β－七叶皂甙钠在制备治疗白血病药物中的应用

摘要

本发明涉及β－七叶皂甙钠在制备治疗白血病药物中的应用。β－七叶皂甙钠可抑制K562、HL－60细胞增殖，极易显著诱导白血病细胞凋亡，为其应用于白血病治疗提供了有益线索；β－七叶皂甙钠体外抗肿瘤活性很强，量效关系明显，作用随时间延长而增强，为抗白血病新药筛选提供了基础。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及β-七叶皂甙钠在制备治疗白血病药物中的应用。

(二)背景技术

七叶皂甙钠是从中药娑罗子干燥成熟果实中提取所得的总皂甙，主要有效成分为七叶皂苷A、B、C、D，根据德国DAC的定义七叶皂苷A、B称为β-七叶皂甙，C、D七叶皂甙称为α-七叶皂甙。β-七叶皂甙钠具有抗炎性渗出、消除肿胀、增加静脉张力、改善微循环促进肢体功能挥复等作用，这已在国外药理学研究和临床实践中被证实，临床主要应用于脑水肿、颅脑外伤、脑梗死、乙型脑炎及肢体肿胀等疾病的治疗。

白血病是人体血液中白细胞的恶性病变。其病理特征是在骨髓和造血组织中有广泛的白血病细胞异常增生及浸润其他组织器官。在周围血液中，白细胞有质与量的改变，数目增多或减少，并伴有幼稚细胞增多，由于异常白血病细胞增生而影响造血组织的正常造血。临床常有贫血、发热、出血及肝、脾淋巴结肿大等征象。本病起病多急骤，进展迅速，自然存活期在6个月～1年之内，经化疗取得完全缓解后，长期无病生存率可达20％～40％，骨髓移植后可有50％以上患者获得长期无病生存。白血病具有与其他恶性癌瘤的共同特点。即：(1)白血病细胞和恶性肿瘤细胞一样，可以无限制地增生；(2)白血病细胞也可像其他恶性肿瘤细胞一样，无阻拦地侵犯人体的各种脏器，影响脏器功能，导致全身衰竭而死亡；(3)白血病也可以表现为局部浸润，如肿瘤一样形成肿块。如皮肤浸润结节及儿童常见的眼窝部绿色瘤等。故一般人常将白血病称为″血癌″。

在机体的生长发育中，细胞的增殖与死亡(坏死、凋亡)过程达到动态平衡是维护其自身恒定的必要条件，一旦两者间的平衡失调就会诱发多种疾病。肿瘤细胞的最大特征是异常增殖，凋亡减退。肿瘤细胞凋亡的诱导是治疗肿瘤的新途径。细胞凋亡作为细胞的一种基本生命现象，贯穿于个体生长、发育直至死亡的整个生命过程中，因而有着极其重要的意义。有关中药与细胞凋亡的研究已有不少报道，发现一些中药可通过抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡来达到治疗肿瘤的目的，但大多作用微弱，无实际应用价值。β-七叶皂甙钠(七叶皂苷，Escin)是由中药娑罗子干燥成熟果实中提取的三萜葡萄糖甙类化合物，具有抗炎症渗出、增加静脉张力等药理作用，在国内外已被广泛用于颅脑外伤、脑梗死及肢体肿胀等疾病的治疗。

国内研究发现，β-七叶皂甙钠可使静脉收缩和促进淋巴回流作用，其有效持续5小时以上；另外，β-七叶皂甙钠可抑制血浆渗入胸腔和白细胞游入胸腔，还能减轻自由基对细胞及周围组织的损害作用，使肾上腺分泌皮质醇，抑制组织胺所致毛细血管通透性，研究表明β-七叶皂甙钠可用于制备治疗癌性胸水的药物。另有实验证明，β-七叶皂甙钠对肝癌引起的腹水，也有着较好的治疗效果：β-七叶皂甙钠作用主要是抗渗出及消肿，而且能扩张动脉，增加静脉张力，改善微循环，还能使肾上腺皮质分泌皮质醇，抑制组织胺引起的毛细血管通透性增加，因而有明显的抗炎、消肿作用。

但有关β-七叶皂甙钠在抑制白血病细胞增殖和诱导凋亡的研究未见报道。

(三)发明内容

本发明既是为了提供β-七叶皂甙钠在制备治疗白血病药物中的应用，为新药筛选提供依据。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

β-七叶皂甙钠在制备治疗白血病药物中的应用，主要通过抑制红白血病细胞K₅₆₂增殖和诱导白血病细胞K₅₆₂凋亡来发挥作用，而且，β-七叶皂甙钠也可抑制人早幼粒系白血病细胞HL-60增殖和诱导白血病细胞HL-60的凋亡。

β-七叶皂甙钠终浓度为10～70mg.L^-1，有效时间为24～72小时，终浓度优选30～50mg.L^-1，所述的药物还含有药物赋形剂或载体，β-七叶皂甙钠也可与其他药物共同使用。

本发明的有益效果主要体现在：(1)β-七叶皂甙钠可抑制K562、HL-60细胞增殖，极易显著诱导白血病细胞凋亡，为其应用于白血病治疗提供了有益线索；(2)β-七叶皂甙钠体外抗肿瘤活性很强，量效关系明显，作用随时间延长而增强，为抗白血病新药筛选提供了基础。

(四)附图说明

图1为β-七叶皂甙钠对K562细胞生长的影响示意图；

图2为β-七叶皂甙钠对CFU-K562集落形成的影响示意图；

图3为K562细胞经β-七叶皂甙钠作用不同时间后的DNA片段分析图：其中1为Maker(50bp Ladder)，2为对照细胞，3为经10mg.L^-1的药物作用24h的细胞，4为经30mg.L^-1的药物作用24h的细胞，5为经50mg.L^-1的药物作用24h的细胞，6为经70mg.L^-1的药物作用24h的细胞；

图4为流式细胞术分析β-七叶皂甙钠作用后的K562细胞DNA含量结果图：其中a为对照细胞，b为经30mg.L^-1的药物作用24h的细胞，c为经50mg.L^-1的药物作用24h的细胞；

图5为β-七叶皂甙钠对HL-60细胞生长的影响示意图；

图6为β-七叶皂甙钠对CFU-HL-60集落形成的影响示意图；

图7为HL-60细胞经β-七叶皂甙钠作用不同时间后的DNA片段分析图：

其中1为Maker(50bp Ladder)，2为对照细胞，3～5为分别为经30mg.L^-1的药物作用24、48、72h的细胞，6～8分别为经50mg.L^-1的药物作用24、48、72h的细胞。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述：

实施例1：β-七叶皂甙抑制K562细胞增殖及诱导凋亡

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器

β-七叶皂甙钠购自烟台绿叶制药有限公司，批号20021006，纯度为88.6％，用IMDM培养液配成所需浓度的工作液，用0.25μm孔径的滤膜正压过滤除菌，4℃保存。Annexin V-FITC购自PharMingen，PI由Sigma公司提供。流式细胞仪，美国Coulter公司，Epics-XL型。

1.2细胞培养

K562细胞株购自上海细胞所，在37，5％CO₂条件下，用含体积分数10％小牛血清、青霉素(1×10⁵U.L^-1)、链霉素(100μmol.L^-1)的IMDM培养液传代培养，实验用细胞均处于对数生长期。

1.3细胞增殖抑制试验

取对数生长期细胞，以0.5×10⁶.ml^-1为起始浓度，分别加入10、30、50和70mg.L^-1的β-七叶皂甙钠，对照组不加药物。分别于培养24、48和72h后，进行以下实验：

I，台盼蓝染色，计数活细胞数，确定细胞活力，并计算药物对细胞生长的抑制率，同样的实验重复3次；

II，CFU-K562集落培养：2ml IMDM培养体系中含体积分数20％小牛血清、青霉素(1×10⁵U.L^-1)、链霉素(100μmol.L^-1)、0.3％琼脂和5×10³.ml^-1细胞，以0.5ml.孔^-1接种于24孔培养板中，每组设3个平行孔，培养5天后计数集落(＞20个细胞)数。

1.4细胞形态学观察

细胞悬液经离心涂片机涂片，甲醇固定5min、苏木精染色1min、1％盐酸分化10s。自来水冲洗，晾干，油镜下观察。

1.5DNA片段分析

收集2.5×10⁶细胞，经冷PBS洗涤后，加入50μl细胞裂解液(1％NP-40、0.5mol.L^-1 EDTA、1mol.L^-1 Tris.HCL，pH 7.5)作用10s后收集上清。重复提取1次，合并上清共100μl，加入RNAase A和10％SDS，使终浓度分别为3mg.L^-1和1％，56℃作用2h。然后加入蛋白酶K，终浓度为2mg.L^-1，37℃作用3h。加入1/10体积的3mol.L^-1乙酸钠和2倍体积的100％乙醇，沉淀DNA。离心并洗涤后，DNA沉淀加10μl TE缓冲液(10mmol.L^-1 Tris.CL，1mol.L^-1 EDTA，pH 8.0)在56℃水浴中溶解30min。然后加染料，在1.2％琼脂糖凝胶上电泳2～3h，紫外光下观察并摄影，同样的实验重复3次。

1.6Annexin V-FITC/PI标记法分析

收集细胞1×10⁵，冷PBS洗涤后，重新悬浮于100μl Binding缓冲液(10mmol.L^-1 HEPES/NaOH、140mmol.L^-1 NaCl、2.5mmol.L^-1 CaCl₂，pH7.4)，加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI(50mg.L^-1)，轻摇混匀后，室温孵育15min(避光)，加入400μl Binding缓冲液，1h内用流式细胞仪分析细胞凋亡、坏死和活细胞的百分率。

1.7流式细胞术检测DNA含量

0.5×10⁶细胞用PBS洗涤后，用含1％多聚甲醛的PBS液，4℃固定30min，洗涤后，沉淀重新悬浮于0.1％Triton-100的PBS液中，加PI(1g.L^-1)25μl，4℃暗处保存。检测前30min加入10μg.L^-1RNAase A5μl，室温放置30min，流式细胞仪检测。

1.8统计学处理

用SPSS10.0统计软件包中的t检验进行统计学处理。

2结果

2.1细胞增殖抑制试验结果

结果见图1和图2。从图1和图2可见药物作用呈时间和剂量依赖式：30mg.L^-1和50mg.L^-1的β-七叶皂甙钠分别作用于细胞24、48和72h，细胞生长抑制率和集落形成抑制率均明显高于对照组(P＜0.05)。10mg.L^-1的β-七叶皂甙钠作用不显著(P＞0.05)，70mg.L^-1的β-七叶皂甙具有一定的细胞毒作用，细胞增殖被完全抑制。

2.2细胞形态学结果

K562细胞经30～50mg.L^-1的药物作用24～72h后，显微镜下可见部分细胞变长，膜鼓起并逐渐脱离细胞形成凋亡小体。染色后可观察到细胞出现一系列的形态变化：染色质浓聚，形成致密的染色质团块，并沿核膜边缘聚集，胞质空泡化，继之核固缩，碎裂成大小不等的核物质，细胞膜包裹裂解的细胞核及细胞浆形成凋亡小体。

2.3DNA片段分析结果

结果见图3。从图3可见30、50和70mg.L^-1的β-七叶皂甙钠作用于细胞24h可见DNA梯带，10mg.L^-1组未见。

2.4Annexin V-FITC/PI标记法结果

不同浓度的药物作用于K562细胞24h后，各处理组凋亡、坏死和活细胞的百分率具体见表1，细胞凋亡率最高达48.7％，70mg.L^-1组细胞坏死比率明显增高。

                             表1

  浓度/mg.L^-1  凋亡细胞/％  坏死细胞/％  活细胞/％  对照组            -  1.8±0.4  2.1±0.3  96.1±2.4  β-七叶皂甙钠  10  7.8±0.9  3.7±0.5  88.5±3.4  30  21.5±3.7^*  9.2±1.7^*  71.2±4.1^*  50  48.7±5.6^*  15.7±1.9^*  35.6±2.8^*  70  32.1±3.2^*  44.9±2.7^*  23.0±4.1^*

2.5流式细胞术分析DNA含量结果

结果见图4。30和50mg.L^-1的β-七叶皂甙钠作用于细胞24h，流式细胞仪直方图上呈现特征性的亚二倍体峰，即凋亡小峰(Ap峰)。凋亡率分别为21.8％和42.4％，与Annexin V-FITC/PI标记法结果相符。

3.结论

实验发现β-七叶皂甙钠可时间和剂量依赖式抑制细胞增殖，极显著诱导细胞凋亡：流式细胞术观察到Ap峰，琼脂糖凝胶电泳观察到DNA梯带；Annexin V-FITC测定观察到细胞凋亡率明显增加。30和50mg.L^-1的β-七叶皂甙钠分别作用于细胞24，48和72h，细胞生长抑制率最高达81.8％，细胞凋亡率最高达48.7％。低剂量(10mg.L^-1)的β-七叶皂甙钠作用不明显；高剂量(70mg.L^-1)的β-七叶皂甙钠作用于K562细胞48和72h，细胞增殖完全被抑制，出现细胞毒作用。本研究表明，β-七叶皂甙钠体外抗白血病活性很强，量效关系明显，作用随时间延长而增强，极有希望发展成抗白血病新药。

实施例2：β-七叶皂甙钠抑制HL-60细胞增殖及诱导凋亡

1材料与方法

1.1材料

细胞：HL-60细胞株，由中科院上海细胞所提供。

药品：β-七叶皂甙钠购自烟台绿叶制药有限公司，批号20021006，纯度为88.6％，用培养液配成所需浓度的工作液，用0.25μm孔径的滤膜正压过滤除菌，4℃保存。Annexin V-FITC购自PharMingen、PI由Sigma公司提供。流式细胞仪，美国Coulter公司，Epics-XL型。

1.2方法

1.2.1细胞培养

HL-60细胞在37℃，5％CO₂条件下，用含体积分数10％小牛血清、青霉素(1×10⁵U.L^-1)、链霉素(100μmol.L^-1)的IMDM培养液传代培养，实验用细胞均处于对数生长期。

1.2.2细胞生长抑制试验

取对数生长期细胞，以0.5×10⁶/ml为起始细胞浓度，分别加入10，30，50和70mg.L^-1的β-七叶皂甙钠，对照组不加药物。分别于培养24，48和72h后，台盼蓝染色，计数活细胞数，确定细胞活力，并计算药物对细胞生长的抑制率，同样的实验重复3次；

1.2.3CFU-HL-60集落培养

采用常规体外半固体集落培养法。2ml IMDM培养体系中含体积分数20％小牛血清、青霉素(1×10⁵U.L^-1)、链霉素(100μmol.L^-1)、0.3％琼脂和5×10³/ml细胞，以0.5ml/孔接种于24孔培养板中，每组设3个平行孔，培养5天后计数集落数(＞20个细胞)，计算药物对细胞形成CFU-HL-60集落的抑制率。

1.2.4DNA片段分析

收集2.5×10⁶细胞，经冷PBS洗涤后，加入50μl细胞裂解液(1％NP-40、0.5mol.L^-1 EDTA、1mol.L^-1Tris.HCL，pH 7.5)作用10s后收集上清。重复提取1次，合并上清共100μl，加入RNAase A和10％SDS，使终浓度分别为3mg..L^-1和1％，56℃作用2h。然后加入蛋白酶K，终浓度为2mg.L^-1，37℃作用3h。加入1/10体积的3mol.L^-1乙酸钠和2倍体积的100％乙醇，沉淀DNA。离心并洗涤后，DNA沉淀加10μl TE缓冲液(10mmol/L Tris.CL，1mol.L^-1EDTA，pH 8.0)在56℃水浴中溶解30min。然后加染料，在1.2％琼脂糖凝胶上电泳2～3h，紫外光下观察并摄影，同样的实验重复3次。

1.2.5Annexin V-FITC/PI标记法

收集细胞1×10⁵，冷PBS洗涤后，重新悬浮于100μl Binding缓冲液(10mmol.L^-1HEPES/NaOH、140mmol.L^-1NaCl、2.5mmol.L^-1CaCl₂，pH7.4)，加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI(50mg..L^-1)，轻摇混匀后，室温孵育15min(避光)，加入400μl Binding缓冲液，1h内流式细胞仪分析凋亡、坏死和活细胞的百分率。

1.3统计学处理

用SPSS10.0统计软件包中的t检验进行统计学处理。

2结果

2.1β-七叶皂甙钠对HL-60细胞生长的影响

实验结果见图5，药物作用呈时间和剂量依赖式：30和50mg.L^-1的β-七叶皂甙钠分别作用于细胞24，48和72h，生长抑制率明显高于对照组(P＜0.05)，抑制率最高分别达到52.8％和79.8％。10mg.L^-1的β-七叶皂甙钠作用不显(P＞0.05)，70mg.L^-1的β-七叶皂甙具有一定的细胞毒作用。

2.2β-七叶皂甙钠对CFU-HL-60集落生成的影响

实验结果见图6，药物对CFU-HL-60的作用也与时间和剂量有关：30和50mg.L^-1的β-七叶皂甙钠分别作用于细胞24，48和72h，集落形成抑制率明显高于对照组(P＜0.01)，集落形成抑制率最高分别达到67.8％和89.6％。10mg.L^-1的β-七叶皂甙钠作用不显著(P＞0.05)，70mg.L^-1的β-七叶皂甙作用48和72h细胞增殖被完全抑制，抑制率达100％。

2.3DNA片段分析

实验结果见图7，HL-60细胞经30mg.L^-1的β-七叶皂甙钠作用24，48和72h后出现典型的DNA梯带，提示β-七叶皂甙钠可使细胞内源性核酸酶活性增高，将核小体之间的DNA切割形成180-200bp的多聚体。50mg.L^-1的药物作用24和48h可见DNA梯带，72h DNA梯带不明显，可能因为细胞坏死较多。

2.4Annexin V-FITC/PI分析

不同浓度的药物作用于HL-60细胞24h后，各处理组凋亡、坏死和活细胞的百分率具体见表2，细胞凋亡率最高达54.8％，70mg.L^-1组细胞坏死比率明显增高。

表2Annexin V-FITC分析细胞凋亡、坏死和存活的百分率(x±s)

  浓度(mg.L-1)  n  凋亡率(％)  坏死率(％)  存活率(％)  0  3  1.6±0.4  2.1±0.5  96.3±8.4  10  3  9.6±1.2  3.7±0.8  86.7±5.1  30  3  31.8±4.3^**  7.4±1.7^*  60.8±6.7^**  50  3  54.8±6.1^**  18.7±2.6^**  26.5±5.6^**  70  3  42.2±3.2^**  46.1±2.7^*  11.7±3.7^**

注：与对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

3结论

β-七叶皂甙可时间和剂量依赖式抑制HL-60白血病细胞增殖，极显著诱导细胞凋亡：琼脂糖凝胶电泳观察到DNA梯带；Annexin V-FITC测定观察到细胞凋亡率明显增加。低剂量(10mg.L^-1)的β-七叶皂甙钠作用不明显；高剂量(70mg.L^-1)的β-七叶皂甙钠作用于HL-60细胞48和72h，细胞增殖完全被抑制，出现细胞毒作用。研究表明，β-七叶皂甙钠体外抗肿瘤活性很强，量效关系明显，作用随时间延长而增强，极有希望发展成抗肿瘤新药。