一种新型α－黑素细胞刺激素类似物及其用途

摘要

本发明涉及医药技术领域，是一种新型α－黑素细胞刺激素类似物，其化学结构式为Ac－Ser－Ser－Ile－Nle－Gln－His－DPhe－Arg－Trp－Gly－Lys－Pro－Val－NH2。经体外细胞实验和动物体内实验，证明具有良好的抗炎作用。因此，可用于制备抗炎药物。

说明书

                          技术领域

本发明涉及医药技术领域，是α-黑素细胞刺激素的类似物以及将其用于制备抗炎药的用途。

                          背景技术

α-黑素细胞刺激素(α-Melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)来源于阿黑皮素原(POMC)，是一种由十三个氨基酸构成的直链神经内分泌免疫调节肽。其化学结构式为Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂。α-黑素细胞刺激素通过黑皮质激素受体(MC1-R、MC3-R、MC4-R、MC5-R)发挥作用。其中MC1-R和MC5-R主要介导炎症抑制和免疫调节作用，MC3-R和MC4-R主要参与饮食、体重以及能量代谢平衡的调节。在抗炎方面，α-MSH不仅对多种炎性介质的产生和效应有下调作用(Rajora N，Boccoli G，Burns D，et al.Alpha-MSH modulates local and circulating tumor necrosis factor-alpha inexperimental brain inflammation.J Neurosci，1997；17(6)：2181-2186)，而且能上调抗炎因子如IL-10的产生(Bhardwaj RS，Schwartz A，Becher E，et al.Pro-opiomelanocortin-derived peptides induce IL-10production in human monocytes.J.Immunol，1996；156：2517-2521)。国外和我们以往的研究均显示，α-MSH对实验性致死性内毒素血症、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)有显著的保护作用，能明显减少肺、心、肝、肾、脑等脏器的炎症反应，降低死亡率。在内毒素休克患者体内，血清α-MSH浓度下降，而恢复期的患者α-MSH浓度上升。至今未发现有蓄积毒性，与糖皮质激素比较有其明显的优越性(Catania A，Cutuli M，Garofalo L，et al.Plasma concentrations and anti-L-cytokineeffects of alpha-melanocyte stimulating hormone in septic patients.Crit Care Med.2000；28(5)：1403-1407)。α-MSH能方便地经静脉、皮下、腹腔、吸入等途径进入机体，用量容易精确控制，便于临床使用。但是作为体内小分子调节多肽，α-MSH本身也存在缺点，其对MC1-R和MC3-R有较高的选择性，对MC4-R和MC5-R的亲和力很低。[Nle⁴，D-Phe⁷]α-MSH(NDP-MSH)是较为理想的α-MSH类似物之一，具有高效、作用持续时间长、蛋白水解酶抵抗性强、稳定性高、可溶性好等优点，已用于I期临床试验，但是其对受体的选择性不高，且有明显的色素沉着作用。

                          发明内容

本发明提供一种对MC1-R和MC5-R有高选择性、抗炎效果好的α-黑素细胞刺激素类似物。本发明在InsightII软件的支持下进行3D分子模拟，对α-MSH结构进行如下修饰：2Ser取代2Tyr，3Ile取代3Ser，4Nle取代4Met，5Gln取代5Glu，7DPhe取代7Phe。序列为Ac-Ser-Ser-Ile-Nle-Gln-His-DPhe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂。经体外体内实验，证明其抗炎效果明显高于α-MSH，在不少评价指标上(IL-1β、肝和肺的病理表现)，作用强于NDP-MSH。因此可用于制备抗炎药物。

                          附图说明

图1 THP-1细胞经不同处理后TNF-α的分泌水平曲线图

图2 不同处理后内毒素休克小鼠的生存时间曲线图

图3 不同处理后内毒素休克小鼠血清中TNF-α水平柱状图

图4 不同多肽处理后内毒素休克小鼠血清中IL-1β水平柱状图

图5 不同多肽处理后内毒素休克小鼠血清中NO水平柱状图

                        具体实施方式

现结合实施例，对本发明作详细描述。

本发明新型α-黑素细胞刺激素类似物的制备委托吉尔生化有限公司完成合成。

实施例1 体外细胞抗炎实验

复苏人单核细胞株THP-1细胞(购自ATCC)，用RPMI1640完全培养液(内含10％胎牛血清)于37℃中培养。接种5×10⁵细胞/孔到24孔组织培养板，加入100nM PMA(拂波脂)，3天后换液。加入10ng/ml LPS(脂多糖)刺激同时加入50nMα-MSH(购自Sigma公司)、NDP-MSH(购自Sigma公司)、新型α-黑素细胞刺激素类似物至相应的孔中，每个样本设3个复孔。12，24，36，48小时后收集上清，测定TNF-α。结果见图1，由图1可见，经LPS刺激后，THP-1细胞的TNF-α分泌量明显增加，达3000pg/ml以上。α-MSH、NDP-MSH有效地抑制TNF-的分泌。α-MSH能降低TNF-α水平30％，新型α-黑素细胞刺激素类似物能降低TNF-α水平40-50％(P＜0.01)，其中新型α-黑素细胞刺激素类似物和NDP-MSH的作用无显著差异(P＞0.05)。

实施例2 亲和力的测定

实验前48h将稳定表达hMCRs(人类黑皮质素受体)的HEK-293细胞以5×10⁴/孔密度在24孔板中培养，长至90-95％单层时，除去培养基，用洗涤缓冲液(50mM Tris/HCl，100mM NaCl，50mM KCl，2mM CaCl₂，pH7.2)洗涤2遍。设对照组选用不表达MCRs的HEK-293细胞，在每孔中加入结合缓冲液0.25m1(50mM Tris/HCl，100mM NaCl，50mM KCl，2mM CaCl₂，，5％Hanks’balanced salt solution，0.5％BSA，pH7.2)。加入终浓度为40pmol/L的[¹²⁵I]-NDP-MSH，每孔中加入不同浓度的未标记配体，各浓度做3孔平行测定。在非特异性组中加入10^-5mol/L，在总结合组中不加未标记配体，置37℃孵育2h，0℃放置15min，用0.5ml 10℃的结合缓冲液洗涤2遍，用0.5ml 0.05M NaOH从平板中消化细胞至终体积1ml。γ-计数器测其放射性。将数据输入计算机，采用GraphPad Prism分析IC₅₀值。根据公式K_i＝IC₅₀/{1+([L]/K_D)}计算K_i值，数据用均数±标准误(X±SE)表示。结果见表1，由表1可见本发明新型α-黑素细胞刺激素类似物对受体的选择性顺序为MC1-R＞MC5-R＞MC4-R＞MC3-R，对MC1-R和MC5-R有较高的选择性。尤其是对MC5-R表现出较强的亲和力，是α-MSH的4000倍，NDP-MSH的4倍。

                表1 α-MSH及其类似物的K_i值(mol/L)

配体 MC1-R MC3-R MC4-R MC5-Rα-MSH 0.255±0.067 38.756±4.780 1080±130 8270±740NDP-MSH 0.096±0.008 0.578±0.023 5.760±0.680 8.347±0.720新型α-黑素细胞刺激素类似物 0.159±0.040 35.430±6.743 19.293±2.780 2.230±0.670

实施例3 新型α-黑素细胞刺激素类似物对内毒素休克小鼠的保护作用

根据Galanos的方法，以PBS缓冲液溶解LPS及D-Gal(右旋半乳糖苷)，每只小鼠腹腔注射1μg LPS和20mg D-Gal，建立内毒素休克小鼠模型。将BALB/c小鼠随机分成5组(A～E组)，每组10只。A组：PBS腹腔注射作为对照组；B组：1μg LPS和20mg D-Gal腹腔注射；C组：1μg LPS和20mg D-Gal腹腔注射后30min内腹腔注射α-MSH，2.5mg/kg。D组：1μg LPS和20mg D-Gal腹腔注射后30min内腹腔注射NDP-MSH，2.5mg/kg。E组：1μg LPS和20mg D-Gal腹腔注射后30min内按2.5mg/kg腹腔注射新型α-黑素细胞刺激素类似物。于峰值时间采取小鼠眼眶血，收集上清分别测定TNF-α、IL-1β、NO。观察生存情况，做常规组织病理检查。结果表明：如图2所示本发明新型α-黑素细胞刺激素类似物延长内毒素休克小鼠存活时间，中位生存时间为32h，较α-MSH延长8h。根据统计学检验，C组、D组、E组与B组的生存率相比有明显差异(P＜0.01)。C组、D组与E组之间无明显差异(P＞0.05)。如图3所示给予LPS后小鼠血清中TNF-α水平增加至2000pg/ml以上，各处理组(C组～E组)的TNF-α水平均降低(P＜0.01)。其中经NDP-MSH处理的小鼠TNF-α水平最抵，C组和E组无显著差异(P＞0.05)。如图4所示，腹腔注射LPS后血清中IL-1β水平升高，E组小鼠的IL-1β水平最低(P＜0.01)，D组和E组有差异(P＜0.05)。如图5所示腹腔注射LPS后血清中NO升高显著至50μMol/L以上，各处理组(C组～E组)均能降低NO水平(P＜0.01)。E组可降低NO 69％，至20μmol/L以下。统计分析三组作用相当(P＞0.05)。组织病理学观察可见，给予LPS 6h后小鼠心肌纤维排列紊乱，间质血管及毛细血管扩张充血；肝细胞浑浊、水样变性，点状坏死，肝窦和中央静脉淤血；肺间质水肿及大量炎性细胞浸润；脾窦扩张充血，脾索增宽，脾索内淋巴细胞增生明显；肾和脑的病理改变不明显。给予LPS 30min后分别腹腔注射α-MSH、NDP-MSH、新型α-黑素细胞刺激素类似物，各主要脏器的病理损害与仅给予LPS组比较，6h尚无明显改善，24h后逐渐改善。48h光镜下显示，C组心肌纤维排列整齐，间质血管仍有充血，间质血管充血减；肝小叶结构存在，肝细胞空泡变性，肝窦淤血；脾窦充血减轻，脾索内淋巴细胞仍有增生；肺泡壁结构正常，肺泡壁及间质血管轻度扩张、充血。D组的病理损害较C组改善，心肌间质无明显充血；肝细胞依然空泡变性，肝窦淤血减轻；脾窦充血减轻；肺间质炎性细胞浸润减轻，血管无明显扩张充血。E组心肌纤维排列较整齐，间质血管充血减轻；肝小叶结构完整，肝细胞无变性，肝窦无明显淤血，基本正常；脾窦无明显充血；肺泡壁结构正常。

综上所述，本发明新型α-黑素细胞刺激素类似物是一种对MC1-R和MC5-R有高选择性的激动剂，通过加强对MC5R的亲和力和MC5R介导的生物学效应协同发挥抗炎作用，而对MC1-R的选择性不如NDP-MSH。因此若慢性炎症长期给予时，本发明新型α-黑素细胞刺激素类似物较之NDP-MSH的色素沉着作用则有其优越性。新型α-黑素细胞刺激素类似物对免疫应答介导的炎症如器官移植排斥、自身免疫性疾病等也有较好的治疗效果和应用前景。因此，本发明新型α-黑素细胞刺激素类似物可用于制备抗炎药物。