盐酸克伦特罗胶体金免疫层析试纸条制备与应用

摘要

盐酸克伦特罗是临床治疗咳喘病的药物，近年来有研究显示，它可以促进脂肪组织转化为蛋白质，提高瘦肉率，被非法用于猪、羊等家畜饲养。当人体摄入一定量的盐酸克伦特罗后，造成体内代谢紊乱，增加脏器负担，严重者危及生命。
　　免疫胶体金是一种新兴的免疫检测技术，在多领域应用，耗时少、灵敏度好、特异性强，在现代食品检测工作中发挥重要作用。
　　本实验进行CLB胶体金免疫层析试纸条制备，并应用于动物生鲜组织及动物性加工食品（如猪肉松、牛肉干）中CLB检测。首先采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，对比不同浓度还原剂制得的胶体金在400～700nm紫外扫描最大吸收峰，结果表明，在还原剂质量一定的情况下，还原剂浓度对金颗粒影响较小，选择1％柠檬酸三钠1.8mL，制备胶体金在520 nm处具有最大吸收峰，粒径约为18.41nm。试纸条制备工艺如下:(1)优化金标抗体制备条件:最佳抗体标记量为4.5μg/mL，最适pH为0.2mol/L K2CO3添加量3μL/mL，并确定封闭液为1％BSA，封闭温度4℃。(2)选择金标抗体复溶液配方:0.01mol/L pH7.4PB，终浓度为1％ BSA、10％蔗糖、0.5％PEG20000的混合液。(3)二抗与包被抗原最适匹配浓度为1.0mg/mL、0.2mg/mL;同时优化包被抗原稀释液，最终确定用0.01mol/L pH7.4 PBS。(4)稀释倍数选择:选择金标液稀释倍数3倍。(5)金标垫与样品垫选择及预处理:金标垫类型选择玻纤型纤维素膜0194;将金标垫0194与玻纤型样品垫GL-b04分别用胶体金液实验，由于质地略有差异，玻纤型样品垫GL-b04溶液扩散效果更好;样品垫处理液配方优化:0.01mol/L pH7.4 PB、终浓度为1％蔗糖、1％吐温-20。(6) NC膜选择:对比三种型号的硝酸纤维素膜(AE99、Millipore180、SS24)，以性能最佳的作为试纸条NC膜，即Millipore180。(7)试纸条性能:灵敏度为8ng/mL，与莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林和马布特罗无交叉反应，特异性好;试纸条在室温下可存放60天;相同批次间试纸条随机抽取进行阴性、阳性检测，结果正确，性能一致，重复性好，不同批次间抽取半数（30个）试纸条检测，合格率在97％以上。
　　对新鲜动物组织（包括动物肌肉、肝脏）及动物性加工食品的前处理方法:取2g均质样品，用5mL0.2mol/L盐酸-4％NaCl沉淀蛋白，上清液保留，加入1mL1mol/L NaOH，4～5g NaCl，10mL乙酸乙酯萃取上清液中CLB，65℃氮吹干，用1mL0.01mol/L乙酸铵或pH7.4PBS复溶，检测模拟加标样品时，当CLB在猪肉、猪肉松和动物肝脏中不低于15ng/g，牛肉干中不低于20ng/g时可被检出。

目录

声明

摘要

第1章 前言

1．1 盐酸克伦特罗概述

1．1．1 盐酸克伦特罗性质

1．1．2 盐酸克伦特罗药理作用及残留情况

1．1．3 盐酸克伦特罗毒理作用

1．1．4 国内外盐酸克伦特罗中毒案例调查与法律要求·

1．1．5 盐酸克伦特罗监管分析

1．2 盐酸克伦特罗检测方法研究进展

1．2．1 免疫学分析法(IA)

1．2．2 分光光度法

1．2．3 色谱及色谱-质谱联用法

1．2．4 感官评价

1．3 胶体金技术应用

1．3．1 胶体金简介

1．3．2 胶体金免疫层析技术在医学及食品检测应用

1．4 论文主要研究目的、内容和创新点

1．4．1 研究目的

1．4．2 研究内容

1．4．3 创新点

第2章 CLB试纸条制备与组装

2．1 材料和仪器

2．1．1 主要试剂与材料

2．1．2 主要仪器设备

2．2 胶体金制备

2．2．1 玻璃器皿预处理

2．2．2 柠檬酸三钠还原法制备金溶液

2．2．3 金颗粒质量评价

2．3 免疫金制备

2．3．1 标记最适pH选择

2．3．2 胶体金抗体最佳标记量确定

2．3．3 金标封闭条件选择

2．4 金标抗体复溶液选择

2．5 金标抗体活性鉴定

2．6 金标液稀释倍数选择

2．7 试纸条质控线、检测线浓度选择

2．8 T线稀释液选择

2．9 试纸条组装材料选择

2．9．1 金标垫选择

2．9．2 NC膜选择

2．9．3 样品垫选择及处理

2．10 试纸条性能测试

2．10．1 试纸条组装

2．10．2 试纸条灵敏度确定

2．10．3 交叉反应率

2．10．4 试纸条稳定性试验

第3章 CLB试纸条制备的结果与分析

3．1 柠檬酸三钠用量对胶体金制备影响与评价

3．2 免疫金制备

3．2．1 抗体标记pH选择

3．2．2 抗体最佳标记量确定

3．3 金标封闭条件确定

3．3．1 金标封闭液选择

3．3．2 封闭液BSA浓度确定

3．3．3 封闭温度确定

3．4 金标复溶液选择

3．4．1 复溶液组分确定

3．4．2 复溶液pH及PB缓冲液浓度确定

3．5 金标抗体活性鉴定

3．6 选择合理的金标抗体稀释倍数

3．7 试纸条二抗浓度及包被抗原浓度确定

3．7．1 二抗(C线)浓度确定

3．7．2 包被抗原处(T线)浓度确定

3．8 T线稀释液确定

3．9 试纸条组装材料确定

3．9．1 金标垫类型选择

3．9．2 NC膜最优选择

3．9．3 样品垫选择与处理液选择

3．10 试纸条性能测试

3．10．1 试纸条灵敏度确定

3．10．2 试纸条交叉反应测试

3．10．3 试纸条稳定性试验

3．10 讨论

3．10．1 金液制备

3．10．2 金标抗体条件选择

3．10．3 硝酸纤维素膜(NC膜)选择

3．10．4 金标垫、样品垫选择

3．11 本章小结

第4章 样品前处理方法优化

4．1 主要仪器设备

4．2 主要试剂与材料

4．3 试验方法

4．3．1 生鲜猪肉组织中盐酸克伦特罗粗提方法

4．3．2 样品提取缓冲液优化

4．3．3 试纸条在猪肉组织检测中的应用

4．3．4 样品前处理方法优化

4．4 结果分析与讨论

4．4．1 猪肉组织粗提法选择

4．4．2 样品提取缓冲液优化

4．4．3 试纸条在猪肉组织中的检测应用

4．4．4 样品前处理方法选择

4．4．5 讨论

4．5 本章小结

第5章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

致谢

参考文献