利用唾液链球菌嗜热亚种生产γ－氨基丁酸的方法

摘要

本发明阐述了一种γ－氨基丁酸的生产方法，它是以唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus thermophilus)为菌种，作用于谷氨酸、谷氨酸盐、含谷氨酸或谷氨酸盐的物质，使谷氨酸的α－羧基发生脱羧作用，从而生成γ－氨基丁酸。该方法属于生物合成法，无需高温高压反应条件和有毒有害原料，专一性高，副产物少，而且唾液链球菌嗜热亚种为食品微生物，安全性高，因此可用于化工、食品、饲料或纯化后用于医药等行业。

说明书

技术领域

本发明涉及利用唾液链球菌嗜热亚种生产γ-氨基丁酸的方法，属于一种生物合成γ-氨基丁酸的生产方法，包括用唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus thermophilus)或唾液链球菌嗜热亚种的谷氨酸脱羧酶生产γ-氨基丁酸。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)，又叫氨酪酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质，具有重要的生理功能，如降低血压、利尿、镇痛安神、改善脑机能、增进脑活力、促进长期记忆、营养神经细胞、改善更年期综合症等。当大脑长期缺乏GABA将会导致癫痫、帕金森等疾病。同时GABA还与脑衰老有关，其缺乏将导致老年人“耳不聪、目不明”。另外，GABA能促进精子的穿卵能力，提高受精率，以及可以提高饲料利用率和日增重。γ-氨基丁酸正被广泛运用于医药、食品保健、化工及农业等行业。GABA的生产主要可以通过化学合成和生物合成两条途径。化学合成反应条件剧烈，采用的化学溶剂具有毒性和腐蚀性，副产物多，缺乏安全性，主要应用于化工行业；生物合成法较化学合成法具有条件温和、环境污染相对较低、安全性高等优点。另外，由于微生物具有生长速度快、生长条件较简单、代谢过程特殊和分布广等特点，因此利用微生物生产GABA，不受资源、环境和空间的限制，具有显著的优点。

目前已经有一些利用不同种属的微生物生产GABA的报道。【文摘】用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，与1％谷氨酸溶液进行间歇反应、连续搅拌式反应及连续柱式反应生产GABA。间歇反应5h转化率达到了100％；连续搅拌式反应在三角瓶反应器中进行，以6ml/h的流速输入底物溶液和输出反应液，转化率达85％；连续柱式反应器中进行，控制流速12ml/h，转化率达95％。赵景联等，《生物工程学报》，1989，5(2)：124-128。【文摘】用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行转化生产GABA，获得了GABA含量达到了98.94％，收率为49.65％。章汝平等，长沙电力学院学报(自然科学版)，1998，13(4)：433-435。【文摘】介绍了对Koji制作中GABA的变化，GABA含量达到了120μg/g。Kono I等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，2000，64(3)：617-619。【文摘】利用Monascus purpureusNTU 601进行固体发酵，GABA含量达到了5004mg/kg。Wang JJ等，J Ind Microbiol Biotechnol，2003，30：669-676。【文摘】报道了采用Monascuspurpureus CCRC31615进行固体发酵，GABA含量达到了1200mg/kg。SuYC等，JIndMicrobiol Biotechnol，2003，30(1)：41-46。【文摘】介绍了从生产奶酪的菌株中分离到一株Lactococcus lactis 01-7，用于奶酪生产，奶酪的GABA的含量达到了383mg/kg。Nomura M等，JD airy Sci.，1998，81：1486-1491。【文摘】从乳酸菌中筛选到了高产GABA的Lactococcus lactis菌株，25L罐发酵72h，发酵液的GABA达到了250mg/100ml。许建军，博士学位论文，江南大学，2004年2月。【文摘】也对高产GABA乳酸菌筛选和发酵条件进行了报道，发酵液中的GABA达到3.1g/l。刘清等，氨基酸和生物资源，2004，26(1)：40-43。【文摘】报道了利用Lactobacillus brevis IFO-12005对酒糟进行发酵，GABA的含量达到了10.18mM，通过离心、絮凝、脱色和脱臭处理获得了较好的GABA溶液，可用于食品强化GABA。Yokoyama S等，Journal of Bioscienceand Bioengineering，2002，93(1)：95-97。【文摘】采用Lactobacillus plantarum利用含有米糠抽提液的培养基发酵生产GABA，在干粉含量达到了5％。爱宕世高等，食品と科学，2001，No.8，81-85。【文摘】筛选到了Saccharomyces cerevisiae UT-1的GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶缺陷突变型菌株GAB7-1和GAB7-2，其发酵液中GABA浓度分别达到了0.4mM和0.42mM，较野生株分别提高了2.0和2.1倍。Takahashi T等，Journal of Bioscience and Bioengineering，2004，97(6)：412-418。

唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus thermophilus)已经广泛用于生产酸奶、泡菜等食品。但是目前未见有利用唾液链球菌嗜热亚种或利用其谷氨酸脱羧酶生产γ-氨基丁酸的报道。唾液链球菌嗜热亚种为食品微生物，具有极高的安全性，本发明利用其为菌种生产γ-氨基丁酸可以运用于食品、医药、饲料等行业。

发明内容

技术问题本发明的目的在于提供利用唾液链球菌嗜热亚种生产γ-氨基丁酸的方法，涉及一种生物合成γ-氨基丁酸的生产方法，可以生产高含量的γ-氨基丁酸，可以大大降低生产成本。具有很高的安全性，因此利用其生产的含γ-氨基丁酸的料液或发酵制品可以直接食用或根据生产需要直接作为富γ-氨基丁酸辅料，也可以对其GABA进行提取和纯化。

技术方案γ-氨基丁酸的分子量为103.1，结构式为：

本发明是这样实现的：通过唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus thermophilus)或其谷氨酸脱羧酶作用于谷氨酸或谷氨酸盐以及含谷氨酸或谷氨酸盐的物质，使谷氨酸或谷氨酸盐发生脱羧基作用生成γ-氨基丁酸。

γ-氨基丁酸的生产方法有如下四种形式：

一、通过对唾液链球菌嗜热亚种进行培养，离心收集菌体，对菌体进行破碎，取破碎后的悬浊液或再次离心后的上清液与谷氨酸或谷氨酸盐以及含谷氨酸或谷氨酸盐的物质混合，然后在一定的pH值和温度下进行生化反应，从而获得含γ-氨基丁酸的反应液。

二、通过对唾液链球菌嗜热亚种进行培养，离心收集菌体，将菌体与谷氨酸或谷氨酸盐溶液或悬浊液以及含谷氨酸或谷氨酸盐的物质混合液混合，然后在一定的pH值和温度下进行细胞转化反应，从而获得含γ-氨基丁酸的反应液。

三、将唾液链球菌嗜热亚种的种子液接种到含有谷氨酸或谷氨酸盐的发酵培养基中，在一定的pH值和温度下进行发酵，从而获得含γ-氨基丁酸的发酵液。

四、在以唾液链球菌嗜热亚种作为菌种的发酵制品的生产过程中，加入谷氨酸或谷氨酸盐。在这些发酵制品的生产过程中，唾液链球菌嗜热亚种将谷氨酸或谷氨酸盐转化生成γ-氨基丁酸，从而获得富含γ-氨基丁酸的发酵制品。

有益效果 本发明的优点：

本发明首次发现唾液链球菌嗜热亚种具有很高的谷氨酸脱羧酶活性，利用其作为菌种，可以生产高含量的γ-氨基丁酸，可以大大降低生产成本。同时唾液链球菌嗜热亚种为食品微生物，经过长期的实践证明，具有很高的安全性，因此以其生产的γ-氨基丁酸可以应用于食品、医药和饲料等行业。另外，唾液链球菌嗜热亚种为食品微生物，因此利用其生产的含γ-氨基丁酸的料液或发酵制品可以直接食用或根据生产需要直接作为富γ-氨基丁酸辅料。

具体实施方式

实施例1：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，参照《酶工程》(郭勇主编，中国轻工业出版社，2000年)所述方法对唾液链球菌嗜热亚种的谷氨酸脱羧酶进行提取。然后将酶液与谷氨酸或谷氨酸盐溶液混合，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1h～3d，即可得到含0.1％～70％γ-氨基丁酸的反应液。

实施例2：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，将菌体进行破碎，参照《酶工程》(郭勇主编，中国轻工业出版社，2000年)所述方法对唾液链球菌嗜热亚种的谷氨酸脱羧酶进行提取。然后将酶液与含谷氨酸或谷氨酸盐的物质混合，调节pH3.2～8.0，于20～80℃下反应1～5d，即可得到含γ-氨基丁酸的基料。

实施例3：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸盐溶液混合，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～10d，离心分离菌体，即可得到含量不等的γ-氨基丁酸的转化液。

实施例4：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸盐溶液混合，加入适量吐温(Tween)、蔗糖酯或特里顿(Triton)等表面活性剂，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～10d，离心分离菌体，即可得到含量不等的γ-氨基丁酸的转化液。

实施例5：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，采用0.5～10％的甲苯处理，再离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸盐溶液混合，加入适量吐温(Tween)、蔗糖酯或特里顿(Triton)等表面活性剂，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～10d，离心分离菌体，即可得到含量不等的γ-氨基丁酸的转化液。

实施例6：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，采用0.5～10％的甲苯处理，再离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸盐溶液混合，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～10d，离心分离菌体，即可得到含量不等的γ-氨基丁酸的转化液。

实施例7：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸盐的悬浊液混合(半固体状态)，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～15d，离心分离菌体，即可得到含量不等的γ-氨基丁酸的转化液。

实施例8：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸盐的悬浊液混合(半固体状态)，加入适量吐温(Tween)、蔗糖酯或特里顿(Triton)等表面活性剂，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～10d，离心分离菌体，即可得到含量不等的γ-氨基丁酸的转化液。

实施例9：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，采用0.5～10％的甲苯处理，再离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸盐的悬浊液混合(半固体状态)，加入适量吐温(Tween)、蔗糖酯或特里顿(Triton)等表面活性剂，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～10d，离心分离菌体，即可得到含量不等的γ-氨基丁酸的转化液。

实施例10：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，采用0.5～10％的甲苯处理，再离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸盐的悬浊液混合(半固体状态)，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行搅拌反应1～10d，离心分离菌体，即可得到含量不等的γ-氨基丁酸的转化液。

实施例11：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，采用0.5～10％的甲苯处理，再离心收集菌体，然后将菌体进行固定化，以pH3.2～8.0的谷氨酸或谷氨酸盐溶液，于20～80℃反应，离心或过滤分离固定化细胞，即可得到含γ-氨基丁酸的溶液。或者将固定化细胞装柱，在通过流加谷氨酸或谷氨酸盐溶液(pH3.2～8.0)，于20～80℃下进行连续或间歇式反应。

实施例12：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，采用0.5～10％的甲苯处理，再离心收集菌体，然后将菌体进行固定化，与谷氨酸或谷氨酸盐溶液混合，加入适量吐温(Tween)、蔗糖酯或特里顿(Triton)等表面活性剂，在pH3.2～8.0条件下，于20～80℃反应，离心或过滤分离固定化细胞，即可得到含γ-氨基丁酸的溶液。或者将固定化细胞装柱，在通过流加含适量吐温(Tween)、蔗糖酯或特里顿(Triton)等表面活性剂的谷氨酸或谷氨酸盐溶液(pH3.2～8.0)，于20～80℃下进行连续或间歇式反应。

实施例13：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，然后将菌体进行固定化，与谷氨酸或谷氨酸盐溶液混合，在pH3.2～8.0条件下，于20～80℃反应，离心或过滤分离固定化细胞，即可得到含γ-氨基丁酸的溶液。或者将固定化细胞装柱，在通过流加谷氨酸或谷氨酸盐溶液(pH3.2～8.0)，于20～80℃下进行连续或间歇式反应。

实施例14：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，采用0.5～10％的甲苯处理，再离心收集菌体，然后将菌体进行固定化，与谷氨酸或谷氨酸盐溶液混合，在pH3.2～8.0条件下，于20～80℃反应，离心或过滤分离固定化细胞，即可得到含γ-氨基丁酸的溶液。或者将固定化细胞装柱，在通过流加含适量吐温(Tween)、蔗糖酯或特里顿(Triton)等表面活性剂的谷氨酸或谷氨酸盐溶液(pH3.2～8.0)，于20～80℃下进行连续或间歇式反应。

实施例15：

将唾液链球菌嗜热亚种经过逐级扩大培养制成种子液，接种到含谷氨酸或谷氨酸盐的发酵培养基(pH3.2～8.0)中，于20～60℃进行发酵1～10天，即可得到含γ-氨基丁酸的发酵液。

实施例16：

将唾液链球菌嗜热亚种经过逐级扩大培养制成种子液，接种到发酵培养基(pH4.0～8.0)中，于30～60℃进行发酵1～2天，然后加入谷氨酸或谷氨酸盐溶液，再继续发酵1～10天，即可得到含γ-氨基丁酸的发酵液。

实施例17：

将唾液链球菌嗜热亚种经过逐级扩大培养制成种子液，接种到发酵培养基(pH4.0～8.0)中，于30～60℃进行发酵1～2天，然后加入谷氨酸或谷氨酸盐溶液或固体，再继续发酵1～10天，即可得到含γ-氨基丁酸的发酵液。

实施例18：

唾液链球菌嗜热亚种经过扩大培养后，离心收集菌体，将菌体进行破碎，以盐溶液、缓冲液、酸溶液或碱溶液对谷氨酸脱羧酶进行提取，然后将谷氨酸脱羧酶酶液添加到含谷氨酸或谷氨酸盐的动物奶中，在pH3.2～8.0，20～80℃下进行反应1～24h，制成含0.001％～0.1％γ-氨基丁酸的乳制品。

实施例19：

在动物奶中添加适量谷氨酸或谷氨酸盐，灭菌后，再接种唾液链球菌嗜热亚种和乳杆菌，于30～60℃进行发酵4～48h，即可制成含γ-氨基丁酸的酸奶。