与人类遗传性耳聋相关的GJB6突变基因及其在诊断遗传性耳聋中的应用

摘要

本发明涉及具有233C→A杂合突变的GJB6突变基因，此突变基因与人类遗传耳聋相关，本发明还提供了通过检测患者中是否存在该突变基因而诊断耳聋发生的原因和类型的检测方法。该突变基因和检测方法将有利于临床上开展耳聋患者的GJB6突变筛查工作，为耳聋患者的诊断和治疗提供服务。

说明书

技术领域

本发明涉及新的GJB6突变基因，具体地说涉及与人类遗传性耳聋相关的新的GJB6突变基因。

本发明还涉及应用新的GJB6突变基因检测人类遗传性耳聋的检测方法。

本发明还涉及用于检测新的GJB6突变基因的试剂盒。

本发明还涉及新的GJB6突变基因在诊断人类遗传性耳聋中的应用。

背景技术

连接蛋白是形成缝隙连接的蛋白单位，在脊椎动物细胞之间的通讯中起着关键作用，最近几年，研究表明连接蛋白与人类疾病关系密切，连接蛋白基因突变影响许多组织系统，并且同一基因突变与不同的疾病有关系，伴有β-连接蛋白突变的患者可以引起听觉系统，外周神经和皮肤的病变。

缝隙连接位于细胞之间接触的区域，在不同的组织中广泛分布。离子和其他小分子(＜1 kDa)，比如第二信使可以直接通过缝隙连接，在两个细胞的细胞质之间进行交流，所以缝隙连接在细胞间通讯中非常重要。它们包括从几十到上千个跨膜半通道，也称连接小体，这些连接小体与相邻细胞同样的连接小体结合形成亲水性通道，使得细胞相互接触。连接小体由六个跨膜蛋白(即连接蛋白)形成。有20种不同类型的连接蛋白，根据不同的分子量和同源性，可以分成α、β、γ和未分类的。大多数连接蛋白基因成群存在，就像在13号染色体长臂上GJB2、GJB6和GJA3所形成的那样，α和β-连接蛋白基因组结构非常相似，有两个外显子，第一个是非编码区，第二个外显子包含整个编码区。连接蛋白的亚单位可以形成相同或不同的连接小体。因此连接小体可以由相同的连接蛋白形成，也可以由不同的连接蛋白亚单位形成。另外，连接细胞的两个连接小体可以是相同的(同类型通道)，也可以是不同的(杂合类型通道)。

连接蛋白有四个跨膜区，连接蛋白的羧基和氨基端与第二、第三跨膜区之间的环均位于细胞质内。最近电子晶体学研究发现，连接小体中六个连接蛋白的四个跨膜段形成两个同心环。内环形成孔，外环面对细胞膜的脂质层。第三跨膜区和两个细胞外区形成孔壁，前者使通道具有水通透性，后者参与两个细胞连接小体的相互作用。连接蛋白不同区域之间的相互作用对于缝隙连接通道的通透性是至关重要的。连接蛋白序列的主要可变性位于细胞质内区域，参与通道活性的调节。

缝隙连接表现出对分子大小和电荷的选择性，对于形成连接小体的连接蛋白亚单位来说具有特异性。缝隙连接通道的开口可以通过几种因素来调节，一些连接蛋白通过磷酸化，电压、酸化或几种其它因素来调节。缝隙连接通透性的调节有三种不同的形式(快速、中等和长期)，长期调节因素似乎最易受到突变的影响。

内耳中的缝隙连接位于Corti’s器的支持细胞之间，在耳蜗侧壁的细胞中也有发现。已经在所有内耳细胞中检测到有Cx26表达。内耳中的缝隙连接被分成两个系统：上皮细胞缝隙连接系统和结缔组织缝隙连接系统。两种系统对维持内淋巴中K⁺离子高浓度有重要作用，这对于维持听觉系统的正常功能至关重要。Corti’s器毛细胞受到声音刺激后，K⁺离子流入毛细胞中，然后通过缝隙连接返回到内淋巴中，维持内淋巴电位。

对于连接蛋白基因的不同突变是如何引起耳聋的，现在仍然不很清楚。尽管对于隐性遗传的病例，大多数突变导致缺少一定的连接蛋白，有些突变改变了在特定位置的氨基酸，可能会出现显性失活效应。连接蛋白突变会影响耳蜗和Corti’s器缝隙连接的正常模式，可能会导致在缝隙连接中出现不同类型的连接小体(由于Cx30可能仍将存在而形成同类型缝隙连接)，而耳蜗中异常的缝隙连接模式(可能是由于缺少某一种类型的连接蛋白或者存在异常的连接蛋白)会影响K⁺离子循环途径，这将会影响内淋巴电位，最终导致毛细胞失去功能。

GJB6基因在结构上与其它连接蛋白相似，是连接蛋白家族中的一个成员，编码缝隙连接的CX30成分，六个连接蛋白分子组装成半通道或连接小体，与相邻细胞的对应部分组成一个完整的细胞内通道。连接蛋白家族具有高度的序列保守性，有四个跨膜域并由一个细胞质内环和两个细胞外环连接在一起。在已知的突变中可以引起听力下降，但与GJB2相比，所报道的GJB6的突变较少，GJB6基因突变不仅可以引起显性或隐性形式遗传的感音神经性耳聋，而且还与皮肤疾病有关。GJB6和GJB2同在13p12区域，对于定位在此区域的耳聋家系，在GJB2没有发现突变时，就应该考虑在这个区域还有另外一个耳聋基因。Grifa A.等在一个意大利家庭中，发现GJB6(Cx30)的一种错义突变T5M导致常染色体显性遗传性迟发性耳聋，但GJB6的点突变并不是一种引起耳聋的常见的原因，在以色列和法国家系中发现了GJB6大片缺失，但都没有能够确定缺失的具体范围，Castillo等在422个家系中(364个西班牙家系和58个古巴家系)发现了一个包含GJB6的大片段缺失(342Kb)，缺失没有包含GJB2范围内，在一个患有非综合症型语前聋的西班牙家系中有较高的比例，在纯合状态或者伴有GJB2突变时发病。GJB6的这种大片段缺失可能是在婴儿期引起耳聋的一个常见原因。但是在澳大利亚和中国家系中却没有发现这个缺失，提示GJB6大片段缺失可能只是在一定人群中存在。

连接蛋白基因突变的发现开辟了一个令人惊奇的新领域，为耳聋患者打开一扇新的诊断、治疗的大门。现在对于连接蛋白基因突变所引起的疾病分子基础的理解将被用作对耳聋病人及其家庭成员的诊断工具。未来的研究将集中在治疗的发展，能够预见，将对几年以前还没有能够解决的一些慢性疾病制定出预防和治疗措施。

发明内容

本发明的一个目的在于提供与人类遗传性耳聋相关的新的GJB6突变基因，该GJB6突变基因具有233C→A杂合突变，相应的其编码的氨基酸具有A78D的突变位点。

本发明的另一个目的在于提供诊断人类遗传性耳聋的方法，通过检测来自患者的待测样本中是否存在GJB6突变基因233C→A突变而判断该患者耳聋发生的原因及类型，进而为临床诊断和治疗提供参考。

本发明的再一个目的在于提供用于检测GJB6突变(233C→A)基因的试剂盒。

本发明的又一个目的在于提供新的GJB6突变(233C→A)基因在诊断或治疗人类遗传性耳聋中的应用。

根据本发明的一方面，通过在141名各种感音神经性耳聋患者组和150名正常听力对照组中进行筛查，发现一位先天性极重度耳聋患儿与其父亲具有与遗传性耳聋有关的GJB6基因新的突变位点(233C→A，A78D)。这一突变位点在150名对照组中均没有被发现，说明这一突变位点与遗传性耳聋相关。图1给出GJB6编码区氨基酸与核酸碱基的对照图，并示出突变位点。这一突变位点位于GJB6基因的表达产物——连接蛋白Cx30的第二跨膜域(图2)，说明这一位点对于Cx30是非常重要的。通过对不同连接蛋白氨基酸序列进化研究的结果表明，该突变位点具有高度保守性。

根据本发明的另一方面，本发明所提供的诊断人类遗传性耳聋的方法是通过检测来自于患者的待测样本中是否存在GJB6基因233C→A(A78D)突变而判断该患者的耳聋发生原因及类型。

检测该突变可用本领域的任何检测点突变的方法来进行，例如限制性内切酶酶切反应、PCR(聚合酶链反应)-测序法、采用标记的GJB6基因DNA探针杂交法或用限制性片段长度多态性方法等。

在本发明的一个实施方案中，采用PCR扩增-直接测序法来检测样本，具体包括下述步骤：

1)采集待测个体的样本，例如血液、体液或组织，提取DNA；

2)以该DNA为模板，以针对GJB6基因或GJB6基因第233个碱基附近的编码区设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；

3)将得到的PCR产物进行直接测序分析，将所得到的序列与GJB6正常基因的序列进行比较，确定是否存在GJB6突变位点。

4)根据以上结果判断待测个体是否为GJB6基因突变233C→A导致的遗传性耳聋。

进一步的，该方法可以选择性的包括如下步骤：

5)按正常阅读框进行翻译以确定是否存在78A→D Cx30氨基酸突变位点。

在本发明的另一个实施方案中，采用APaI限制性内切酶的酶切反应来检测突变基因，将上述步骤2所得到的PCR反应产物用ApaI进行酶切反应后，琼脂糖电泳检测，正常基因将能被ApaI切开，而突变基因不能被ApaI酶切，由此确定是否存在突变位点；根据检测结果判断待测个体是否为GJB6基因233C→A突变导致的遗传性耳聋。

上述步骤2所得到的PCR反应产物还可以用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的GJB6核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针，以筛查是否存在已被确定的突变。

在上述方法中使用的PCR引物可以依据已知的核苷酸序列设计，通常为15-30个碱基，GC含量为45-50％左右，在适当的温度下与末端特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计。在本发明的一个具体实施例中，应用引物设计软件设计了一对PCR引物，其序列为：

CX30-F：5’-TCAGGGATAAACCAGCGCAAT-3’(nt1916-nt1935)

CX30-R：5’-GTTGGTATTGCCTTCTGGAGAAGA-3’(nt1066-nt1935)

GJB6正常基因的标准序列可以参考例如Genbank NT_009799。

根据本发明的再一方面，本发明进一步提供了用于检测GJB6基因233C→A突变的试剂盒，试剂盒中可以包含以下几种试剂的一种或几种的组合：

从待测样品中提取DNA的试剂；

用于扩增样本DNA中GJB6基因或GJB6基因第233个碱基附近编码区的PCR引物及相应的PCR反应试剂；

对PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切反应的试剂；和/或

对PCR扩增产物进行测序的试剂。

例如，本发明的一个实施方案中提供一个检测GJB6基因233C→A突变的试剂盒，容器内装有用以检测GJB6基因233C→A突变的成分，与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中GJB6基因233C→A突变位点的试剂盒，可含有扩增引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液、酶切反应和/或测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述的引物可以采用上述的一对CX30-F和CX30-R引物，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。所述试剂盒的使用方法主要包括如下步骤：

(1)提取待测血样的DNA，利用上述的一对CX30-F和CX30-R引物，进行PCR反应；

(2)酶切反应进行突变检测；

(3)PCR反应产物纯化后直接测序，将所得的序列与Genbank中的标准序列比较确定突变位点的存在；

(4)按正常阅读框进行翻译以确定是否存在Cx30氨基酸突变位点。

该试剂盒可简便快捷地检测GJB6基因233C→A突变位点，从而应用于耳聋相关基因的检测和耳聋诊断或治疗方法中。

根据本发明的又一方面，提供GJB6突变基因在诊断或治疗人类遗传性耳聋中的应用，通过检测来自患者的待测样本中是否存在GJB6基因233C→A突变而判断该患者的耳聋发生原因及类型，进而为临床诊断和治疗提供参考；此外，在进一步的临床治疗方面，在检测为发生了GJB6基因233C→A突变之后，可以将正常基因导入携带突变基因的细胞并在其中表达，它可与内源性突变基因发生重组，从而可以进行基因治疗。

本发明首次提供了在中国人群中存在GJB6基因233C→A突变，并且说明该突变基因与遗传性耳聋相关。目前在国内听力下降患者中还没有研究发现GJB6基因突变，因此这个突变位点对于耳聋患者的诊断有重要意义。本发明同时提出了通过检测患者中是否存在GJB6基因新的突变而诊断耳聋发生的原因和类型的检测方法，这将有利于在临床上开展耳聋患者的GJB6突变筛查工作，为耳聋患者提供诊断和治疗服务。

下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的说明，详细描述但不限制本发明。

附图的简要说明

图1为GJB6编码区氨基酸与核酸碱基的对照：突变位于Cx30的第二跨膜区，第233个碱基。用方框圈起来的是突变的碱基和氨基酸；

图2为CX30结构示意图，表示突变位于第二跨膜域(M2)；

图3为本发明方法中PCR反应过程示意图，示出了反应温度和时间；

图4为本发明方法中，对PCR产物进行电泳定量的琼脂糖凝胶电泳图谱，图中示出了定量Marker的片段位置；

图5为本发明方法GJB6基因测序结果，上方为正常对照序列，下方为突变序列，箭头所指为突变位点(233C→A，A78D)；

图6为本发明方法中突变位点酶切电泳图，

图中从左至右：第一泳道为分子量标准、第二和第三泳道为正常基因的酶切图谱、第四和第五泳道为杂合突变基因的酶切图谱，

限制性内切酶ApaI可以在234和235位碱基切开，而使得正常人PCR产物片段由原来的870bp被切成623bp和247bp两个片段，而突变以后此酶切位点消失，不能切开，由于本组两例均为杂合突变，故电泳胶图上显示为3条带；

图7为不同连接蛋白氨基酸序列进化研究，

通过对多种连接蛋白氨基酸序列比对，箭头所指为Ala78位点，可见所有连接蛋白中该位点均为丙氨酸(Ala)，说明为高度保守区，提示233C→A突变位于高度保守区域。

发明的具体实施方式

选取GJB6基因作为研究对象，通过在141名各种感音神经性耳聋患者组和150名正常听力对照组中进行筛查，发现一位先天性极重度耳聋患儿与其父亲具有一个与耳聋有关的GJB6基因新的突变位点(233C→A，A78D)。这一突变位点在150名对照组中均没有发现，说明这一突变位点与耳聋共分离。这一突变位点位于连接蛋白Cx30的第二跨膜域。

本发明进行的研究中，收集耳聋遗传资源，建立遗传性耳聋资源库。通过聋病门诊收集各种感音神经性耳聋患者，在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。然后，应用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA，定量后入库，-20℃保存，每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。然后，应用在线引物设计软件Primer3设计引物，包含GJB6整个编码区，应用PCR扩增。对PCR产物可进行酶切反应：应用APaI限制性内切酶可将正常人PCR产物切成两个片段，而出现突变后，酶切位点消失，不能切开。对PCR产物也可进行直接测序：测序引物与PCR扩增引物相同，正反向测序，应用ABI公司3730DNA测序仪。将得到的序列与Genebank中的序列比较确定GJB6突变位点。按正常阅读框进行翻译以确定Cx30的突变位点。

待测血样的提取与GJB6基因编码区的PCR扩增

【实施例1】

一、待测对象血样DNA的制备

1、研究对象：聋病门诊收集的各种感音神经性聋患者141例，正常对照150例。对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5-10ml。

2、基因组DNA提取：采用酚氯仿抽提法。

第一天

1)抗凝血用PBS作1倍稀释。

2)在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18℃-28℃)，上面铺一层1倍体积已稀释的血液，室温1000×g，离心20分钟。

3)吸弃上清，小心吸出中间有核细胞层，转入5mlEp管中，5000×g，离心10分钟，然后用PBS洗一次。5000×g，离心10分钟。

4)将细胞悬于2mlTE缓冲液中，加10％的SDS至终浓度0.5％(100μl)，蛋白激酶k 100-200μg/ml(10mg/ml)，50℃水浴3-5小时。

5)用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚，加入混匀，5000×g，离心10分钟。

6)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积酚：氯仿混合物，混匀，5000×g，离心10分钟。

7)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积氯仿：异戊醇混合物，混匀，5000×g，离心10分钟。

8)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入1/10体积的乙酸钠，混匀。

9)加入2.5倍体积的无水乙醇。

10)-20℃沉淀DNA过夜。

第二天

11)高速离心，10000×g，10分钟，4℃。

12)弃上清，加入75％乙醇2ml，高速离心10000×g，5分钟

13)弃上清，吹干。

14)用TE缓冲液溶解，(200μl TE/5ml全血，400TE/10ml全血)

15)分装。1％琼脂糖电泳和分光光度计定量。

二、GJB6基因编码区的PCR扩增

1、引物序列

上游引物：

CX30-F：5’-TCAGGGATAAACCAGCGCAAT-3′(nt1916-nt1935)

下游引物：

CX30-R：5’-GTTGGTATTGCCTTCTGGAGAAGA-3′(nt1066-nt1935)

注：GJB6基因序列检索号：NT 009799

2、PCR反应体系的建立

GJB6基因的PCR反应体系的组成见表1。

表1GJB6基因的PCR反应体系

 名称  原液浓度  加样量(μl)  体系终浓度 缓冲液  10×  2.5  1× dNTP  2.5mM  3.0  400μM 引物  10μM  1  7.5pmol Taq酶  5units/μl  1  1U/μl 模板(步骤一 中提取的 DNA)   100ng/μl   1   10ng/μl 总反应体系  ddH₂O补齐至25μl

其中缓冲液、dNTP、Taq酶从宝生物公司购得。引物由上海生工公司合成。反应条件：PCR反应在ABI公司9700热循环仪上进行，反应过程(包括温度和时间)如图3所示。

GJB6基因编码区PCR扩增产物的纯化和定量

【实施例2】

一、PCR产物的纯化

1、向装有PCR产物的96孔板中加入50μl无菌水，混匀。

2、将其转移到Millipore纯化板中，放到真空泵上抽滤约3分钟，看到纯化板中没有水即可。

3、纯化板中再次加入50μl的去离子水，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。

4、将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20μl的去离子水，静止15分钟，再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。

5、保存在-20度冰箱中。

二、电泳定量

1、样品准备

PCR产物(2μl)+上样缓冲液(6μl)共8μl×96

取一96孔点样板，每孔先加上样缓冲液6μl，在从装有PCR产物的腔板中，每孔用排枪移出PCR产物(2μl)，转移到点样板上、混匀、离心(腔板孔号要与96孔点样板一一对应)。

2、流程

1)配胶(0.8％琼脂糖)：称取2.4g琼脂糖，悬浮于300ml 0.5×TBE中(500ml锥形瓶)。

2)溶胶：微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。

3)凉胶：待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60℃左右，加入1滴EB(约10μl，10mg/ml)，摇匀。

4)铺胶：平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。

5)上胶：将平板放入已盛有电泳液(0.5×TBE，液面距胶面1至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。

6)加样：用排枪按规定格式加样，最后用单枪加入DNA标准品。

7)走胶：盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。

8)定量：当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相，进行定量。定量marker为DL 2000，如图4所示，经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，DL2000的总浓度是300ng/5μl。电泳时取5ul DL2000，因此每条带的含量为50ng。PCR产物电泳时取3μl(PCR产物)+5μl(上样缓冲液)进行电泳。根据PCR产物电泳后的灰度值与DL2000的灰度值的比较判断PCR产物的含量。

纯化的GJB6基因编码区PCR扩增产物的直接测序

【实施例3】

1、PCR产物DNA模板的纯度与用量要求

DNA纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.6～2.0。

DNA浓度：PCR产物10ng/μL。

DNA用量：

PCR产物

      100-200bp       1-3ng

      200-500bp       3-10ng

      500-1000bp      5-20ng

      1000-2000bp     10-40ng

      ＞2000bp        40-100ng

2、测序反应

(1)测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。

(2)为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。

(3)目前的反应体系为5μl，各种试剂加入量见表2。

表2GJB6基因PCR扩增产物的测序反应体系

  模板  纯化的PCR  产物(实施例2  中制备)  200-500bp  3-10ng  500-1000bp  5-20ng  1000-2000bp  40-100ng  BigDye v3.1^*  0.25μl  5×缓冲液(Tris-HCl pH9.0，MgCl₂)  0.875μl(Kit)  引物  3.2pmol  用无菌水补至5μl

*BigDye 3.1为美国应用生物系统公司(ABI)生产的一种用于测序反应的荧光染料。

(4)样品放于PCR仪上，所做反应的过程见表3。

表3GJB6基因PCR扩增产物的测序反应过程

  步骤  作用  1  96℃，2min.    2  重复以下过程30个循环：  ●96℃，10sec；  ●50℃，5sec；  ●60℃，4min.  3  保持在4℃，直到纯化

(5)反应完的样品要及时从PCR仪上取下，短时间内要进行纯化的样品放置于4℃冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。

3、测序反应物的纯化和测序

(1)向每孔中加入20μl 80％乙醇，4000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1000rpm；

(2)在每孔中加入30μl 70％乙醇，4,000rpm离心10min，倒甩；

(3)重复第2步的操作；

(4)重复第2步的操作；

(5)将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；

(6)加入5μl甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；

(7)上机器前95℃变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后上样。

测序图如图5所示。

突变位点酶切反应检测

【实施例4】

酶切反应体系的组成见表4，反应条件为37℃水浴2小时。应用琼脂糖电泳检测，方法参见实施例2中电泳定量。酶切反应电泳图如图6所示。

酶切分析是在该突变位点找到了一个限制性内切酶ApaI酶切位点，没有发生突变时，限制性内切酶ApaI可以在234和235位碱基切开，而使得PCR产物片段由原来的870bp被切成623bp和247bp两个片段，而突变以后此酶切位点消失，不能切开。由于本组两例均为杂合突变，故电泳胶图上显示为3条带。

表4酶切反应体系

  试剂  样品量  ApaI  1μl  10×L Buffer  2μl  PCR产物  5μl  ddH₂O  Up to 20μl

ApaI限制性内切酶与10×L Buffer购于宝生物公司，PCR产物为实施例2中的PCR扩增产物。

 突变位点进化研究

【实施例5】

突变分析：应用DNAStar5.O(Lasergene inc.)软件包中的Seqman^TM软件进行序列对比分析。将测序得到的序列与NCBI检索到的标准序列进行比对，找出突变序列，发现了突变位点(233C→A，A78D)。

进化研究：在数据库中找出各种不同的28种连接蛋白氨基酸序列，应用ClustalX软件进行比对分析。通过研究发现Ala78位点位于第二跨膜区，在连接蛋白家族中高度保守，参看图7。

检测耳聋相关基因GJB6基因233C→A突变位点试剂盒及其应用

【实施例6】

1、试剂盒含有：

(1)扩增用引物

CX30-F：5’-TCAGGGATAAACCAGCGCAAT-3’(nt1916-nt1935)

CX30-R：5’-GTTGGTATTGCCTTCTGGAGAAGA-3’(nt1066-nt1935)

注：GJB6基因序列检索号：NT_009799

(2)PCR扩增用Taq酶5U/μl

(3)10×缓冲液(含15ml MgCl₂)

(4)dNTP       2mM

(5)ApaI限制性内切酶

(6)10×L Buffer

(7)Big-Dye mix

2、使用方法

主要包括如下步骤：

1)PCR扩增

用软件Primer 3对GJB6基因的编码区设计PCR引物，反应条件为94℃预变性4分钟，94℃变性1分钟，退火温度60℃分钟，72℃延伸2分钟，35个循环，反应结束后再72℃延伸5分钟，4℃保存；

2)PCR产物纯化

将含有PCR产物的MultiScreen-PCR板抽真空，加入去离子水，静置，随后将MultiScreen-PCR板置于混合器上震荡，纯化后的PCR产物重新溶解后转移至另一洁净的96孔板中；

3)酶切反应

应用APaI限制性内切酶1μl，10×L Buffer 2μl，PCR产物5μl，加去离子水至20μl，37℃水浴2小时，正常人PCR产物切成两个片段，而出现突变后，酶切位点消失，不能切开；

4)测序反应及验证

以PCR引物作为测序引物进行测序反应，在ABI9700热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上样于ABI PRISM 3730DNA序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分析，与Genbank中的标准序列比较可以发现突变位点；

5)按正常阅读框进行翻译以确定是否存在Cx30氨基酸突变位点。

具体方法参见实施例1、2、3、4。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权力要求所定义的范围。