一种快速检测盐酸克伦特罗残留的胶体金试纸

摘要

一种快速检测盐酸克伦特罗残留的胶体金试纸，由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、盐酸克伦特罗单克隆抗体金标垫、样品吸液层组成。配对单抗的建立是通过调整免疫剂量，高剂量为致死量的50％，即10－60μg进行免疫。低剂量为5μg以下，低剂量免疫容易诱导出高选择性和高亲合性的抗体；而高剂量则相反，通过对低剂量所产生的抗体、高剂量所产生的抗体配对筛选，获得配对单抗几率较大。利用此原理构建胶体金双抗夹心法，筛选抗体制成试纸，检测畜类产品中是否有盐酸克伦特罗残留。此方法具有特异性强，灵敏度高，批间差小，操作简便，易于贮藏及运输等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于兽药盐酸克伦特罗残留的检测试纸。

背景技术

盐酸克伦特罗(Clenbuterol)缩写为CL，俗称瘦肉精，是一种人工合成的肾上腺素神经兴奋剂，属β-兴奋剂类激素。克伦特罗从化学性质上看是苯乙醇胺的衍生物，其分子结构与肾上腺髓质等处分沁的肾上腺方去甲肾上腺素、多巴胺等儿茶酚胺类相似。在生理上，它能抑制糖原合成酸并激活磷四化酶，从而加速糖原分解，提高血糖和精代谢率；通过作用于脂肪组织，可提高激素敏感胀酶活性，加速脂肪分解，提高血液中游离脂肪酸浓度，促进其在肌肉组织中的氧化分解，增加心率、心血输出量、心缩压，提高骨骼肌，冠状动脉和肝脏等局部血流量。在动物体内代谢上，利用它具有促进畜禽脂肪分解、增加肌肉生长作用，为增加瘦肉产量而添加于饲料生产中。入食用了饲喂克伦特罗这种添加剂的动物所生产的畜产品后，由于畜产品中残留的克伦特罗会引起中毒，用量超标人体会产生心悸、呕吐、肌肉不自主震颤等症状，甚至有生命危险，长期过量摄入会积蓄中毒，还有导致染色体畸变的可能。我国政府已明文规定在畜牧生产中严禁使用克伦特罗等β-兴奋剂。

目前，测定动物组织中的克伦罗的方法有高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)和酶联免疫吸附法(ELISA)等。以上所述色谱分析方法通常繁琐，样品前处理过程复杂，灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响很大，工作量大，检测设备昂贵，并要求有专业的技术人员及较长的分析周期，不适合大批量样品的检测与分析。酶联免疫吸附法方法制成的试剂盒需要冷藏，运输不变，同时也需要有专业的技术人员进行操作。由于以上原因，当前迫切希望有一种灵敏度高，特异性强，简便易行，价格低廉的方法，能在野外或实验室内进行检测，且不需要对工作人员进行专业培训。

免疫分析为盐酸克伦特罗的残留检测提供了一个新的分析检测途径。目前已有盐酸克伦特罗免疫分析方法的报道，但要将免疫分析方法运用到实际中，还需要将其研制成试纸。现已有利用免疫胶体金方法制成试纸，授权专利02101928.2盐酸克伦特罗快速检测试纸条；授权专利02228104.5盐酸克伦特罗快速检测试纸条(II)；授权专利02202033.0盐酸克伦特罗快速检测试纸条；授权专利200320117280.1克伦特罗快速半定量检测试纸；公开专利02139704.X半定量快速检测盐酸克伦特罗的胶体金试纸条及生产和使用方法；公开专利02111518.4一种β-兴奋剂金标层析快速检测方法及装置；公开专利03153346.9检测盐酸克伦特罗的参比免疫层析试纸及其检测方法；公开专利02157708.0检测盐酸克伦特罗的免疫胶体金试剂及其制备方法；公开专利200310112423.4克伦特罗快速半定量检测方法；公开专利02131321.0一种免疫层析一步法检测β-肾上腺素激动剂类药物的方法及试纸的制备，以上专利都是利用免疫胶体金竞争法原理制成，本发明是通过双抗体夹抗原即双抗夹心法原理制成，此方法具有特异性强，灵敏度高，批间差小等优点。

发明内容

本发明针对上述存在的一些问题，提供了一种适用于盐酸克伦特罗残留分析的试纸及其检测方法。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

在盐酸克伦特罗残留检测试纸底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线和一条羊抗鼠多克隆抗体控制线，在底板一端端头为吸水层，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水层和盐酸克伦特罗单克隆抗体金标垫相互交叠连接(交叠连接部分在1-2毫米范围)，在盐酸克伦特罗单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。关于底板、硝酸纤维素膜、吸水纸、胶体金标垫的组合方法已是公知技术。万华普曼生物工程有限公司于1995年已获双抗夹心法检测人绒毛膜促性腺激素诊断试纸的国药批准文号：国药准字S10950049号，并将产品投放市场。

配对单抗的建立是通过调整免疫剂量，高剂量为致死量的50％，即10-60ug进行免疫。低剂量为5ug以下，低剂量免疫容易诱导出高选择性和高亲合性的抗体；而高剂量则相反，通过对低剂量所产生的抗体、高剂量所产生的抗体配对筛选，获得配对单抗几率较大。利用此原理构建胶体金双抗夹心法，筛选出两株配对单抗，其中一株抗体称为I用于包被试验线，另一株种抗体称为II用于胶体金标记。

将畜类产品用打浆机将其打成浆状，用稀释液将其对倍稀释，把检测盐酸克伦特罗残留的胶体金试纸的样品吸液层端放入畜类产品的稀释液中(液面不得超过MAX线图中8)，由于毛细管作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，当移动至盐酸克伦特罗单克隆抗体II金标垫时，样品中的盐酸克伦特罗与盐酸克伦特罗单克隆抗体金标探针发生特异结合，当移动至固定有盐酸克伦特罗单克隆抗体I试验线时，样品中的盐酸克伦特罗又与试验线中的盐酸克伦特罗单克隆抗体相结合，因此其胶体金滞留于试验线上，试验线处显示红色为阳性；相反如果样品中没有盐酸克伦特罗，盐酸克伦特罗单克隆抗体金标探针就不会与试验线上的盐酸克伦特罗单克隆抗体I发生特异结合，没有胶体金滞留，即仅有一条红色控制线为阴性，这就是双抗夹心法原理。根据此原理，两条线为阳性，一条线为阴性得出判断。

当移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，无论样品中有无盐酸克伦特罗，标记的金标探针都会与已设定好的羊抗鼠多克隆抗体结合滞留，使控制线显示红色。因此控制线无色带产生则代表操作有误，检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。

由于采用上述技术方案，本发明所提供的一种快速检测盐酸克伦特罗残留的胶体金试纸具有这样的有益效果，即特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门技术人员操作，而且结果易读。

附图说明

图1为盐酸克伦特罗检测试纸的主视结构图。

图2为盐酸克伦特罗检测试纸的侧视结构图。

图3为本发明检测时显示为阴性结果图；

图4为本发明检测时显示为阳性结果图；

图中1、吸水板，2、硝酸纤维素膜，3、羊抗鼠多克隆抗体控制线，4、试验线，5、单克隆抗体金标垫，6、样品吸液层，7、底板，8、MAX线。

具体实施例

1.盐酸克伦特罗免疫原合成

用重氮法合成盐酸克伦特罗半抗原，将其连接BSA、OVA，盐酸克伦特罗-BSA用于免疫或包被，盐酸克伦特罗-OVA用于检测。

2.盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备

(1)将5ug/ml和60ug/ml两种剂量的盐酸克伦特罗-BSA分别免疫BALB/c小鼠。用SP20细胞融合建立瘤株进行筛选，取瘤细胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水。

(2)提取小鼠腹水纯化筛选，获得能同时与盐酸克伦特罗分子结合的两种盐酸克伦特罗单克隆抗体I、II，抗体II可用于双抗夹心法的胶体金标记和竞争法的胶体金标记。

3.胶体金的制备及与盐酸克伦特罗单克隆抗体的结合

(1)取双蒸水加适量的氯金酸磁力搅拌加温到90～95℃，加入适量枸橼酸三纳继续加热搅拌至沸腾5分钟，冷却后避光保存备用。

(2)把盐酸克伦特罗单克隆抗体标记的胶体金液，吸附纤维材料上，干燥后备用。

4.制膜机制膜：利用电脑控制传动速度，保证每单位膜上包被的抗体量相等。

5.试纸条组合：按公知技术组合。

6.使用方法：将畜类产品用打浆机将其打成浆状，用稀释液将其对倍稀释，把检测盐酸克伦特罗残留的胶体金试纸的样品吸液层端放入畜类产品的稀释液中(液面不得超过MAX线图中8)，1分钟后取出试纸平放，由于毛细管和虹吸作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，5分钟时观察结果。

7.结果判断：反应线颜色为红色，即显色区为两条红色线时为阳性；只有一条红色控制线时为阴性。