摘要:根据GenBank上发表的犬瘟热病毒(CDV)毒株序列设计一对跨越核衣壳(N)蛋白编码区的引物,采用RT-PCR扩增CDV南京分离株(CDV-NJ15)N基因,并将其插入到pMD 18-T中,构建克隆载体pMD-N。对克隆载体pMD-N进行双酶切,将得到的CDV-NJ15 N基因定向克隆到pcDNA3.1(-)真核表达质粒中,通过磷酸钙介导转染COS-7细胞,用SDS-PAGE和Western-blot分别鉴定表达产物的相对分子量及其免疫原性。结果证明获得正向插入的pcDNA-N重组表达质粒,表达产物的相对分子量约58.2kD,与预期值大小一致,且该表达产物能够被CDV-Onderstepoort株的兔血清识别,表明构建的pcDNA-N能在哺乳动物细胞中表达并且具有抗原性。以构建好的CDV N和H基因重组表达质粒pcDNA-N和pcDNA-H为DNA疫苗,分组免疫5-6周龄昆明小鼠,以2周为间隔,共免疫4次,最后一次免疫3周后眼眶采血分离血清,酶联免疫吸附试验(ELISA)和病毒中和试验(SN)分析DNA免疫在小鼠体内诱导的免疫应答。结果显示pcDNA-N和pcDNA-H单独免疫分别激发了10<'2.69±0.149>和10<'2.63±0.147>滴度的ELISA抗体,联合免疫激发了10<'2.93±0.165>滴度的ELISA抗体,低于弱毒疫苗产生的抗体滴度(10<'3.35±0.252>),两者差异显著(p<0.05)。两种质粒单独或联合免疫分别产生了10<'0.903±0.252>、10<'0.963±0.252>和10<'1.204±0.343>的中和抗体,与弱毒疫苗(10<'1.88±0.151>)比较差异极显著(P<0.01)。而空质粒pcDNA3.1(-)免疫后未检测到特异性的抗CDV抗体,表明表达CDV N和H基因的重组质粒DNA免疫小鼠可以诱导产生特异性体液免疫。