一种新的稻瘟病菌糖蛋白激发子及其纯化方法

摘要

本发明以稻瘟病菌菌丝为材料，经培养冻融、匀浆离心，PM－10膜超滤，获得粗激发子。粗激发子冻融后，经系列层析纯化获得一种新的稻瘟病菌糖蛋白激发子，其分子量是49.08kDa，等电点为6.01，达到银染电泳纯。质谱鉴定该激发子是稻瘟病菌MG05155.4开放阅读框推测编码的hypothetical protein MG05155.4。该激发子性质稳定，诱导非亲和性互作水稻品系中苯丙氨酸解氨酶酶活的升高明显高于对亲和性互作品系的诱导，诱导水稻过氧化物酶酶海升高的最低有效浓度是1.5nmol/L。本研究在稻瘟病生物防治中具有良好的应用前景，能够为开发广谱抗病的工程菌株及无公害农药提供新依据。

说明书

技术领域

本发明涉及植物保护和生物技术领域，尤其涉及一种新的稻瘟病菌糖蛋白激发子的纯化。

背景技术

稻瘟病(rice blast disease)由子囊菌Magnaporthe grisea(Hebert)Barr(其无性世代为Pyricularia grisea(Cooke)Sacc.)引起，广泛分布于水稻栽培的国家和地区。它是水稻三大病害之一，严重限制水稻高产、稳产、优质。稻瘟病常年均有不同程度的发生，流行年份一般减产10-20％，严重的达50％以上。90年代以来，我国稻瘟病年发生面积均在380万公顷以上，年均损失稻谷达数亿公斤。

目前对稻瘟病主要采取选育抗病品种和化学防治为主的防治措施。长期的生产实践证明，水稻抗瘟性品种的选育和利用是防治稻瘟病行之有效的措施。但由于稻瘟病菌的遗传背景复杂，易于变异，而抗瘟品种相对单一化，主栽品种的遗传同质性，使抗病育种难以跟上致病性稻瘟病菌生理小种的变异速度，常常导致一个新的具有抗稻瘟性的水稻品种在大面积种植3-5年后就严重感病。化学防治常常造成稻米中农药残留及环境污染，不断引起人们的关注，因此，从深层次揭示水稻抗稻瘟病的本质，寻求更为有效、安全、经济、合理的防治措施是一项急待解决的重要任务。近年来受到广泛关注的激发子研究，为防治稻瘟病提供了新的途径。

激发子是能够诱导植物产生防卫反应的信号分子。在植物与病原物互作系统中，植物通过细胞表面或亚细胞表面组分中的受体分子与病原物激发子结合，启动级联信号系统，调控防卫基因表达，最终表现对病原物的抗病性。激发子诱导抗病性具有无污染、抗病谱广、持续时间长等特点，无疑在稻瘟病的防治中具有广阔的应用前景。

糖蛋白是真菌细胞壁的重要组成成分，稻瘟病菌菌丝细胞壁中获得的糖蛋白具有激发子活性。目前有关稻瘟病菌糖蛋白激发子的研究报道有：Kanoh等(1993)利用Celite535过滤、DEAE-Toyo PEARL650M离子交换柱、凝胶过滤层析等方法，从稻瘟病菌中纯化获得一种分子量为25kDa的糖蛋白激发子，能够诱导活性氧的进发；Schaffrath等(1995)利用超滤、亲和层析等方法从稻瘟病菌中纯化获得分子量为15.6kDa的糖蛋白激发子，活性位点是糖基团；李云峰等(2004)从稻瘟病菌中纯化获得分子量为101.2kDa的糖蛋白激发子。与已报道的这些激发子不同，我们从稻瘟病菌菌丝细胞壁中纯化获得一种新的分子量为49.08kDa，等电点是6.01的糖蛋白激发子，并对其性质及蛋白质鉴定进行了研究。

发明内容

目前国内有关稻瘟病菌糖蛋白激发子的研究除本研究室外，尚未见其它报道。我们从稻瘟病菌ZC₁₃小种菌丝细胞壁提取液中经系列层析，纯化获得一种分子量为49kDa、等电点是6.01的新的糖蛋白激发子，命名为MGJ1(中文名：稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1；汉语拼音：Dao wen bing jun tang dan baiji fa zi MGJ1；英文名：Glycoprotein elicitor MGJ1 isolated fromMaganporthe grisea)，经质谱鉴定是稻瘟病菌70-15染色体III重叠群2954中的MG05155.4开放阅读框推测编码的hypothetical protein MG05155.4。该激发子液体样品-20℃保存半年生物活性无损失，能够诱导不同亲和性互作水稻叶片的抗病相关酶活增强。我们对该激发子的研究旨在为开发广谱抗病的工程菌株及无公害农药提供新依据。

稻瘟病菌糖蛋白激发子中的MGJ1及其纯化方法

(1)稻瘟病菌粗激发子的提取

将活化的稻瘟病菌菌丝体进行液体培养8-10天，纱布过滤，双蒸水反复洗涤3次，冻存于-20℃下。将冻存的菌丝反复冻融5-7次，破碎菌丝细胞。用双蒸水悬浮冻融的菌丝，用高速组织捣碎机12,000r/min反复匀浆5-7次。将匀浆液用磁力搅拌器搅拌10-12小时，离心取上清液。用PM-10膜超滤上清液，所获的浓缩液即为粗激发子。粗激发子经冻融1-2次后，进一步用蛋白层析系统(可以使用Amersham Biosiciences的AKTA Purifier-100全自动蛋白层析系统)进行以下层析步骤。

(2)DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析

用pH7.4的20mmol/LTis-HCl起始缓冲液平衡HiPrep 16/10 DEAE FF离子交换柱2倍柱床体积，流速3mL/min，将粗激发子上样，未结合洗脱2倍柱床体积，用0.75mol/LNaCl梯度洗脱10倍柱床体积，在A280波段检测(A280：蛋白特异吸收峰)。收集各峰，超滤离心管浓缩脱盐，进行水稻幼苗4片叶接种过氧化物酶比活检测，取活性峰，-20℃保存备用。

(3)ConA-Sepharose 4B亲和柱层析

装适量ConA-Sepharose 4B(Pharmacia)填料于XK16/20空柱中，用pH7.4含有0.15mmol/LNaCl、1mmol/LMgCl₂、1mmol/LCaCl₂、1mmol/LMnCl₂的20mmolTris-HCl起始缓冲液平衡，将经DEAE离子交换柱层析获得的活性蛋白峰样上样，在上述起始缓冲液中加入0.15mmol/L的D-甘露糖进行梯度洗脱，收集各峰，超滤离心管浓缩脱盐，进行水稻幼苗4片叶接种过氧化物酶比活检测，取活性峰，-20℃保存备用。

(4)S-100凝胶柱层析获得MGJ1稻瘟病菌糖蛋白激发子

用pH7.4的20mmo/LlTis-HCl起始缓冲液平衡Sephacryl S-100 HighResolution凝胶柱，将经ConA-Sepharose 4B亲和柱层析获得的活性蛋白峰样上样，洗脱1.5倍柱床体积，收集各峰，超滤离心管浓缩脱盐，进行水稻幼苗4片叶接种过氧化物酶比活检测，取活性峰，冻干后于-20℃保存即为稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1。

对所获得的这种新的稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1进行蛋白含量测定(Bradford方法)，糖含量测定(蒽酮-浓硫酸法)，纯度鉴定(SDS-PAGE电泳银染色和高碘酸-Schiff糖染色)，质谱蛋白质鉴定以及诱导寄主水稻抗病性(对过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的诱导)的测定。

稻瘟病菌糖蛋白激发子中的MGJ1的特征特性

用质谱仪(Applied Biosystems Voyager System 4307)测定，稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1的相对分子量是49.08kDa，经薄层等电聚焦电泳测定其等电点为6.01。经质谱(Finnigan LTQ)测试获得肽指纹图谱，在稻瘟病菌蛋白质数据库中分析，鉴定该糖蛋白激发子MGJ1是稻瘟病菌70-15染色体III重叠群2954中的MG05155.4开放阅读框推测编码的hypothetical proteinMG05155.4，氨基酸残基数是449，激发子MGJ1与hypothetical proteinMG05155.4相匹配重叠的肽段质量数是15947.7，占hypothetical proteinMG05155.4总质量数的32.58％。该激发子对C101A51(完全非亲和互作)、C101LAC(高度非亲和互作)、C104PKT(中度非亲和互作)及CO39(亲和互作)4个近等基因系水稻叶片中的抗病相关酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)均具有诱导作用，诱导完全非亲和互作C101A51及高度非亲和互作C101LAC品系的PAL酶活增值分别为127.59％和121.945％，而诱导亲和互作CO39和中度非亲和互作C104PKT品系的PAL酶活增值分别为105.38％和91.72％，诱导非亲和性互作水稻品系中PAL的升高明显高于对亲和性互作水稻品系中的诱导。该激发子诱导水稻POD酶活升高的最低有效浓度是1.5nmol/L。该激发子液体样品-20℃保存半年激发子活性无损失，其性质稳定。

本发明纯化稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1的优点

1、本发明以稻瘟病菌菌丝为原料，原料来源易培养、价格廉，适合开发应用。

2、本发明采用蛋白纯化层析平台(AKTA Purifier-100)，上样、洗脱、收集等步骤自动进行，避免人为等外界影响因素，纯化路线设计合理，重现性稳定。

3、本发明纯化的MGJ1激发子诱导寄主水稻POD酶活增强的最低有效浓度是1.5nmol/L，诱导活性高。液体样品-20℃保存半年激发子活性无损失，性质稳定，利于保存及应用开发。

具体实施方法

将活化的稻瘟病菌菌丝体进行液体培养(液体培养基：酵母浸膏5g；一水葡萄糖22g；补足蒸馏水至1000mL。)，25℃恒温振荡培养8-10天，双层纱布过滤，双蒸水反复洗涤3次，冻存于-20℃下。将冻存的菌丝15℃-25℃解冻，再置于-20℃下冷冻，反复冻融5-7次，充分破碎菌丝细胞。用双蒸水悬浮冻融的菌丝(5mL/g)，用高速组织捣碎机(DS-1组织捣碎机)12,000r/min反复匀浆5-7次。将匀浆液用磁力搅拌器于4℃搅拌10-12小时，10,000g离心30min，取上清液。滤纸过滤上清液，所得滤液用PM-10膜超滤，高纯氮气压力0.45MPa，所获的浓缩液(MW＞10kDa)即为粗激发子，-20℃下保存备用。粗激发子经冻融1-2次后，用全自动蛋白层析系统(AmershamBiosiciences的AKTA Purifier-100)对粗激发子进一步层析纯化：

(1)DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析获得D4活性峰

用pH7.4的20mmol/LTis-HCl的起始缓冲液平衡HiPrep 16/10 DEAE FF离子交换柱2倍柱床体积，流速3mL/min。将粗激发子上样4mL，未结合洗脱2倍柱床体积，用0.75mol/LNaCl梯度洗脱10倍柱床体积，在A280波段检测(A280：蛋白特异吸收峰)。洗脱曲线主要有4个明显的峰(D1、D2、D3、D4)，其中D1、D2峰不能被DEAE-Sepharose FF吸附，而D3、D4峰均能被DEAE-Sepharose FF吸附。收集各峰，超滤离心管浓缩脱盐，经水稻幼苗4片叶接种过氧化物酶比活检测，D4峰具有强激发子活性，收集D4峰尖处的洗脱液(见图1)，-20℃下保存即为D4活性峰样备用。

(2)ConA-Sepharose 4B亲和柱层析获得C2活性峰

装适量ConA-Sepharose 4B(Pharmacia)填料于XK16/20空柱中，用pH7.4、含有0.15mmol/LNaCl、1mmol/LMgCl₂、1mmol/LCaCl₂、1mmol/LMnCl₂的20mmolTris-HCl起始缓冲液平衡，将经DEAE离子交换柱层析获得的D4活性峰样上样2mL，流速0.2mL/min，在上述起始缓冲液中加入0.15mmol/L的D-甘露糖进行梯度洗脱，洗脱曲线主要有2个明显的峰(C1、C2)，C1、C2均不能被ConA-Sepharose 4B吸附。收集各峰，超滤离心管浓缩脱盐，经水稻幼苗4片叶接种过氧化物酶比活检测，C2峰具有强激发子活性，收集C2峰尖的洗脱液(见图2)，-20℃下保存即为C2活性峰样备用。

(3)S-100凝胶柱层析获得S1活性峰即MGJ1稻瘟病菌糖蛋白激发子

用pH7.4的20mmo/LlTis-HCl的起始缓冲液平衡Sephacryl S-100 HighResolution凝胶柱，将经ConA-Sepharose 4B亲和柱层析获得的活性蛋白样品上样1mL，流速0.5mL/min，洗脱1.5倍柱床体积，洗脱曲线主要有2个明显的峰(S1、S2)。经水稻幼苗4片叶接种过氧化物酶比活检测，S1峰具有强激发子活性，收集S1峰尖处的洗脱液(见图3)，超滤浓缩，冷冻干燥，-20℃下保存即获得新的稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1。

稻瘟病菌菌丝体经反复冻融、匀浆、离心、PM-10膜超滤等步骤获得粗激发子。粗激发子经DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析、ConA-Sepharose FF亲和柱层析、S-100凝胶柱层析获得新的稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1。对所获得的稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1进行SDS-PAGE电泳银染色和高碘酸-Schiff法糖染色均显示单一条带(见图4、图5)，表明达到电泳纯。

经Applied Biosystems Voyager System 4307质谱测定，MGJ1分子量为49.07968kDa(见图6)。经薄层等电聚焦电泳测定MGJ1的等电点为6.01(见图7)。经LTQ质谱测试、肽指纹图谱分析鉴定MGJ1是稻瘟病菌70-15染色体III重叠群2954中的MG05155.4开放阅读框推测编码的hypothetical proteinMG05155.4(见图8)，MGJ1与hypothetical protein MG05155.4相匹配重叠的断肽段氨基酸残基数是147个，占总氨基酸残基数的32.74％(见表1，表2)。

稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1对4个近等基因系水稻叶片苯丙氨酸解氨酶PAL酶活均具有诱导作用。MGJ1诱导完全非亲和互作C101A51及高度非亲和互作C101LAC品系的PAL酶活增值升幅较大，分别为127.59％和121.945％，而诱导亲和互作CO39和中度非亲和互作C104PKT品系的PAL酶活增值升幅较小，分别为105.38％和91.72％(见图9)。

将不同浓度(1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)的稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1采用压伤斑法接种不同亲和性互作的水稻叶片，诱导POD酶比活的变化如图10所示，结果表明，10μg/mL及以上浓度的MGJ1激发子均可诱导不同品系的水稻叶片POD酶活的升高，并且随着激发子浓度的升高，诱导活性增强，1μg/mL浓度及其以下的MGJ1处理则不能诱导水稻叶片POD酶活的升高，推测MGJ1激发子诱导活性的有效浓度是1.5nmol。稻瘟病菌糖蛋白激发子，MGJ1液体样品在-20℃下保存半年激发子活性无损失，其性质稳定，利于保存及应用开发。

表1：激发子MGJ1与hypothetical protein MG05155.4相匹配重叠肽段分析

表2：hypothetical protein MG05155.4的氨基酸序列表

说明书附图

图1：稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1 DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析图

图2：稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1 ConA-Sepharose 4B亲和柱层析图

图3：稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1 Sephacryl S-100凝胶柱层析图

图4：稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1的SDS-PAGE电泳银染图谱

图5：稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1的高碘酸-Schiff法糖染色图谱

图6：质谱测定激发子MGJ1的相对分子量图谱横坐标Mass(m/z)为质荷比，纵坐标Intensity为强度。

图7：薄层等电聚焦电泳测定稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1的等电点图谱

图8：稻瘟病菌糖蛋白激发子MGJ1的LTQ质谱图谱横坐标Time为时间，纵坐标Relative为相对丰度。

图9：激发子MGJ1对不同亲和性互作水稻叶片PAL酶活的诱导

图10：不同浓度的激发子MGJ1对水稻叶片POD酶活的诱导

                        表1

  1 MAAPAHKFKV ADLSLAAFGR KEIELAENEM PGLMQTREKY AADQPLKGAR

 51 IAGCLHMTIQ TAVLIETLTA LGAEVTWTSC NIFSTQDHAA AAIAAAGVPV

101 FAWKGETEEE YNWCLEQQLL AFKDGKKLNL ILDDGGDLTH LVHDKYPEML

151 ADCYGVSEET TTGVHHLYKM LKEGKLLVPA INVNDSVTKS KFDNLYGCRE

201 SLVDGIKRAT DVMIAGKIAV VAGYGDVGKG CAMALHGMGA RVIVTEIDPI

251 NALQAAMAGF QVTTMEKAAS VGQIFVTTTG CRDILVGKHF EAMPNDAIVC

301 NIGHFDIEID VAWLKANAKS VQNIKPQVDR FLMANGRHII LLAEGRLVNL

351 GCATGHSSFV MSCSFTNQVL AQIMLYKNND AAFGQKYVEF AKSGKLEKKV

401 YVLPKILDEE VAKLHLAHCN VELSTLTPVQ AEYLSLPAEG PYKPEHYRY

表2序列表

<110>华南农业大学

<120>一种新的稻瘟病菌糖蛋白激发子及其纯化方法

<130>MG

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>449

<212>PRT

<213>Magnaporthe grisea

<400>1

Met Ala Ala Pro Ala His Lys Phe Lys Val Ala Asp Leu Ser Leu Ala

1               5                   10                  15

Ala Phe Gly Arg Lys Glu Ile Glu Leu Ala Glu Asn Glu Met Pro Gly

            20                  25                  30

Leu Met Gln Thr Arg Glu Lys Tyr Ala Ala Asp Gln Pro Leu Lys Gly

        35                  40                  45

Ala Arg Ile Ala Gly Cys Leu His Met Thr Ile Gln Thr Ala Val Leu

    50                  55                  60

Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu Val Thr Trp Thr Ser Cys

65                  70                  75                  80

Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ala

                85                  90                  95

Gly Val Pro Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu Thr Glu Glu Glu Tyr Asn

            100                 105                 110

Trp Cys Leu Glu Gln Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asp Gly Lys Lys Leu

        115                 120                 125

Asn Leu Ile Leu Asp Asp Gly Gly Asp Leu Thr His Leu Val His Asp

    130                 135                 140

Lys Tyr Pro Glu Met Leu Ala Asp Cys Tyr Gly Val Ser Glu Glu Thr

145                 150                 155                 160

Thr Thr Gly Val His His Leu Tyr Lys Met Leu Lys Glu Gly Lys Leu

                165                 170                 175

Leu Val Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe

            180                 185                 190

Asp Asn Leu Tyr Gly Cys Arg Glu Ser Leu Val Asp Gly Ile Lys Arg

        195                 200                 205

Ala Thr Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Ile Ala Val Val Ala Gly Tyr

    210                 215                 220

Gly Asp Val Gly Lys Gly Cys Ala Met Ala Leu His Gly Met Gly Ala

225                 230                 235                 240

Arg Val Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Asn Ala Leu Gln Ala Ala

                245                 250                 255

Met Ala Gly Phe Gln Val Thr Thr Met Glu Lys Ala Ala Ser Val Gly

            260                 265                 270

Gln Ile Phe Val Thr Thr Thr Gly Cys Arg Asp Ile Leu Val Gly Lys

        275                 280                 285

His Phe Glu Ala Met Pro Asn Asp Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His

    290                 295                 300

Phe Asp Ile Glu Ile Asp Val Ala Trp Leu Lys Ala Asn Ala Lys Ser

305                 310                 315                 320

Val Gln Asn Ile Lys Pro Gln Val Asp Arg Phe Leu Met Ala Asn Gly

                325                 330                 335

Arg His Ile Ile Leu Leu Ala Glu Gly Arg Leu Val Asn Leu Gly Cys

            340                 345                 350

Ala Thr Gly His Ser Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln

        355                 360                 365

Val Leu Ala Gln Ile Met Leu Tyr Lys Asn Asn Asp Ala Ala Phe Gly

    370                 375                 380

Gln Lys Tyr Val Glu Phe Ala Lys Ser Gly Lys Leu Glu Lys Lys Val

385                 390                 395                 400

Tyr Val Leu Pro Lys Ile Leu Asp Glu Glu Val Ala Lys Leu His Leu

                405                 410                 415

Ala His Cys Asn Val Glu Leu Ser Thr Leu Thr Pro Val Gln Ala Glu

            420                 425                 430

Tyr Leu Ser Leu Pro Ala Glu Gly Pro Tyr Lys Pro Glu His Tyr Arg

        435                 440                 445

Tyr