验干复津各浓度组对2.2.15细胞培养第8天上清液HBsAg的平均抑制率分别为：9μg/ml抑制2.0±1.83％、3μg/ml抑制4.5±5.07％、1μg/ml、0.33μg/ml、0.11μg/ml无抑制。最高浓度9μg/ml仅抑制2.0±1.83％。

          表5.干复津对HBeAg和HBsAg的作用

                    第一批实验

HBeAg

  浓度  第一孔  第二孔  第三孔  平均抑制率(％)  9.0  3.0  1.0  0.33  0.11  细胞对照  14172  13390  14364  15722  17504  12264  12156  12288  18834  16034  17652  18956  17306  16252  14194  16340  14320  15586  10.42  11.81  5.65  0  2.74

HBsAg

  浓度  第一孔  第二孔  第三孔  平均抑制率(％)  9.0  3.0  1.0  0.33  0.11  细胞对照  12080  12840  12894  15032  11794  12008  11692  11484  14696  12928  11984  11734  12234  12350  15086  13020  11508  11788  0.435  1.01  0  0  1.08

第二批实验：

HBeAg

  浓度  第一孔  第二孔  第三孔  平均抑制率(％)  9.0  3.0  1.0  0.33  0.11  细胞对照  6278  7692  8960  8530  7848  6604  6376  9092  7474  8144  7848  9568  6408  6394  8190  9682  7848  7366  19.04  6.84  1.59  0  0

HBsAg

  浓度  第一孔  第二孔  第三孔  平均抑制率(％)  9.0  3.0  12364  11590  12268  12708  12274  13716  4.10  3.53

  1.0  0.33  0.11  细胞对照  12448  12616  12828  13218  13468  11346  12828  12398  13982  12444  12828  12870  0.99  5.40  0

                     第三批实验：

HBeAg

  浓度  第一孔  第二孔  第三孔  平均抑制率(％)  9.0  3.0  1.0  0.33  0.11  细胞对照  7240  11072  7016  7622  7740  7420  6642  8786  9726  8866  7740  7486  6158  6902  7552  8676  7740  8314  13.70  3.61  3.93  0.51    0

HBsAg

  浓度  第一孔  第二孔  第三孔  平均抑制率(％)  9.0  3.0  1.0  0.33  0.11  细胞对照  11048  13454  12846  12680  11602  11716  11856  12896  13160  12458  11602  11198  11902  11798  12546  12360  11602  11892  1.59    0    0    0    0

4.2.3干扰能对HBeAg和HBsAg的作用

干扰能3倍稀释1、0.33、0.11和0.037μg/ml加入2.2.15细胞培养，第8天测定培养液HBeAg和HBsAg滴度，计算抑制效果。由于样品不足，仅进行一批实验，结果见表6。

4.2.3.1对HBeAg的抑制率

干扰能各浓度组对2.2.15细胞培养第8天上清液HBeAg的平均抑制率只有1μg/ml抑制6.87％、0.33μg/ml、0.11μg/ml和0.037μg/ml无抑制。说明干扰能对2.2.15细胞分泌HBeAg抑制作用微弱，最高浓度1μg/ml仅抑制6.87％。

4.2.3.2对HBsAg的抑制率

干扰能1、0.33、0.11和0.037μg/ml各浓度组对2.2.15细胞培养第8天1、0.33μg/ml组上清液HBsAg的平均抑制率分别为：17.8％、1.85％。0.11μg/ml、0.037μg/ml无抑制。表明干扰能对2.2.15细胞分泌HBsAg抑制作用微弱，最高浓度1μg/ml仅抑制17.8％。

表6.干扰能在2.2.15细胞培养中对HBeAg和HBsAg的作用

HBeAg

  浓度(μg/ml)  第一孔  第二孔  第三孔  平均抑制率(％)  1.0  0.3333333  0.1111111  0.03703704  细胞对照  14918  14868  16760  20854  11902  11724  16890  21716  15042  13546  9950  15182  16400  16168  10802  6.87  0  0  0HBsAg  浓度(μg/ml)  第一孔  第二孔  第三孔  平均抑制率(％)  1.0  0.3333333  0.1111111  0.03703704  细胞对照  9226  10946  12250  12634  11336  8196  10340  12980  12342  10514  9658  10828  13934  12000  10808  17.08  1.85    0    0

4.3对2.2.15细胞培养上清液HBV-DNA的抑制作用

4.3.1本发明重组干扰素在2.2.15细胞培养上清液中HBV-DNA斑点杂交结果见表7。

表7.本发明重组干扰素在2.2.15细胞培养上清液中对HBV-DNA的作用

第一批实验HBV-DNA斑点密度值：

  药物浓度  (μg/ml)  细胞培养液HBV-DNA稀释倍数/密度值  原液  1/2  1/4  1/8  1/16  9.0  3.0  1.0  0.33  细胞对照  208.10  285.14  568.60  1801.13  1991.7  9.36  97.92  265.60  1187.99  920.81    0  19.17  173.25  730.71  586.40  0.38  3.36  143.12  449.56  367.63  0  0.39  170.27  218.89  247.02  药物浓度  (μg/ml)  细胞上清液HBV-DNA稀释倍数/抑制率％  原液  1/2  1/4  1/8  1/16  9.0  3.0  1.0  0.33  89.6  85.7  71.5  9.6  99.0  89.4  71.2   0  100  96.7  70.5   0  99.9  99.1  61.1   0  100.0  99.8  31.1  11.4

IC₅₀(以稀释1/2对HBV-DNA的抑制％计算)：0.789μg/ml

                第二批实验HBV-DNA斑点密度值：

  药物浓度  (μg/ml)  细胞培养液HBV-DNA稀释倍数/密度值  原液  1/2  1/4  1/8  1/16  9.0  3.0  1.0  292.45  189.25  526.65  319.92  172.50  272.01  304.53  122.71  208.28  265.14  120.16  187.57  131.75  138.62  121.32

  0.33  细胞对照  1568.4  2288.56  1256.42  1468.99  572.472  733.442  392.86  479.421  167.042  294.065  药物浓度  (μg/ml)  细胞上清液HBV-DNA稀释倍数/抑制率％  原液  1/2  1/4  1/8  1/16  9.0  3.0  1.0  0.33  87.2  91.7  77.0  31.5  78.2  88.3  81.5  14.5  58.5  83.3  71.6  21.9  44.7  74.9  60.9  18.1  55.2  52.9  58.7  43.2  IC₅₀(以稀释1/2对HBV-DNA的抑制％计算)        0.744μg/ml

本发明重组干扰素对2.2.15细胞培养上清液中对HBV-DNA的作用，平均IC₅₀为0.766±0.318μg/ml，TC50为18μg，选择指数为23.5。

4.3.2干复津在2.2.15细胞培养对上清液中HBV-DNA的作用见表8。

表8.干复津在2.2.15细胞培养中对上清液中HBV-DNA的作用

第一批实验在2.2.15细胞培养中对上清液斑点杂交HBV-DNA密度值

  药物浓度  (μg/ml)  细胞上清液HBV-DNA稀释倍数/密度值  原液  1/2  1/4  1/8  1/16  9.0  3.0  1.0  0.33  细胞对照  1063.99  602.366  536.702  1102.09  1260.6  368.924  176.387  133.42  418.724  244.72  157.546  74.2889  58.8248  193.038  40.5104  50.608  32.0841  29.8446  48.5348      0  22.0161  28.3339  15.4392  4.24409  0.724407  药物浓度  (μg/ml)  细胞上清液HBV-DNA稀释倍数/抑制率％  原液  1/2  1/4  1/8  1/16  9.0  3.0  1.0  0.33  15.5965  52.21593  57.4249  12.5742    0  27.92293  45.4805    0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0

IC₅₀(以稀释1/2对HBV-DNA的抑制％计算)：＞9.0μg/ml

第二批实验在2.2.15细胞培养中对上清液斑点杂交HBV-DNA密度值

  药物浓度  (μg/ml)  细胞上清液HBV-DNA稀释倍数/密度值  原液  1/2  1/4  1/8  1/16  9.0  3.0  1.0  0.33  细胞对照  1115.72  1895.48  1875.29  1994.86  1916.59  853.631  938.825  1113.6  1205.62  1239.46  469.708  425.102  678.462  701.893  767.513  281.854  254.559  362.124  277.354  421.321  193.609  143.008  220.522  172.394  259.313  药物浓度  (μg/ml)  细胞上清液HBV-DNA稀释倍数/抑制率％  原液  1/2  1/4  1/8  1/16  9.0  3.0  1.0  41.8  1.1  2.2  31.1  24.3  10.2  38.8  44.6  11.6  33.1  39.6  14.1  25.3  44.9  15.0

  0.33  0  2.7  8.5  34.2  33.5  IC₅₀(以稀释1/2对HBV-DNA的抑制％计算)         ＞9μg/ml

两批实验干复津对2.2.15细胞上清液内HBV-DNA无明显抑制作用，IC₅₀为＞9±0μg/ml。选择指数为：＜1。

4.3.3干扰能在2.2.15细胞培养中对上清液中HBV-DNA的作用见表9。

表9.干扰能在2.2.15细胞培养中对上清液中HBV-DNA的作用

第一批实验在2.2.15细胞培养中对上清液斑点杂交HBV-DNA密度值

  药物浓度  (μg/ml)  细胞上清液HBV-DNA稀释倍数/密度值  原液  1/2  1/4  1/8  1/16  1  0.3  0.1  0.0370  细胞对照  1029.92  270.10  206.80  4089.24  4498.85  292.33  134.33  108.28  1772.13  2276.49  186.01  99.31  32.85  1014.87  767.23  67.62  0.64  8.58  525.11  191.07  9.96  3.68  6.70  184.22  26.83  药物浓度  (μg/ml)  细胞上清液HBV-DNA稀释倍数/抑制率％  原液  1/2  1/4  1/8  1/16  1  0.3  0.1  0.0370  77.1  94  95.4  8.9  87.2  94.1  95.2  22.2  75.8  87.1  56.7    0  35.4  99.7  94.4    0  62.9  86.3  75.9    0

IC₅₀(以稀释1/2对HBV-DNA的抑制％计算)：0.0635μg/ml

一批实验干扰能对2.2.15细胞内HBV-DNA有明显的抑制作用，IC₅₀为0.0635μg/ml。TC₅₀为3μg/ml，选择指数为：47.2。

4.4受试药在2.2.15细胞内HBV-DNA Southern Blot的抑制作用

4.4.1本发明重组干扰素在2.2.15细胞内HBV-DNA的Southern Blot抑制作用，两批实验结果见表10。

表10.本发明重组干扰素在2.2.15细胞内HBV-DNA Southern Blot的抑制数据

  第1批  9μg/ml  抑制％  4.5μg/ml  抑制％  1.5μg/ml  抑制％  0.5μg/ml  抑制％  细胞对照  Rows  (IOD)  (IOD)  (IOD)  (IOD)  (IOD)  RC  187.5  96.1  696.22  85.5  663.96  86.1  1427.9  70.2  4788.4  DS  498.97  85.7  702.5  79.9  1962.1  43.8  3232.8  7.4  3491.6  CCC  118.74  96.6  260.8  92.6  1049  70.4  2561  27.8  3545  Ss  2130.1  85.1  3322.4  76.8  8692.2  39.3  12562  12.2  14313  Sum  2935.3  4981.9  12367  19784  26138  In  Lane  3590  89.9  6769.3  80.9  16978  52.2  27846  21.6  35500  不同浓度重组高校复合干扰素接种细胞内总HBV-DNA in lane计算的抑制作用：IC₅₀：1.0344μg/ml  第2批  9μg/ml  抑制％  4.5μg/ml  抑制％  1.5μg/ml  抑制％  0.5μg/m  1  抑制％  细胞对照  Rows  (IOD)  (IOD)  (IOD)  (IOD)  (IOD)  RC  961.55  82.1  1.0357  99.9  783.76  85.4  3157.1  41.2  5371  DS  1533.3  83.8  552.35  94.2  618.02  93.5  7009.5  26.2  9491.6  Ss  474.23  92.6  1007.7  84.3  2099.3  67.3  6553  -  6411.7  Sum  2969  1561  3501.1  16720  21274

  In  Lane  6853.9  83.3  4769.2  88.4  9327.2  77.3  25388  38.1  41011  不同浓度重组高校复合干扰素接种细胞内总HBV-DNA in lane计算的抑制作用：IC₅₀：618μg/ml

结果表明：本发明重组干扰素接种细胞内总HBV-DNA Southern blot测定结果inlane抑制作用平均：IC₅₀为0.826±0.294μg/ml，TC₅₀为18μg/ml，SI为21.79。

4.4.2干复津在2.2.15细胞内对HBV-DNA的Southern Blot抑制作用，两批实验结果见表11。

表11.干复津在2.2.15细胞内对HBV-DNA的Southern Blot的抑制作用

 第1批  9μg/ml抑制％  4.5μg/ml抑制％  1.5μg/ml抑制％  0.5μg/ml抑制％  细胞对照 Rows  (IOD)  (IOD)  (IOD)  (IOD)  (IOD) RC  305.4781.15  1979.2  1671.9  1107.431.68  1621 DS  2.5599.3  636.56  411.45  173.0250.04  346.33 ccc  611.731.75  1943  1588.5  907.36  896.3 SS  1107.483.5  4343  3933.1  6131.5  6731.1 Sum  2027.1  8901.8  7604.9  8319.2  9594.8 In Lane  3300.473.15  14781.0  11748.004.4  1047214.8  12295 不同浓度干复津接种细胞内总HBV-DNA in lane计算的抑制作用：IC₅₀：5.626μg/ml 第2批 9μg/ml  抑制％  4.5μg/ml  抑制％  1.5μg/ml 抑制％  0.5μg/ml  抑制％  细胞对照 Rows (IoD)  (IOD)  (IOD)  (IOD)  (IOD) RC 547.54  76.6  2106.5  9.9  2075.9 11.2  3363.9  2338.1 DS 22.352  96.8  531.05  24.5  413.13 41.3  727.36  703.6 ccc 441.63  77.6  1527.7  22.5  1328.9 32.6  1692.5  1971.1 ss 1731.2  75.2  6613.5  5.3  5746.3 17.7  9036.9  6981.8 Sum 2742.7  10779  9564.2  14821  11994 In Lane 3887.3  75.3  16377  13579 15.1  19584  16016 不同浓度干复津接种细胞内总HBV-DNA in lane计算的抑制作用：IC₅₀：5.644μg/ml

结果表明：干复津接种细胞内总HBV-DNA Southern Blot测定in lane，抑制作用，IC₅₀：5.63±0.012μg/ml，TC₅₀为＞9μg/ml，SI为1.60。

4.4.3先灵葆雅干扰能在2.2.15细胞内对HBV-DNA的Southern Blot抑制作用，一批实验结果见表12。

表12.先灵葆雅干扰能在2.2.15细胞内HBV-DNA Southern Blot的抑制作用

 第1批  1μg/ml  抑制％  0.33μg/ml  抑制％  0.11μg/ml  抑制％  0.037μg/ml  抑制％  细胞对照 Rows  (IOD)  (IOD)  (IOD)  (IOD)  (IOD) RC  0  100  9.8557  99.5  436.26  78.6  943.28  53.8  2043.4 DS  0.61028  99.9  130.22  96.5  1498.2  60.0  2534.1  32.4  3747.5 ss  279.72  98.1  2356.4  84.0  7866.8  46.7  11413  22.7  14759 Sum  280.33  2496.5  9801.3  14890  20550 In lane  285.41  98.9  2501.4  90.86  11679  57.4  23864  12.9  27394 不同浓度干扰能接种细胞内总HBV-DNA in lane计算的抑制作用：IC₅₀：0.095μg/ml

结果表明：先灵葆雅干扰能接种细胞内总HBV-DNA Southern Blot测定in lane计算的抑制作用平均为：IC₅₀：0.095μg/ml，TC₅₀为3μg/ml，SI为31.58。

5结论

本试验观察了受试药在乙型肝炎病毒转染的人肝癌细胞2.2.15细胞系培养中对细胞的毒性，对HBeAg和HBsAg分泌以及对HBV-DNA的抑制作用。结论如下：

5.1对2.2.15细胞培养的毒性

不同给药浓度的本发明重组干扰素，分别加入2.2.15细胞培养8天，以细胞病变为指标，与干复津及干扰能相比，本发明重组干扰素半数毒性浓度(TC₅₀)为18±0μg/ml，最大无毒浓度(TC0)为9±0μg ml。干复津的最大浓度9±0μg/ml无毒性，半数毒性浓度(TC₅₀)和最大无毒浓度(TC0)都为＞9±μg/ml。干扰能半数毒性浓度(TC₅₀)为3±0μg/ml，最大无毒浓度(TC0)为1.5±0μg/ml。

5.2在2.2.15细胞培养内对HBeAg和HBsAg的分泌的抑制作用

各样品以最大无毒浓度加入2.2.15细胞培养8天，本发明重组干扰素9±0μg/ml对HBeAg的抑制率为46.0±5.25％(P＜0.001)，IC₅₀为4.54±1.32μg/ml，选择指数SI为3.96，有明显抑制作用，最大无毒浓度9μg/ml对HBsAg的抑制率为44.8±6.6％，IC₅₀为6.49±0.42μg/ml，选择指数SI为2.77。干复津和干扰能对HBeAg和HBsAg抑制作用弱，最高浓度仅抑制20％以下。

5.3在2.2.15细胞培养内对HBV-DNA抑制作用

各样品以最大无毒浓度加入2.2.15细胞培养8天，本发明重组干扰素斑点杂交和Southern  Blot测定HBV-DNA结果分别为IC₅₀为0.766±0.318μg/ml，SI为23.5；Southern BlotA结果平均IC₅₀为0.826±0.294μg/ml，SI为21.79。干复津二批实验斑点杂交IC₅₀为＞9±0μg/ml，SI为＜1。Southern  Blot结果平均IC₅₀为5.63±0.12μg/ml，SI为1.60；干扰能一批实验斑点杂交IC₅₀为0.0635±0.294μg/ml，SI为47.2，Southern  Blot结果平均IC₅₀为0.095±0μg/ml，SI为31.58。

                            表13.总结表

  药品  细胞毒性  TC₅₀  μg/ml  HBeAg  HBsAg  HBV-DNA  Southern  Blot  IC₅₀  μ  g/ml  SI  IC₅₀  μ  g/ml  SI  IC₅₀  μg/ml  SI  IC₅₀  μg/ml  SI  本发明重组  干扰素  18.0  4.54  ±   1.32  3.96  6.49  ±   0.42  2.77  0.766  ±   0.318  23.5  0.826  ±   0.294  21.8  干复津  ＞9.0  ＞9.0  1.0  ＞9.0  ＞9.0  1.0  5.63±   2.0  1.60  干扰能  3.0  ＞3.0  ＞3.0  0.0635  47.2  0.095  31.6

本发明重组干扰素对细胞上清和细胞内HBV-DNA也有明显抑制作用，但与其他干扰素不同，高浓度9μg/ml在2.2.15细胞中可抑制HBeAg和HBsAg的分泌。美国安进公司生产的干复津和美国先灵葆雅公司生产的干扰能在2.2.15细胞中不能抑制HBeAg和HBsAg的分泌。

例六

本发明重组干扰素(rSIFN-co)对乙肝病毒基因表达及核心抗原表达的抑制实验

本实验选取本发明重组干扰素(rSIFN-co)、干复津(interferon alfacon-1)及干扰能(IFN-α2b)对乙肝病毒基因表达及核心抗原基因进行抑制实验。

乙型肝炎病毒(HBV)DNA包含了反式激活蛋白的保守结合序列，这种蛋白的结合活性是受干扰素调控的。用干扰素处理HBV转染的肝细胞导致HBV基因表达的抑制。本研究的目的是研究不同的干扰素对HBV转录调控的影响。用含HBV增强子EnH I、EnH II和核心启动子的控制下的荧光素酶基因的报道质粒(reporter plasmid)，瞬时转染人类肝细胞癌细胞。

一、材料和方法：

1.干扰素：本发明重组干扰素(rSIFN-co)、干复津(IFN-conl)及干扰能(IFN-α2b)。

2.报道质粒：PCR扩增包含了EnH I、EnH II和核心启动子的DNA切片，末端切平，克隆到pGL3-Basic(Promega，WI，USA)的无增强子和启动子的荧光素酶基因前的Smal I位点，产生的报告质粒命名为pGL3-HBV-Luc。

3.细胞培养和DNA转变感染：将HepG2细胞培养于DMEM培养基中，该培养基补加10％FBS，100U/ml的青霉素和100ug/ml链霉素。将细胞放置于温度30℃，含5％的CO2的培养箱内。使用Boehringer的脂质体转染试剂盒将pGL3-HBV-Luc报告质粒转染细胞。经过18小时，移走含有转染试剂的培养基，注入含有或不含有干扰素的新鲜培养基，再培养48小时。

4.荧光素酶测定：注入干扰素48小时后，收集并破碎细胞。该细胞溶解产物的蛋白质浓度由Bio-Rad蛋白质定量试剂盒检测，荧光素酶活性测定使用Promega的荧光素酶报告检测系统，按照制造商提供的指南进行。

二、实验结果：见附图10。由附图10所示可知，干扰能抑制率为27％，干复津抑制率为35％，rSIFN-co抑制率为68％。

四、实验结论：

本发明重组干扰素(rSIFN-co)对乙型肝炎病毒基因表达及核心抗原表达的抑制比美国安进公司的干复津和先灵葆雅公司的干扰能对乙型肝炎病毒基因表达及核心抗原表达的抑制率高出两倍左右。

例七

本发明重组干扰素(rSIFN-co)制剂实例配方

注射用：

  水针剂  冻干粉针剂  本发明重组干扰素原液  34.5μg/ml  34.5μg/ml  pH7.0的磷酸盐缓冲液  25mmol/L  10mmol/L  甘氨酸  ---------  0.4mol/L  氯化钠  0.1mol/L  ----------

喷雾剂：

  EDTA  0.01％  吐温80  0.05％  柠檬酸三钠  10mmol/L  丙三醇  1.26％  氯化钠  0.03％  苯甲醇  0.5％  人血白蛋白  0.1％  本发明重组干扰素  10μg/ml

例八

本发明重组干扰素(rSIFN-co)制剂

冻干注射剂的制备

本发明重组干扰素原液                       34.5μg/ml

pH7.0的磷酸盐缓冲液                10mmol/L

甘氨酸                             0.4mol/L

制备工艺：按处方称料，无菌无热原注射水溶解，0.22μm孔径滤膜过滤除菌，于6-10℃保存，取样作无菌和热原检查合格后分装西林瓶中，单剂量0.3/瓶或0.5/瓶。分装后放置至冻干机中冷冻干燥。

水溶液注射剂的制备

本发明重组干扰素原液               34.5μg/ml

pH7.0的磷酸盐缓冲液                25mmol/L

氯化钠                             0.1mol/L

制备工艺：按处方称料，无菌无热原注射水溶解，0.22μm孔径滤膜过滤除菌，于6-10℃保存，取样作无菌和热原检查合格后分装于密闭容器中，单剂量0.3/瓶或0.5/瓶，分装后成品置2-10℃暗处保存。

例九

本发明重组干扰素(rSIFN-co)注射用冻干粉针剂的稳定性

我们将本发明重组干扰素冻干粉针剂三批各两种规格样品进行稳定性试验，试验起始时间：2000年4月。

一、样品来源

本发明重组干扰素连续三批各两种规格冻干粉针剂由四川省生物工程研究中心制备，中试样品批号分别为：990101、990102、990103，各两个亚批。

二、样品标准

进行本实验的各样品试验前应符合下表要求：

试验前样品指标

  指标  质量要求  1.外观  2.溶解时间  3.澄明度  4.pH值  5.效价(IU/支)  6.水份  白色疏松体  室温下注射用水溶解迅速(2分钟内)  无色或微带乳光的澄明液体，不应浑浊、含有异物或摇不散的沉淀  6.5～7.5  标示量的80％～150％(9μg：450万IU，15μg：750万IU)  ≤3.0％(W/W)

三、试验内容

1、2～8℃留样考察：将待考察样品置于2～8℃冰箱中，分别设定在第1、3、6、9、12、18、24、30、36月取样，测定上述指标，并作好记录。

2、25℃留样考察：将待考察样品置于25℃恒温箱中，分别设定在第1、3、6、9、12、18、24、30月取样，测定上述指标，并作好记录。

3、37℃留样考察：将待考察样品置于37℃恒温箱中，分别设定在第1、3、6、9、12、18、24月取样，测定上述指标，并作好记录。

四、结果与讨论

1、冻干 rSIFN-co三批(990101、990102、990103)各两个规格样品在37℃留样观察，在不同时期取样检测各项指标，与试验前比较，第6个月开始效价呈下降趋势，三批样品效价变化相仿，其余检测指标符合要求。

2、冻干 rSIFN-co三批(990101、990102、990103)各两个规格样品在25℃留样观察，在不同时期取样检测各项指标，与试验前比较，9个月内，效价变化不大，其余检测指标符号要求。

3、冻干 rSIFN-co三批(990101、990102、990103)各两个规格样品在2~8℃留样观察，在不同时期取样检测各项指标，与试验前比较，9个月内效价稳定，无明显变化，各项检测指标符合要求。

因此，我们建议：本发明重组干扰素的冻干的贮藏、运输应以低温为妥，达不到低温条件的情况下，短时间内(3个月)可室温放置。

例十

本发明重组干扰素(rSIFN-co)喷雾剂

rSIFN-co具有广谱抗病毒作用，其体外抗病毒活性是现有其他干扰素的5-20倍。体外试验显示本发明重组干扰素具有显著的抗SARS病毒活性，本发明重组干扰素对10000和1000TCID50SARS病毒的半数抑制浓度(IC50)分别为0.92和0.18μg/ml，治疗指数相应为151.28和773.32。详见实例十六。

本发明重组干扰素喷雾剂，主要活性成分即为rSIFN-co，性状为无色液体，无肉眼可见不溶物。其抗病毒机制主要通过干扰素同靶细胞表面的干扰素受体结合，诱导靶细胞内2’5’一A合成酶、蛋白激酶等多种抗病毒蛋白，阻止病毒蛋白质的合成。并通过诱生多种抗病毒蛋白，抑制病毒在细胞内的复制增强NK细胞活性及其他免疫调节作用，有效地遏制病毒侵袭和感染的发生。在本发明重组干扰素喷雾剂的毒理试验中，最大剂量静脉或肌肉注射小鼠全部健存，无死亡，未测出LD50。通过rSIFN-co喷雾剂的药理、毒理研究，证明本发明重组干扰素喷雾剂适用于预防或治疗严重急性呼吸道综合症或由病毒感染引起的上呼吸道疾病。

本发明重组干扰素喷雾剂的不良反应研究：目前世界上尚未见重组干扰素喷雾剂不良反应的报道，一般不会引起刺激、过敏以及全身反应。用药期间个别人员偶尔出现轻度刺激以及胃肠反应，若无其他明显反应，无须终止给药rSIFN-co喷雾剂，可自行缓解。

本发明重组干扰素喷雾剂在4-8℃冷藏避光条件下保存，勿冷冻。使用图15所示的喷雾器，其按照以下方法和使用量给药：每日早、中、晚每个鼻孔各喷一次，咽喉一次。每次给药时，取掉药瓶塑料喷头罩，挤压，喷射一次(见附图15)。每揿喷量为0.1ml，雾化度为15.60-30.51μm(由定量喷头雾化喷出)。所述喷雾器高90mm，底宽25mm，顶宽6mm，重9g，每喷体积：0.1ml。

例十一

本发明重组干扰素(rSIFN-co)急性毒性试验

本试验采用一次给小鼠肌肉注射本发明重组干扰素150μg/kg(相当于成人每公斤体重用量的1000倍)。观察给药后2周内动物急性毒性反应及死亡情况。结果表明：一次肌注给药后，24小时内动物未见异常情况，处死部分动物并尸解经肉眼观察：各主要脏器未见肉眼可见的病变。余下的小鼠2周内亦未见异常反应，亦无一只死亡，于第14天称重发现，给药组与对照组小鼠体重均有所增加，且两组体重增加值无明显差异(P＞0.05)。处死小鼠尸解各主要脏器无肉眼可见的病变。

一、实验材料

1、试验动物

成年健康KM小鼠40只，体重18～22g，雌雄各半，SPF级，质量合格证：川实动管质第6号，1998年合格，使用实施合格证：川实动管第99-5号，合格，医动学第24A00003号，合格。

2、试验药品

本发明重组干扰素由四川省生物工程研究中心提供，无菌液体，0.15mg/ml，批号：981201

用注射用生理盐水配成所需浓度即用。

二、实验方法

将40只小鼠按体重、性别随机分为2组，分别为生理盐水阴性对照组和本发明重组干扰素组(150μg/kg)，每组20只小鼠，雌雄各半，分别给每只小鼠肌注生理盐水和相应药物，给药容积均为0.1ml/10g，一次给药后，观察各小鼠急性毒性反应。于给药后24小时将各组动物处死一半(雌雄各半)，尸解观察小鼠心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胃、十二指肠等主要脏器有无肉眼可见的病变，如有则做病理组织学检查。余下的动物继续观察，于给药后第14天，称重后处死动物并尸解，观察各小鼠主要脏器有无肉眼可见的病变，如有则做病理组织学检查，并将给药组小鼠体重变化值与阴性对照组小鼠体重值进行t检验，判断有无显著性差异。

三、实验结果

结果表明，小鼠肌注一次给予本发明重组干扰素150μg/kg，相当于人用剂量的1000倍，小鼠未出现毒性反应，给药后的14天内，各小鼠摄食、饮水、活动、毛发、大小便等未见异常，亦无一只小鼠死亡。肉眼观察给药后24小时处死并尸解的小鼠，结果表明小鼠各脏器无肉眼可见的病变。于给药后第14天称体重后处死并尸解的小鼠，其各主要脏器也均无肉眼可见的病变，且给药组与阴性对照组小鼠体重均有所增加，其体重增加值与阴性对照组无显著差异(P＞0.05)，结果见下表。

本发明重组干扰素一次给药后对小鼠体重的影响(X±SD)

  组别  剂量  (μg/kg)  动物数  给药前体重  (g)  给药后体重  (g)  体重增加值  (g)  阴性对照组  本发明重组干扰素组  0  150  20  20  19.8±1.7  19.4±1.7  30.8±2.8  32.1±3.3  11.0±2.9  12.7±4.3

四、实验结论

在本试验条件下，一次肌注本发明重组干扰素150μg/kg小鼠均未见毒性反应。因此，本发明重组干扰素肌肉注射小鼠的最大耐受剂量大于150μg/kg，相当于人用剂量的1000倍。

例十二

本发明重组干扰素(rSIFN-co)药代动力学试验

为了考察人体对本发明重组干扰素(rSIFN-co)在人体的吸收及代谢情况，同时为了向临床使用本品提供药代动力学方面的参考资料，四川省生物工程研究中心于2003年在四川大学华西医院进行了本发明重组干扰素(rSIFN-co)药代动力学试验。

一、入选标准

1、签署知情同意书；

2、一般体格检查正常，病史及用药史符合试验要求；

3、年龄：20～30岁男性；

4、体重指数在20～27范围内(体重指数＝体重(公斤)/身高(米)²)；

5、血、尿、粪便常规化验和心、肝、肾功能检查，均属正常。

二、排除标准

1、有药物、食物过敏史者；

2、试验前患过重病者；

3、经常用药、嗜烟酒者；

4、精神病患者：

5、3个月内参加过其它药物临床试验者；

6、3个月内用过已知对某脏器有损害的药物或目前正在使用药物者；

7、有其它影响药物吸收、分布、代谢和排泄等因素者。

三、试验药物

本发明重组干扰素(rSIFN-co)，由四川省生物工程研究中心提供；美国安进(Amgen)公司生产的干复津(interferon alfacon-1)。

四、研究方法

将受试者分为2组。2组受试者试验当天在I期临床试验病房内分别接受本发明重组干扰素9μg和干复津9μg皮下注射，并在注射受试药物前及注射药物后预定的采血时点采血3ml，共采血14次。同时，医师将进行48小时连续观察，于用药前及用药后第48小时进行多项实验室检查、心电图检查。

五、研究结果

注射本发明重组干扰素(rSIFN-co)与干复津不同采血时间比较寡聚核苷酸浓度(2-5A浓度)见附图11。由附图11可知，本发明重组干扰素(rSIFN-co)与干复津比较，本发明重组干扰素(rSIFN-co)有两次血浓度高峰，其曲线下面积大于干复津的曲线下面积。图11同时显示出本发明重组干扰素所具有的峰形与干复津的也不相同。

例十三

使用本发明重组干扰素(rSIFN-co)的毒副作用及体温变化研究

现有干扰素类药的副反应较多，常见反应如：恶心、肌肉酸痛、食欲不振、脱发、白细胞及血小板减少等。

一、研究方法：

选取A、B两组受试者。A组注射9μg本发明重组干扰素，B组注射9μg干复津。注射后，临床观察48小时。注射1小时后进行第一次观察记录，此后每隔2小时观察记录一次。记录内容主要包括乏力、发热、全身疼痛、嗜睡、厌食和受试者体温等情况。

二、研究结果：

注射rSIFN-c0后大多数不良反应的程度为轻微和中等。类似流感的症状如：头痛、乏力、畏寒、肌痛、多汗、关节痛等是副反应中最常见的。干复津不良反应及副反应高于本发明重组干扰素。下表列出的是9μg本发明重组干扰素与9μg干复津注射后副反应对比记录。

临床受试者不良反应发生例数

  rSIFN-co 9μg  干复津 9μg

  人数：n＝10  人数：n＝11  全身系统  反应  反应例数  反应例数  总体  乏力  3  3  发热  3  6  脚板发热  1  畏寒  3  4  腿软  3  腰酸  2  1  全身疼痛  4  5  中枢神经系  统/周围神经  系统  头痛  3  6  头晕  2  11  嗜睡  3  胃肠  厌食  1  腹痛  1  腹泻  1  肌肉骨骼  肌痛  1  2  关节痛  2  呼吸系统  鼻子不通气  1  视力障碍  眼胀  1

三、研究结论

由以上临床受试者不良反应发生例数的记录列表可知，注射干复津后的副反应明显高于注射本发明重组干扰素后的副反应。

注射本发明重组干扰素和干复津后受试者的体温变化情况见附图12A-1，12A-2，12B-1，12B-2。

由附图12A-1、12A-2、12B-1、12B-2，可以观察到B组受试者的体温明显高于A组受试者，证明rSIFN-co比干复津具有更低的发热症状及发热程度。同时，本发明重组干扰素耐受度明显优于干复津，本发明重组干扰素有更好的耐受性。

例十四

本发明重组干扰素(rSIFN-co)的临床效果

本发明本发明重组干扰素(rSIFN-co)主要用于病毒性疾病的治疗，对滤泡性口炎病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、冠状病毒、EB病毒等都有抑制作用。以WISH细胞/VSV系统进行抗病毒活性检测，结果分别为：国产天然干扰素为0.9×108U/mg，INTRON为2.0×108U/mg，rSIFN-co为9×108U/mg，其抗病毒活性明显高于前二者。

自2003年2月起，经中国国家食品药品监督管理局(SFDA)批准，在四川大学华西医院、重庆医科大学附属第二医院、浙江大学医学院附属第一医院做本发明重组干扰素(rSIFN-co)与赛诺金(IFN-α1b)的多中心随机对照研究治疗乙型肝炎的临床试验。试验过程及结果如下：

一、本发明重组干扰素(rSIFN-co)与赛诺金(IFN-α1b)治疗慢性活动性乙肝的疗效比较

(一)入选标准

使用rSIFN-co(9μg)和赛诺金的入选标准相同，符合1-4条件；使用rSIFN-co(15μg)的入选标准，符合1-5条件。

年龄18～65岁；

HBsAg持续阳性至少6个月以上，HBeAg阳性，筛选期内至少一次PCR检测HBV-DNA≥105拷贝数/ml；

ALT≥2倍正常值上限(ULN)；

未曾接受过干扰素抗HBV治疗或3月前接受过拉米夫定治疗但无效或复发者；

入选6月前曾采用过某种干扰素(3MU或5MU)进行按SDA规定疗程及剂量抗HBV治疗，但无效或复发者。

(二)疗效判断

参考2000年第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议，根据随访结束时血清ALT水平是否恢复正常，HBV-DNA是否转阴，HBeAg是否发生血清学转换，将疗效分为三级：

完全应答：ALT复常、HBV-DNA阴转、HBeAg发生血清学转化

部分应答：ALT复常、HBV-DNA阴转或HBeAg发生血清学转化

无应答：ALT未复常、HBV-DNA未阴转、HBeAg未阴转

其中，完全应答和部分应答者判断为显效病例

临床治疗效果比较：

rSIFN-co与IFN-α1b(赛诺金)治疗慢性活动性乙肝的疗效比较表

  治疗时间  分组  药品  总例数  显效率％  HBs抗原  转阴率％  HBe抗原  转阴率％  HBV-DNA  转阴率％  肝功  复常率％  8-12周  A  rSIFN-c0  (9μg)  32  46.88  (15)  9.38  (3)  28.13  (9)  37.50  (12)  84.38  (27)  B  IFN-α1b  (5MU，50μg)  32  21.88  (7)  0.00  (0)  9.38  (3)  15.63  (5)  56.25  (18)  16-24周  A  rSIFN-co  (9μg)  64  54.69  (35)  7.81  (5)  25.00  (16)  34.38  (22)  90.63  (58)  B  IFN-α1b  (5MU，50μg)  64  25.00  (16)  0.00  (0)  9.38  (6)  18.75  (12)  78.13  (50)

与此试验同时进行的用rSIFN-co治疗经临床证实为慢性活动性乙肝且使用过某种干扰素(3MU或5MU)进行按SDA规定疗程及剂量抗HBV治疗，但无效或复发的患者13例，每次15μg皮下注射，每48小时1次，连续注射24周。治疗后截至第十二周，13例中有7例(53.85％)患者临床显效，其中0例s抗原转阴(0％)，3例e抗原转阴(23.08％)，3例HBe抗体转为阳性(23.08％)，7例HBV-DNA转阴(53.85％)，11例肝功恢复正常(84.62％)。

(三)rSIFN-co与赛诺金的副反应比较

干扰素类药的副反应较多，包括发热、恶心、肌肉酸痛、食欲不振、脱发、白细胞及血小板减少，IFN-α1b的临床最大使用剂量为每次5MIU，常规每次使用3MIU，采用常规使用剂量时，临床约有90％的患者表现出I-II级(WHO临床分级标准)的副反应，包括38℃以下的轻微发热、恶心、肌肉酸痛、食欲不振等。采用最大剂量时，副反应的发生率无明显上升，但各种临床症状程度明显加重。

rSIFN-co的临床最大使用剂量为每次24μg，常规每次使用9μg，采用常规剂量时临床约有不足50％的患者表现出I-II级(WHO临床分级标准)的副反应，包括38℃以下的轻微发热、恶心、肌肉酸痛、食欲不振、白细胞及血小板轻度降低等。使用最大剂量(＞2000万IU)时约有50％的患者在用药15天后出现白细胞及血小板轻度降低，但停药1周后白细胞及血小板恢复正常，可安全地继续用药。

二、本发明重组干扰素(rSIFN-co)治疗丙型肝炎的疗效观察

(一)入选标准

1.年龄18～65岁；

2.HCV抗体持续阳性；

3.ALT≥1.5倍正常值上限(ULN)，且持续6个月以上。

(二)疗效判断

参考干复津治疗丙型肝炎的判断标准，根据随访结束时血清ALT水平是否恢复正常，HCV-RNA是否转阴，将疗效分为三级：

完全应答：ALT复常、HCV-RNA阴转

部分应答：ALT复常、HCV-RNA未阴转

无应答：ALT未复常、HCV-RNA未阴转

其中，完全应答和部分应答者判断为显效病例。

(三)临床治疗效果

与治疗乙型肝炎试验同时进行的用rSIFN-co治疗丙型肝炎患者46例，每次9μg肌肉注射，每48小时1次，连续注射24周。治疗后26患者有临床效果(56.52％)，其中12例HCV-RNA转为阴性(26.09％)，26例肝功恢复正常(56.52％)。

例十五

本发明重组干扰素(rSIFN-co)用于肿瘤临床治疗的实例

患者1根据华西第二医院于2004年7月14日出具的肿瘤类检测报告单，一名卵巢半乳腺癌患者的血清CA-125＞600U/ml，CA-153＞250U/ml，并检测到2000ml的腹水，7月16日，患者腹水中查见恶性肿瘤细胞及低分化腺癌细胞，同时乳腺查见癌细胞及坏死物。该患者开始接受rSFIN-co肌注治疗，于7月14日，7月16日，7月18日，7月20日和7月22日分别注射了15μg的rSFIN-co，并于7月22日接受化疗。8月3日，患者接受腹腔手术，根据临床经验，预计腹腔中会有超过2000ml的腹水，但是仅检测到200ml的腹水。8月4日，患者进行手术后组织切片检查为卵巢浆液性囊腺癌，卵巢左右两侧和淋巴结癌变，其他器官正常，术后以rSFIN-co结合化疗进行治疗，乳腺未进行手术。12月27日出具的肿瘤类检查报告单显示血清CA-125降到5U/ml，而CA-153则降低到13U/ml。患者于2005年2月25日在第三军医大学附属大坪医院PET中心接受PET检查，报告单诊断显示患者全身及脑FDE-PET显像未见异常FDG代谢增高或减低区，乳腺病兆消失，完全恢复到正常水平，未见转移及复发。关于该患者的详细诊断报告结果，请参见附图16A到16H。

由该名卵巢半乳腺癌患者使用rSFIN-co治疗前后的肿瘤类检测报告单数据对比和病理报告单的诊断结果对比，可证明：在施以rSFIN-co进行治疗后癌细胞未转移及复发。

患者2一名患者被确诊为肾癌后半个月内，接受了3次9μg的rSFIN-co注射和3次15μg的rSFIN-co注射。此半个月后，他每天接受24μg的rSFIN-co注射，共持续45天。经过该疗程的治疗后，肾活组织检查显示癌细胞没有转移。患者再通过手术等方式进行综合治疗康复后，每隔半年，接受一个月的rSFIN-co肌肉注射，共注射15次，每次15μg，至今健在，未见复发。

例十六

一、新型基因本发明重组干扰素(rSIFN-co)体外抗SARS病毒试验

一、实验材料：

1、药品：新型基因本发明重组干扰素，每支9μg。四川辉阳生命工程股份有限公司提供，批号20020501；

2、细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero E6)，由军事医学科学院微生物流行病研究所分子生物学研究室提供；

3、病毒：SARS病毒，BJ-01株，由军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室提供；

4、细胞培养液：含10％胎牛血清的DMEM培养液。

二、实验的基本条件：病毒测定在生物安全三级实验室。

三、实验方法：

1、CPE法测定病毒对Vero-E6细胞半数毒性浓度(TCID50)

Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×104个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层，加入10倍稀释9个浓度的病毒培养液，每浓度4孔，37℃，5％CO2温箱培养。每天用显微镜观察细胞病变(CPE)。细胞病变在25％以下为+，26-50％病变为++，51-75％病变为+++，76-100％病变为++++。记录细胞病变程度(CPE)。用Reed-Muench法计算病毒半数感染剂量(TCID50)。

2、药物对细胞毒性的测定：

Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×104个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层。药物设5个浓度即36、18、9、4.5、2.259μg/ml(终浓度)，每浓度4孔。设正常细胞对照。每天观察给药组细胞病变，观察到5天，确定药物的无毒浓度。

3、CPE法测定药物抗病毒活性：

Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×104个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层。将最大无毒浓度以下的药物对倍稀释5个浓度，分别加入细胞板中，每孔100μl，37℃，5％CO2温箱培养24h后，再分别加入不同稀释度的病毒(10-3、10-4、10-5)，共同培养48-72h，观察细胞病变CPE(细胞病变在25％以下为+，26-50％为++，51-75％为+++，76-100％为++++，正常细胞为-)，每个稀释度设4个孔，并设正常细胞对照、药物对照和不同稀释度(10-3、10-4、10-5)的病毒对照，每天观察，待病毒对照出现细胞明显病变时，判定干扰素抗病毒的效应。试验重复1次。用Reed-Muench法计算药物的半数有效浓度IC50。

四、实验结果：

1、病毒毒力测定：病毒的TCID50是10-8。

2、药物对细胞毒性的测定：本发明重组干扰素对细胞的无毒浓度为18g/ml，在此浓度下细胞形态与正常对照相同，没有出现病变。

3、药物的抗病毒作用：试验结果见表1和表2。

表1、本发明重组干扰素对SARS病毒的作用(实验一)

  干扰素浓度  μg/ml  不同浓度的病毒引起的细胞病变(CPE)  10-3  10-4  10-5  18  -  -  -  9  -  -  -  4.5  ++  -  -  2.25  +++  ++  -  1.125  +++  ++++  ++  病毒对照  ++++  ++++  +++  细胞对照  -

  药物对照-

表2、本发明重组干扰素对SARS病毒的作用(实验二)

  干扰素浓度  μg/ml  不同浓度的病毒引起的细胞病变(CPE)  10-3  10-4  10-5  18  -  -  -  9  -  -  -  4.5  +  -  -  2.25  +++  ++  -  1.125  ++++  ++++  ++  病毒对照  ++++  ++++  ++++  细胞对照  -  药物对照  -

五、结论：

本发明重组干扰素对细胞的无毒浓度为18g/ml。当病毒浓度为10-5(1000TCID50)、10-4(10000TCID50)和10-3(100000TCID50)时，干扰素的IC50分别为1.27、2.25和4.04μg/ml(表3)。

表3、干扰素对不同浓度病毒的半数有效浓度

  病毒稀释度  IC50g/ml  10^-3  4.04  10^-4  2.25  10^-5  1.27

二、本发明重组干扰素(rSIFN-co)和注射用干扰素α-2b体外抗SARS病毒试验

1.实验材料：

药品：本发明重组干扰素，四川辉阳生命工程股份有限公司提供，618μg/ml；安福隆(注射用重组干扰素α-2b)，天津华立达生物工程有限公司产品，30μg/支(300万单位IU/支)，批号20030105。

细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero E6)，由军事医学科学院微生物流行病研究所分子生物学研究室提供；

病毒：SARS病毒，BJ01株，由军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室提供；

实验的基本条件：病毒测定在生物安全三级实验室。

2.实验方法：

2.1.CPE法测定病毒对Vero E6细胞半数感染浓度(TCID50)

Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×104个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层，加入10倍稀释9个浓度的病毒培养液，每浓度4孔，设细胞对照，37℃，5％CO2温箱培养。每天用显微镜观察细胞病变(CPE)。细胞病变在25％以下为+，26-50％病变为++，51-75％病变为+++，76-100％病变为++++。记录细胞病变程度。用Reed-Muench法计算病毒半数感染剂量(TCID50)。

2.2.MTT法测定干扰素对细胞的半数毒性浓度(TC50)：

Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×104个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层。吸去上清，分别加入不同稀释浓度的两种干扰素，每浓度4孔，设细胞对照。观察5天后加MTT染色4h，吸去液体加DMSO溶解0.5h，酶联检测仪测定OD570nm吸收值，用Reed-Muench法计算TC50。

2.3.MTT法测定干扰素的抗病毒活性：

Vero E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2×104个/孔，37℃培养24h，细胞长成单层。药物从最大无毒浓度向下5倍稀释共5个浓度，每浓度4孔，加入细胞板中，每孔100μl，37℃，5％CO2温箱培养24h后，吸去干扰素液，加入不同稀释度的病毒(10000、1000、100TCID50)，每个稀释度加4个孔，并设正常细胞对照、药物对照和不同稀释度(10000、1000、

100TCID50)的病毒对照，37℃，5％CO2培养48～72h，待病毒对照出现细胞明显病变时，记录细胞病变结果(细胞病变在25％以下为+，26～50％为++，51～75％为+++，76～100％为++++，正常细胞为-)，MTT染色法测定细胞活性，判定干扰素抗病毒的效应。试验重复3次，用Reed-Muench法计算药物的半数有效浓度IC50。

3.实验结果：

3.1.病毒TCID50测定：SARS病毒Vero E6细胞的TCID50为10-7。

3.2.干扰素对Vero E6细胞半数毒性浓度(TC50)的测定：本发明重组干扰素的无毒浓度为100μg/ml，注射用重组干扰素α-2b的无毒浓度为12.5μg/ml，在此浓度下细胞形态与正常对照相同；本发明重组干扰素的TC50为139.18μg/ml，注射用重组干扰素α-2b的TC50为17.18μg/ml，结果见表1。

表1、干扰素对Vero E6细胞半数毒性浓度(TC50)测定结果

  干扰素  TC₅₀(μg/ml)  实验一  实验二  实验三  均值(X±SD，n＝3)  本发明重组干扰素  干扰素α-2b  141.42  17.68  125.96  15.75  150.08  18.10  139.18±12.22  17.18±1.25

3.3.干扰素的抗病毒活性测定：两种干扰素在体外均有保护细胞抗SARS病毒活性，三次实验结果见表2，治疗指数(TI)结果见表3。

表2、干扰素抗SARS病毒活性测定结果

  干扰素  病毒浓度  (TCID₅₀)  TC₅₀(μg/ml)  实验一  实验二  实验三 均值(X±SD，n＝3)  本发明重组干扰素  干扰素α-2b  10000  0.79  5.04  1.04  4.56  0.93  4.65 0.92±0.12 4.75±0.25  本发明重组干扰素  干扰素α-2b  1000  0.19  1.18  0.18  1.19  0.18  1.12 0.18±0.01 1.16±0.04  本发明重组干扰素  干扰素α-2b  100  0.08  0.33  0.10  0.21  0.11  0.30 0.10±0.02 0.28±0.06

表3、干扰素抗SARS病毒活性测定结果

  干扰素  病毒浓度  (TCID₅₀)  TC₅₀(μg/ml)  IC₅₀(μg/ml)      TI  (TC₅₀/IC₅₀)

  本发明重组干扰素  干扰素α-2b  10000  139.18  17.18  0.92  4.75  151.28  3.62  本发明重组干扰素  干扰素α-2b  1000  139.18  17.18  0.18  1.16  773.22  14.78  本发明重组干扰素  干扰素α-2b  100  139.18  17.18  0.10  0.28  1391.80  61.36

4.结论：

体外实验显示本发明重组干扰素和注射用重组干扰素α-2b均对Vero E6细胞有保护作用，具有抗SARS病毒活性。三次实验测定本发明重组干扰素对10000、1000和100 TCID50 SARS病毒的半数抑制浓度(IC50)分别为0.92、0.18和0.10μg/ml，治疗指数为151.28、773.32和1391.80；注射用重组干扰素α-2b对10000、1000和100TCID50SARS病毒的半数抑制浓度(IC50)分别为4.75、1.16和0.28μg/ml，治疗指数为3.62、14.78和61.36。

重要的是，以上两个实验(见以上例11A及11B)皆证明虽然rSIFN-co的抗SARS使用剂量是临床上使用的干扰素α-2b的1/5，其治疗指数(TI)却是干扰素α-2b的50倍。(见：本发明重组干扰素和注射用干扰素α-2b体外抗SARS病毒试验—军事医学科学院微生物流行病研究所)

已有3万支rSIFN-co喷雾剂用于四川省的一线护士、医生及高危人群，结果四川省无—名护士及医生感染SARS。

例十七

本发明重组干扰素(rSIFN-co)对流感病毒抑制作用试验

用细胞病变抑制法检测本发明重组干扰素(rSIFN-co)对流感病毒的抑制。

一、实验材料

10日龄鸡胚尿囊膜细胞               自备

本发明重组干扰素                   四川省生物工程研究中心

流感病毒

DMEM                               GIBCO

新生小牛血清                       兰州明海生命

96孔细胞培养板                     NUNC

CO₂孵箱

洁净工作台

倒置照相生物显微镜

二、实验方法

于对数生长期的10日龄鸡胚尿囊膜细胞，用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，苔盼兰染色计数，用DMEM调细胞浓度为2.5×105个/ml备用。

于96孔细胞培养板中加入上述细胞悬液100μl/孔，置37℃、5％CO₂培养，次日即生长为单层。

弃上清，每孔加入经预先稀释的不同浓度重组高效复方干扰素100μl/孔，同时设无干扰素对照及细胞对照。置37℃、5％CO₂培养约18～20Hr。

实验孔及无干扰素对照孔，每孔均加入经预先稀释的不同浓度流感病毒液100μl/孔，细胞对照孔不加病毒液DMEM 100μl/孔，仅加入置37℃、5％CO₂培养约24Hr。

培养24Hr后倒置照相生物显微镜观察照相。

三、实验结果

镜下观察发现，无干扰素对照组孔细胞出现明显细胞病变特征，如园缩、折光性下降、伴脱落现象等；而实验孔细胞在重组高效复方干扰素浓度≥1ong/ml时，则无细胞病变特征；细胞对照孔细胞无病变特征。见附图13。

四、实验结论

本发明重组干扰素(rSIFN-co)能抑制流感病毒对鸡胚尿囊膜细胞感染。rSIFN-co对流感病毒具有极好的抑制作用。

例十八

本发明重组干扰素(rSIFN-co)对埃博拉病毒(Ebola)抑制作用试验

埃博拉病毒扎伊尔病毒可以引起严重的出血热，并有着很高的死亡率，目前尚没有有效的治疗手段。

一、实验材料

1、试验动物：BALB/c小鼠，60只。

2、试验药品：本发明重组干扰素(rSIFN-co)，由四川省生物工程研究中心提供。

二、实验方法

将60只BALB/c小鼠随机分组，每组10只，共6组，分别为病毒感染后当天、第1、第2、第3、第4天开始给药本发明重组干扰素组和对照组，依次给以上小组编号为：组1，组2，组3，组4，组5，组6。分别给每只小鼠注射埃博拉病毒。在注射埃博拉病毒当天及注射病毒后第1、第2、第3、第4天开始分别给组1，组2，组3，组4，组5给药rSIFN-co，给药方式，皮下注射，剂量，1μg，连续给药6天。

三、实验结果

结果表明，所有对照组小鼠死于埃博拉病毒感染，而所有于注射病毒后当天和第1、第2天给药rSIFN-co的小鼠都存活，没有观察到毒性反应。在注射病毒后第3、第4天才开始给药rSIFN-co的，则药物起不到完全保护作用。

例十九

本发明重组干扰素(rSIFN-co)对艾滋病病毒抑制作用试验

一、实验材料

wild-type HIV(野生性HIV病毒)

Drug Resistant HIV(变异耐药性HIV病毒)

293-CD4-CCR5细胞

DMEM                               GIBCO

胎牛血清                           GIBCO

本发明重组干扰素                   四川省生物工程研究中心

96孔细胞培养板                     NUNC

CO₂孵箱

洁净工作台

荧光分光光度计

紫外分光光度计

二、实验方法

取处于对数生长期的293-CD4-CCR5细胞，用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，苔盼兰染色计数，用DMEM调细胞浓度为2.0×105个/ml备用。

于96孔细胞培养板中加入上述细胞悬液100μl/孔，置37℃、5％CO₂培养，次日生长达孔底面积的70％左右。

弃上清，每孔加入经预先稀释的不同浓度重组高效复方干扰素100μl/孔，同时设无干扰素对照(PBS对照)。及细胞对照(营养液对照)。置37℃、5％CO₂培养约18～20Hr。

实验孔及无干扰素对照孔，分别加入经预先稀释的不同浓度的型野生型HIV及耐药性HIV病毒液100μl/孔，细胞对照孔不加病毒液仅加入DMEM 100μl/孔，置37℃、5％CO₂培养约24Hr。

按常规检测相关虫荧光蛋白酶活性。同时测定细胞破碎上清的蛋白浓度，荧光素酶活性用RLU/mg表示。

三、实验结果

以所检测的荧光素酶活性为纵坐标，本发明重组干扰素浓度为横坐标，用EXCEL软件作柱形图分析处理。发现本发明重组干扰素浓度≥4ng/ml时实验组荧光素酶活性明显低于PBS和营养液对照组，且呈剂量依赖关系。试验结果见附图14-A、14-B。

本发明重组干扰素抗艾滋病病毒活性测定结果

  本发明重组  干扰素  相关荧光素酶活性  野生性HIV传染性抑制  变异耐药性HIV传染性  培养基  1ug/ml  500ng/ml  250ng/ml  125ng/ml  62.5  31ng/ml  15ng/ml  7.5ng/ml  4ng/ml  PBS  培养基  13500+2000  3000+200  3000+600  3400+400  4300+200  4300+400  5000+800  7200+400  7000+800  9000+2000  13000+3000  16000+3600  18000+2000  2800+800  2800+900  4000+600  4100+600  4100+1000  5100+800  6000+1500  7700+1300  8900+2000  15100+2300  19000+2500

四、实验结论

本发明重组干扰素(rSIFN-co)对野生性HIV病毒和变异耐药性HIV病毒具有极好的抑制作用。

                         序列表

<110>辉阳科技美国公司

四川省生物工程研究中心

<120>一种干扰素及其应用

<130>FI-0500  -59

<160>11

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>504

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>编码一种已知共有干扰素(干复津)的氨基酸序列的核苷酸序列

<400>1

atgtgcgacc tgccgcagac ccactccctg ggtaaccgtc gtgctctgat cctgctggct    60

cagatgcgtc gtatctcccc gttctcctgc ctgaaagacc gtcacgactt cggtttcccg    120

caggaagaat tcgacggtaa ccagttccag aaagctcagg ctatctccgt tctgcacgaa    180

atgatccagc agaccttcaa cctgttctcc accaaagact cctccgctgc ttgggacgaa    240

tccctgctgg aaaaattcta caccgaactg taccagcagc tgaacgacct ggaagcttgc    300

gttatccagg aagttggtgt tgaagaaacc ccgctgatga acgttgactc catcctggct    360

gttaaaaaat acttccagcg tatcaccctg tacctgaccg aaaaaaaata ctccccgtgc    420

gcttgggaag ttgttcgtgc tgaaatcatg cgttccttct ccctgtccac caacctgcag    480

gaacgtctgc gtcgtaaaga ataa                                           504

<210>2

<211>167

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>一种共有干扰素(干复津)的氨基酸序列

<400>2

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu

1                 5               10                      15

Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys

            20              25                      30

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln

        35                  40                  45

Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln

    50                  55                  60

Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu

65                  70                  75                  80

Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp

                85                  90                  95

Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu

            100                 105                 110

Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile

        115                 120                 125

Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val

    130                 135                 140

Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln

145                 150                 155                 160

Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>3

<211>507

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>一种编码rSIFN-co的核苷酸序列

<400>3

atgtgtgatt tacctcaaac tcattctctt ggtaaccgtc gcgctctgat tctgctggca    60

cagatgcgtc gtatttcccc gtttagctgc ctgaaagacc gtcacgactt cggctttccg    120

caagaagagt tcgatggcaa ccaattccag aaagctcagg caatctctgt actgcacgaa    180

atgatccaac agaccttcaa cctgttttcc actaaagaca gctctgctgc ttgggacgaa    240

agcttgctgg agaagttcta cactgaactg tatcagcagc tgaacgacct ggaagcatgc    300

gtaatccagg aagttggtgt agaagagact ccgctgatga acgtcgactc tattctggca    360

gttaaaaagt acttccagcg tatcactctg tacctgaccg aaaagaaata ttctccgtgc    420

gcttgggaag tagttcgcgc tgaaattatg cgttctttct ctctgtctac taacctgcag    480

gagcgtctgc gccgtaaaga ataatag                                        507

<210>4

<211>108

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用于PCR合成rSIFN-co的5’-端280bp片段的正向引物

<400>4

atgtgcgacc tgccgcagac ccactccctg ggtaaccgtc gtgctctgat cctgctggct    60

cagatgcgtc gtatctcccc gttctcctgc ctgaaagacc gtcacgac                 108

<210>5

<211>108

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用于合成rSIFN-co cDNA 5’-端280bp片段的模板

<400>5

ctgaaagacc gtcacgactt cggtttcccg caggagaggt tcgacggtaa ccagttccag    60

aaagctcagg ctatctccgt tctgcacgaa atgatccagc agaccttc                 108

<210>6

<211>103

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用于PCR合成rSIFN-co的5’-端280bp片段的反向引物

<400>6

gctgctggta cagttcggtg tagaattttt ccagcaggga ttcgtcccaa gcagcggagg    60

agtctttggt ggagaacagg ttgaaggtct gctggatcat ttc                      103

<210>7

<211>103

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用于PCR合成rSIFN-co的3’-端268bp片段的正向引物

<400>7

atccctgctg gaaaaattct acaccgaact gtaccagcag ctgaacgacc tggaagcttg    60

cgttatccag gaagttggtg ttgaagaaac cccgctgatg aac                      103

<210>8

<211>106

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用于PCR合成rSIFN-co的3’-端268bp片段的反向引物

<400>8

gaagaaaccc cgctgatgaa cgttgactcc atcctggctg ttaaaaaata cttccagcgt    60

atcaccctgt acctgaccga aaaaaaatac tccccgtgcg cttggg                   106

<210>9

<211>112

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用于PCR合成rSIFN-co的3’-端268bp片段的模板

<400>9

ttattcttta cgacgcagac gttcctgcag gttggtggac agggagaagg aacgcatgat    60

ttcagcacga acaacttccc aagcgcacgg ggagtatttt ttttcggtca gg            112

<210>10

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用于将rSIFN-co 5’-段280bp片段和rSIFN-co 3’-段268bp片段连接起来的引物

<400>10

atcggccata tgtgcgacct gccgcagacc c                                 31

<210>11

<211>40

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用于将rSIFN-co 5’-段280bp片段和rSIFN-co 3’-段268bp片段连接起来的引物

<400>11

actgccaggc tgcagttatt ctttacgacg cagacgttcc                        40

                                                                       。