利用纳豆芽孢杆菌固体发酵生产多聚谷氨酸及产品应用

摘要

利用纳豆芽孢杆菌固体发酵生产多聚谷氨酸及产品应用。目前研究的γ－多聚谷氨酸的生产方法均为液体发酵法，尚未发现采用本发明的大豆固体发酵方法。本发明的方法包括：将大豆预处理，接种纳豆芽孢杆菌，其特征是：通过搅拌使纳豆芽孢杆菌均匀的分布在大豆的表面，恒温保湿1－2昼夜，用生理盐水搅拌提取纳豆芽孢杆菌分泌在大豆表面的γ－多聚谷氨酸，离心分离菌体，上清液经300000D膜堆超滤，加入原体积1－2倍的乙醇，一昼夜后，离心分离菌体，分别得到γ－多聚谷氨酸粗品和维生素K2的混合溶液与纳豆激酶芽孢杆菌。γ－多聚谷氨酸为一种全天然、多功能性、生物可分解性的生物高分子材料，在医药、化学工业、食品工业、环境、农业、林业及其它领域有广泛用途。

说明书

技术领域：本发明涉及一种生物工程技术领域的发酵工程、酶工程中的高新技术，即利用纳豆芽孢杆菌通过大豆的固体发酵生产γ-多聚谷氨酸的方法及其所得产品的综合利用。

背景技术：目前研究的γ-多聚谷氨酸的生产方法均为液体发酵法，尚未发现采用本发明的大豆固体发酵方法。

发明内容：本发明的目的是提供一种利用大豆作培养基，接种纳豆芽孢杆菌，通过固体发酵生产γ-多聚谷氨酸的方法及其产品的综合应用。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

利用纳豆芽孢杆菌固体发酵生产多聚谷氨酸方法，其组成包括：将大豆预处理，接种纳豆芽孢杆菌，通过搅拌使纳豆芽孢杆菌均匀的分布在大豆的表面，恒温保湿1-2昼夜，用生理盐水搅拌提取纳豆芽孢杆菌分泌在大豆表面的γ-多聚谷氨酸，离心分离菌体，上清液经300000D膜堆超滤，加入原体积1-2倍的乙醇，一昼夜后，离心分离菌体，分别得到γ-多聚谷氨酸粗品和维生素K₂的混合溶液与纳豆激酶芽孢杆菌。

所述的利用纳豆芽孢杆菌固体发酵生产多聚谷氨酸方法，将取得的粗品提纯，其过程包括：将所得到的γ-多聚谷氨酸粗品用水溶解，加入1-1.5倍体积的乙醇，24小时后离心分离，再次用乙醇洗涤后，真空抽干得到γ-多聚谷氨酸精品。

所述的利用纳豆芽孢杆菌固体发酵生产多聚谷氨酸方法，所述的将大豆进行预处理包括：将所述的大豆流水浸泡一昼夜，淋出水分，放入高压灭菌器中，130℃，高压灭菌1-2小时，取出后，放无菌室中，待冷却到50℃，再接种。

所述的利用纳豆芽孢杆菌固体发酵生产多聚谷氨酸方法，所述的接种的重量比例为大豆重量份数的2％，然后在摇床以每秒190转，培养1-2昼夜，菌数/ml应为1×10⁸个/ml，作为菌种，按10％V/W，接种于50℃的大豆中，充分搅拌，使菌种均匀分布于大豆表面，接种后的培养室保持39-40℃的恒温，室内湿度严格保持在95％以上，以防发酵大豆表面干燥而影响γ-多聚谷氨酸的产量，发酵2昼夜。

所述的利用纳豆芽孢杆菌固体发酵生产多聚谷氨酸方法，所述的用生理盐水提取搅拌纳豆芽孢杆菌分泌在大豆表面的γ-多聚谷氨酸的过程包括：用发酵大豆5-10倍体积的0.9％的NaCl搅拌提取2小时，经100目筛网过滤后，收集滤液，滤液再10000转/分情况下连续离心，得到上清液(粘稠状)。沉淀物可用来回收菌体，冻干后制作纳豆芽孢杆菌活菌剂，同时利用高压液相层析法测定γ-多聚谷氨酸的浓度。

所述的利用纳豆芽孢杆菌固体发酵生产多聚谷氨酸方法，在超膜过滤后，分别收集截留和超滤出液体两部分。使超滤截留部分中γ-多聚谷氨酸浓度为40-60g/L时止，然后，向其中加入1-2倍体积的乙醇，搅拌均匀，4℃，放24小时，沉淀γ-多聚谷氨酸，在6000转/分离心30分钟，回收γ-多聚谷氨酸得到γ-多聚谷氨酸粗品，超出液用以回收提取纳豆激酶和维生素K₂。

所述的利用纳豆芽孢杆菌固体发酵生产多聚谷氨酸方法，其特征是：将取得的粗品提存的具体方法是：将所获得的γ-多聚谷氨酸粗制品，用蒸馏水溶解，使其γ-多聚谷氨酸浓度为60g/L，除去不溶物后，再向其中加入1-1.5倍体积的乙醇在4℃，静置24小时，在6000转/分离心30分钟，收集γ-多聚谷氨酸，然后用1-2倍的无水乙醇洗涤，脱水，真空抽干，得到纯化的γ-多聚谷氨酸纯品。

将提取得维生素K₂用作预防骨质疏松症药物的原料。

将离心回收沉淀的纳豆激酶，作为溶栓胶囊原料。

将发酵大豆匀浆后作为生产大豆蛋白肽，大豆降压肽的原料。

这个技术方案有以下有益效果：

1、使用筛选出的即高产γ-多聚谷氨酸，用产纳豆激酶的纳豆芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis natto HW-1作为菌种，以黑龙江产大豆为发酵原料。通过固体发酵方式取得γ-多聚谷氨酸，为多聚谷氨酸的生产开辟了廉价、高效的新的生产路线，同时对大豆的综合开发利用起到了很好的促进作用。

2.本方法在用两次乙醇沉淀的分离提纯工艺，可以得到纯化的γ-多聚谷氨酸(即γ-PGA)产品，收率10-20％，纯度为95％以上。

3.本发明是一种用发酵工程技术，大量生产新型高分子材料的技术方法。利用本发明不但可大量生产γ-PGA，同时可生产多种有用有价值产品，可创造明显的经济与社会效益。本发明的特点是：在一种菌固体发酵中产生几种可资利用的产品，其中包括r-PGA、NK、VK₂、Bisubtilis notto活菌冻干剂、大豆蛋白和大豆蛋白肽等。

4.本发明的产品：γ-多聚谷氨酸为一种全天然、多功能性、生物可分解性的生物高分子产品。分子量从500000D-2000000D间，可应用于各种领域。应用于医药上，新型药物载体，药物缓冲剂、助溶剂、取收促进剂等。生物医用高分子材料，可生物降解，如多聚谷氨酸紫杉醇抗癌剂，提高疗效和利用率，缝合材料、人工皮肤等。农业上，固沙植被用新材料，包被植物种子，在沙漠缺水区，可保证种子发芽、出苗，防止干旱的影响，保水达到1∶3500倍。新型液体肥料，保持肥力的缓慢释放和流失。工业及其它领域，水及废水处理，作为螯合剂、吸附剂、絮凝剂处理污水、重金属、放射性材料、化妆品、食品工业；滤膜材料、保湿材料、包装材料、组织工程材料等。

5.同时，从提取液中兼顾生产纳豆激酶和维生素K₂，发酵纳豆继续利用制备大豆蛋白或大豆蛋白肽，因此一种大豆固体发酵可生产多种产品，几乎完全被利用，废弃物很少。所以可创造最大价值，若以液体发酵法生产γ-PGA则单一产品，原材料消耗较大，成本较高。

附图说明：附图1是本方法的过程及综合利用示意图。

附图2是大豆固体发酵生产γ-PGA的HPLC分析图，1为标准品γ-PGA、2为粗品γ-PGA、3为用本发明方法纯化的γ-PGA。

附图3是γ-PGA的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中1-7为样本，M为分子量

本发明的具体实施方式：

实施例1：

纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto HW-1)的活化和培养。取保存的Bacillus subtilis natto HW-1菌种，在LB平皿上划线培养，18h，取出后，从平皿挑单菌落接于5mlLB/管中，37℃，180rpm，18小时，再按2％接种量，接入100mlLB/500ml三角瓶中，37℃，培养18小时，作为固体发酵菌种，备用。

挑选大豆，弃去破碎残缺大豆，然后在流水下浸泡18小时，控除水分，分装到盘中，130℃，高压灭菌1小时，取出后，放接种室，待接种。

当灭菌后，温度降至50℃左右时，按10％(V/W)，将菌种接入到大豆盘中，充分搅拌，使大豆表面均匀地接种，此时要呈现盘中即无多余溶液，大豆表面又不干燥为佳。

接种好的大豆盘复以灭菌纱布，放入培养室，39-40℃培养48小时，室内湿度大于95％，并放有几个装无菌水的水盆，以保证室内的湿度，防止大豆表面干燥，影响菌生长和γ-PGA产量。

培养48小时后，大豆表面呈现出一层粘物质，可拉出很长的丝，合并发酵大豆，用5-10倍体积的生理盐水，洗涤和搅拌提取2小时，100目筛网过滤，分别收集滤液和发酵大豆。

滤液，在10000rpm，连续离心，收集离心液体，为r-PGA和纳豆激酶提取液。

上项中的提取液，用300000D的滤器超滤和浓缩，使截留液中γ-PGA浓度在40-60g/L时，停止超滤，此时截留液黏度很大。

向浓缩液中加入1-1.5倍乙醇，充分搅拌，放4℃，过夜，沉淀出γ-PGA，离心6000rpm，30分钟，其沉淀物为γ-PGA的粗制品。

称重上项的γ-PGA粗品，溶解使其浓度为60g/L，再次用1-1.5倍乙醇沉淀γ-PGA，4℃，过夜，离心6000rpm，30min，得沉淀物，用1-2倍体积的无水乙醇脱水，真空抽干，称重，得到γ-PGA纯化产品。

上述的300000D滤膜超出溶液，用5000D膜，超滤浓缩，浓缩液用2倍乙醇沉淀，离心6000rpm，30分钟，回收纳豆激酶，为纳豆激酶原料，此酶中不含维生素K₂。

在5000D膜超出液，减压浓缩1/10体积，用有机醇提取，回收VK₂。

发酵大豆，加蒸馏水，匀浆、沉淀得大豆蛋白。

大豆蛋白溶液，用中性和酸性蛋白酶水解喷雾干燥得到大豆蛋白肽。

实施例2：

一、本实施例的技术要点

使用筛选出的即高产γ-PGA，有产MK的菌株Bacillus subtilis nattoHW-1。以黑龙江产大豆为发酵原料。两次乙醇沉淀分离提纯γ-PGA。

二、实验操作步骤(见图1)

1、菌种的培养

1号保存菌种接入到菌种活化管中(5mlLB/支)，37℃，摇床培养，190rpm，18小时，然后按2％接种量接入到50ml LB/250ml三角瓶中，37℃，摇床振荡培养，200rpm，18小时。作为菌种，备用。

2、大豆1000g，流水浸泡24小时，装至盘中，130℃灭菌1小时，取出后放接菌室，冷至50-60℃，取1号菌株，按10％接种至盘中，充分混匀，覆以灭菌纱布，放培养箱中39℃-40℃培养2天。温箱内保持湿度大于95％，以防大豆表面干燥。

3、提取纯化：大豆固体发酵后，表面上产生大量的粘性液体，主要含γ-PGA，同时发酵产生的纳豆激酶包含其中，用5-10倍体积的生理盐水，搅拌提取γ-PGA，2-4小时，分2-3次，然后合并提取液，10000rpm离心30分钟，收集上清液，再经300000超滤膜浓缩，浓缩至40-60g/L后，加1-2倍体积的冷乙醇沉淀γ-PGA，冰箱过夜，离心，6000rmp，30分钟，收集沉淀，无水乙醇脱水后，抽干得到粗制品γ-PGA。

实施例3：

为了提纯γ-PGA，将乙醇沉淀的γ-PGA再溶于生理盐水中，使浓度40-60g/L离心除去不溶物，再加1-2倍体积乙醇，冰箱沉淀过夜，离心得到γ-PGA，无水乙醇脱水，抽干得到γ-PGA，纯度＞95％，产率在80-120g/Kg大豆。

1000g干大豆，浸泡后为2200g，经固体发酵提取纯化，得115g粗品γ-PGA，进一步纯化得到89.5g纯化的γ-PGA，纯化后的γ-PGA状态为白色粉末。

实施例4。

一、本实验例的技术要点：

1、用高压液相色谱法测定γ-PGA的含量；2、采用HCL水解γ-PGA，为谷氨酸，或直接用γ-PGA，以氨基酸柱前衍生法，在360nm波长检测。

二、试验操作步骤

1、采用氨基酸柱前衍生法测定γ-PGA含量，具体方法：γ-PGA的HCL水解，精确称取10mgγ-PGA干燥样品，溶成1ml，加等体积12NHCL，105℃，水解8h，加NaOH调至pH7.0，然后定容至100ml。

2、衍生：取水解的γ-PGA1ml加入溶量瓶中，分别加入0.5M/L NaHCO₃(pH9.0)1ml，和1％的2，4-二硝基氟苯衍生剂的乙腈溶液1ml，混均后，与60℃下反应1小时，冷却至室温后，加入0.01M/L KH₂PO₄(pH7.0)，并定容至10ml，取一定量用0.45um膜过滤，取10ul进行HPLC分析，样品应在4℃避光保存。

3、色谱分析条件和方法：流动相A：乙腈+水(1∶1)：B：60mM/L NaAc(pH6.4)，含10％N，N-二甲基甲酰胺；柱温35℃，流速0.5ml/min。检测器：紫外360nm；梯度洗脱：时间(min)0、4、32、50、56，B(％)84、64、40、8、74。调好基线，放好样品，洗柱，进样，进行检测。

4、粗品和纯化的γ-PGA，HPLC测定如图2所见，其结果列入表1中。

表1、γ-PGA样品的HPLC分析数据

  样品号  峰面积  峰高度  浓度％  产量g/kg  标准品  粗制品  纯化品  10359394  14228396  17302432  245952  298347  589287  93.97  80.47  95.33  ------  115  89.5

表1中列出以谷氨酸为标准品，HCL水解样品HPLC测出有关数据，从数据中比较表明1号菌株的γ-PGA产品，经过二次乙醇沉淀提纯后，质量好，只有少量杂质。从而表明：用二硝基氟苯柱前衍生法HPLC测定r-PGA在发酵液中和提取样品含量是可行的，方法准确，可靠，易行。

实施例5：

一、本试验例的技术要点：

1、准确制备10％的聚丙烯酰胺的样品胶和分离胶，保证蛋白分子量标准和γ-PGA能很好分离，显现出清晰带。

2、用SDS处理样品。

二、实验操作与步骤：

1、按常规制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶方法，制成10％的分离胶，待其聚合后，在其上制备成样品胶，样品胶合后，装入电泳槽中。

2、定量称取γ-PGA样品，用IBS缓冲液溶解成浓度1-10μg/μl的样品。

3、取5μl样品加5μl加样缓冲液，在100℃沸水中煮3-5分钟，冷却后，瞬间离心，取上清液为电泳样品，标准分子量蛋白同样操作。

4、开始电泳，开始时电压在8mV/cm，当样品进入分离胶后，调电压为15mV/cm，电泳至溴酚蓝到胶下端。

5、取出电泳胶，凝胶用水漂洗后，在考马斯亮兰中染色3-4小时，主要显色标准蛋白，而γ-PGA则不被染色，染色停止，用甲醇-HAc脱色三次，得到蛋白显色凝胶，然后在用0.5％的亚甲兰溶液染色3-4小时，取出冲洗掉染料，脱色至胶本体很浅时，可发现清晰高分子的γ-PGA带，照相如图3，在图3上可见r-PGA为高分子量化合物，在10％的凝胶上，未发现有其它的蛋白质染色带。