来源于粉红色虾的新型组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶

摘要

本发明的目的是寻找和生产在低温区及中性至碱性条件下仍然保持高活性的组织蛋白酶L。在生长在日本的粉红色虾(Pandaluseous)的肝胰腺中成功地发现了一种新颖的在低温区保持其活性的组织蛋白酶L。此外，该新颖组织蛋白酶L的基因序列也已测定，这使得采用基因重组方法生产所述酶成为可能。

说明书

                    发明背景

技术领域

本发明涉及从北极甜虾(Pandalus eous)中抽提的新颖的组织蛋白酶L样酶、其纯化方法、编码组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶(最近从北极甜虾中鉴别出的一种新颖的蛋白酶)的多聚核苷酸、由该核苷酸编码的多肽以及所述多聚核苷酸和多肽的应用。

技术背景

蛋白酶是水解蛋白质肽键的酶的通称，它广泛分布于微生物、植物和动物中。已经分离出了许多具有不同的催化基团和底物特异性的蛋白酶。其应用范围也很广泛，它们可用在如食品、去污剂、化妆品原料、啤酒的澄清剂、皮革的软化剂以及药品的改性剂中。

蛋白酶是最重要的酶类之一，它水解蛋白质的肽键，广泛地分布于微生物、植物和动物中，参与许多生物学过程。此外，蛋白酶根据催化基团主要分为四类：天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。对于这些酶的分子作用机制已经作了广泛地研究。巯基蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)具有一个作为活性中心的巯基，包括如菠萝蛋白酶。属于所述半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶类的组织蛋白酶，可分为组织蛋白酶L类和组织蛋白酶B类。组织蛋白酶L类包括组织蛋白酶H、L、S、F、V和W，它具有两个重要的基序即ER(F/W)NIN基序和GNFD基序，均为不连续基序。组织蛋白酶B类以及组织蛋白酶C、O和X中不存在前一个基序ER(F/W)NIN。

在哺乳动物中，组织蛋白酶L存在于溶酶体中，虽然它不具有外切型蛋白酶活性特征，但是具有较强的内切蛋白酶活性。迄今，已从多种动物中鉴别出了组织蛋白酶L和组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶，并且测定了其序列。这些动物列举如下：

Bombys mori(家蚕)

Yamamoto Y.，Takimoto K.，Izumi S.，Toriyama-Sakurai M.，Kageyama T.，Takahashi S.Y.Molecular cloning and sequencing ofcDNA that encodes cysteine proteinase in the eggs of the silkmoth，Bombyx mori(家蚕卵中编码半胱氨酸蛋白酶的cDNA的分子克隆和序列测定).J.Biochem.116(6)：1330-1335(1994)。

Bos taurus(牛)

未公开。

Drosophila melanogaster(果蝇)

Tryselius Y.，Hultmark D.Cysteine proteinase 1(CP1)，a cathepsinL-like enzyme expressed in the Drosophila melanogaster haemocyte cellline mbn-2(半胱氨酸蛋白酶1(CP1)——一种组织蛋白酶L样酶在果蝇红细胞系mbn-2中的表达).Insect Mol.Biol.6(2)：173-181(1997)。

Homo sapiens(人)

Joseph L.J.，Chang L.C.，Stamenkovich D.，Sukhatme V.P.Complete nucleotide and deduced amino acid sequences of human andmurine preprocathepsin L.An abundant transcript induced bytransformation of fibroblasts(人和小鼠组织蛋白酶L前原酶的全部核苷酸序列和推测的氨基酸序列：纤维原细胞转化引起的丰富的转录产物).J.Clin.Invest.81(5)：1621-1629(1998)。

Homarus americanus(美洲螯龙虾)

Laycock M.V.，Mackay R.M.，Di Fruscio M.，Gallant J.W.Molecular cloning of three cDNAs that encode cysteine proteinases in thedigestive gland of the American lobster(Homarus americanus)(美洲螯龙虾(Homarus americanus)消化腺中编码半胱氨酸蛋白酶的三种cDNA的分子克隆).FEBS Lett.292：115-120(1991)。

Mus musculus(小鼠)

Portnoy D.A.，Erickson A.H.，Kochan J.，Ravetch J.V.，UnkelessJ.C.Cloning and characterization of a mouse cysteine proteinase(小鼠半胱氨酸蛋白酶的克隆和鉴定).J.Biol.Chem.261：14697-14703(1986)。

Nephrops norvegicus(挪威海螯虾)

Le Boulay C.，Van Wormhoudt A.，Sellos D.Molecualr cloningand sequencing of two cDNAs encoding cathepsin L-related cysteineproteinases in the nervous system and in the stomach of the Norwaylobster(Nephrops norvegicus)(挪威海龙虾(Nephrops norvegicus)神经系统和胃中编码组织蛋白酶L相关半胱氨酸蛋白酶的两种cDNA的分子克隆和序列测定).Comp.Biochem.Physiol.111：353-359(1995)。

Penaeus vannamei(太平洋白对虾)

Le Boulay C.，Van Wormhoudt A.，Sellos D.Cloning andexpression of cathepsin L-like proteinases in the hapatopancreas of theshrimp Penaeus vannamei during the intermoltcycle(蜕皮循环间期太平洋白对虾肝胰腺中的组织蛋白酶L样蛋白酶的克隆和表达).J.Comp.Physiol.B 166：310-318(1996)。

Rattus norvegicus(挪威大鼠)

Ishidoh K.，Towatari T.，Imajoh S.，Kawasaki H.，Kominami E.，Katunuma N.，Suzuki K.Molecular cloning and sequencing of cDNAfor rat cathepsin L(大鼠组织蛋白酶L cDNA的分子克隆和序列测定).FEBS Lett.223：69-73(1987)。

至于组织蛋白酶L的胶原蛋白分解活性，有报道称大鼠组织蛋白酶L在37℃酸性条件下降解胶原蛋白。Barrett，A.J.and Kirschke，H.，Cathepsin B，Cathepsin H，and Cathepsin L.(组织蛋白酶B、组织蛋白酶H和组织蛋白酶L)，Methods Enzymol.80，535-561.(1981)。

                    发明概述

上述组织蛋白酶L具有的最适pH在酸性条件下，最适温度为50-70℃。在上述文献报道的那些酶中，有些仅对酶的基因进行了克隆，因此对其特性没有进行研究。总之，迄今仍不知道是否有在低温、中性至碱性条件下具有较强活性的组织蛋白酶L。如果发现在低温和中性到碱性条件下仍具有较强活性的组织蛋白酶L，则使得对蛋白材料的特性进行改造的同时避免因蛋白质变性引起特性退化成为可能，并可提供在食品、去污剂、化妆品和药物的改性剂应用中极为有用的酶。

本发明人寻找了天然环境中的甚至能在低温条件下降解胶原蛋白的蛋白酶。经过大量广泛地筛选，结果本发明人意外地成功发现日本北极甜虾肝胰腺中的一种甚至在低温下也具有活性的新颖的蛋白酶。本发明的蛋白酶为组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶。

北极甜虾是典型的生活在-1.6-5℃低温环境中的适冷水生生物，它分布于北太平洋和北大西洋区域。有几遍报道证明，与哺乳动物相应的酶相比，适冷生物的酶表现出相当高的催化效力。例如丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶——一种研究最深入的蛋白酶，有报道称大麻哈鱼胰蛋白酶的催化效力较牛胰蛋白酶高40倍。

在筛选过程中，本发明人为防止肝胰腺细胞由于冰冻而导致破坏，将肝胰腺从天然的未经过冰冻的北极甜虾中取出。这样做的目的是使肝胰腺细胞中的酶在抽提时不至于被降解。本发明人还发现一种从速冻肝胰腺中纯化本发明的组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶的方法。

本发明的组织蛋白酶L样蛋白可通过离子交换柱、凝胶过滤柱、吸附柱、盐沉淀、透析、超滤、离心等方法的适当的组合从北极甜虾中纯化。例如，将肝胰腺从天然北极甜虾中切除、均浆、脱脂，然后用硫酸铵沉淀蛋白并重新溶解。上清经阴离子交换柱纯化、吸附层析分离以及离子交换柱再次纯化而制得蛋白。可采用的阴离子交换层析包括如Q-Sepharose和Mono Q；可采用的吸附层析包括如羟基磷灰石。同样地，也可用冻融的北极甜虾肝胰腺进行制备，其方法也是均浆、脱脂，然后离心和沉淀蛋白，重新溶解，透析，最后经阴离子交换柱纯化透析液、凝胶过滤层析分离以及吸附层析纯化。可采用的阴离子交换层析包括如Q-Sepharose和Mono Q；可采用的凝胶过滤层析包括如Superdex；可采用的吸附层析包括如羟基磷灰石。

由此所得北极甜虾的组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶具有如下特征：(1)分子量约为30KDa；(2)最适pH约为7-8；(3)最适温度约为35℃；(4)具有胶原蛋白分解活性；(5)具有组织蛋白酶L样活性。此外，本发明人采用基因工程方法进行了各种研究，结果成功地克隆了编码该酶的基因并揭示了该基因的全部碱基序列和推测的氨基酸序列，从而完成了本发明。本发明人还成功地克隆了编码预测与本发明酶具有类似构型的同工型的基因，并通过在酵母表达系统中表达它们而揭示了其特性。

表达所得的北极甜虾组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶的同工酶具有以下特征：(1)分子量约为30KDa；(2)最适pH约为6-8；(3)最适温度约为40℃(即使在20℃也具有活性)；(4)具有胶原蛋白分解活性；(5)具有组织蛋白酶L样活性。

这些来源于北极甜虾的新型组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶分别命名为北极甜虾组织蛋白酶L1和北极甜虾组织蛋白酶L2。此外，北极甜虾组织蛋白酶L1有时也称作NSL1或NsCtL，而北极甜虾组织蛋白酶L2有时也称作北极甜虾半胱氨酸蛋白酶、NsCys或Crustapain。

北极甜虾组织蛋白酶L1或L2可通过基因重组的方法进行生产，其中编码北极甜虾组织蛋白酶L1或L2的基因被整合进入适当的表达载体中，然后将所述重组表达载体导入合适的宿主。许多已知载体可用作表达载体。当采用大肠杆菌(E.coli)作为宿主时，载体的实施例包括pUR载体、pATH载体和pGEX载体系列。当采用动物细胞如COS和CHO作为宿主时，可使用载体如pXM和pDC201。

在采用大肠杆菌(E.coli)的系统中，例如，可将本发明的基因插入到表达载体如PGEX(Amersham Pharmacia)、pET39b(Novagen)以及pRSET(Invitrogen)中，导入大肠杆菌(E.coli)而诱导其表达。用SDS-PAGE确认所需分子量的基因表达。在采用酵母的系统中，插入有本发明的基因的酵母表达载体pPICZα通过电穿孔法导入宿主酵母巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)X-33菌株或KM71H菌株中，选择可在含高浓度(2000μg/ml)zeocin的培养基上生长的转化子。活性用明胶酶谱法检验，并检测与所需酶相应大小的条带。

本发明包括上述两种分离的组织蛋白酶L样蛋白酶及其天然突变体。本发明还包括由在北极甜虾组织蛋白酶L1或L2的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、置换或添加的氨基酸序列组成、并具有组织蛋白酶L样酶活性的蛋白。本发明还包括这些前原组织蛋白酶L样酶。本发明还包括多肽，其中该多肽与所述组织蛋白酶L1或L2全部或部分氨基酸序列80％或以上是相同的。本发明还包括所述组织蛋白酶L样酶的信号肽和前肽。所述前肽也用作本发明组织蛋白酶样酶的抑制剂。此外，本发明包括编码这些酶、其信号肽以及前肽的DNA。

例如，本发明包括的编码蛋白的DNA，在严格的条件下，可与由上述北极甜虾组织蛋白酶L1、北极甜虾组织蛋白酶L2、或其相应的前原酶以及具有组织蛋白酶样酶活性的互补链组成的DNA杂交。

严格条件下的杂交意味着先进行预杂交，预杂交是对其上通过120℃20分钟处理而结合有DNA的Hybond N⁺尼龙膜(AmershamPharinacia)，在Church磷酸缓冲液(0.5M Na₂HPO₄，1mM EDTA，7％SDS)中，于65℃处理5分钟。杂交是在相同的缓冲液中，加入下述方法制得的探针，于65℃进行17小时。杂交膜于室温下在含0.1％SDS的2×SSC(标准柠檬酸盐溶液；1×SSC为150mM NaCl、15mM柠檬酸钠，pH7.0)中处理20分钟，然后于65℃下用含0.1％SDS的1×SSC洗涤两次，每次20分钟。再一次于65℃下用含0.1％SDS的1×SSC处理膜20分钟，结束洗涤。X光片于-80℃下爆光24小时。

在制备探针时，例如用Takara随机引物DNA标记试剂盒第二版(Takara random primer DNA labeling kit Ver.2)(Takara)将由PCR扩增的cDNA片段标记上[α³²P]-dCTP。然后用离心式过滤器(Millipore)除去未反应的同位素。

本发明还包括编码北极甜虾组织蛋白酶L1、北极甜虾组织蛋白酶L2或由在其前原酶氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸的缺失、置换或添加的氨基酸序列组成并具有组织蛋白酶L样酶活性的蛋白的DNA，或编码具有组织蛋白酶L样酶活性的前原酶的DNA。

本发明还包括在编码北极甜虾组织蛋白酶L1、北极甜虾组织蛋白酶L2或其前原酶的DNA序列中缺失、置换或添加1-100个，优选为1-10个，更优选为一至几个碱基的DNA，其中所述DNA编码的蛋白具有北极甜虾组织蛋白酶L1或北极甜虾组织蛋白酶L2的活性。

本发明还包括可产生多肽的DNA，所述多肽与北极甜虾组织蛋白酶L1或L2全部或部分氨基酸序列有80％或以上、优选90％或以上、最优选95％或以上是相同的。本发明还包括与编码组织蛋白酶L或前原组织蛋白酶L的DNA序列的同源性为80％或以上、优选90％或以上、最优选95％或以上，并且所编码的蛋白具有组织蛋白酶L样酶活性或前原组织蛋白酶L样酶功能的DNA。

本发明包括用于检测所述基因的引物，例如，L1或L2碱基序列中15个或以上的连续的碱基序列，或在所述序列中有一个或多个碱基缺失、置换或添加的碱基序列。

本发明的北极甜虾组织蛋白酶L1或L2的S2袋主要是疏水性的，它由对应于成熟木瓜蛋白酶的氨基酸序列的67、68、157、160和205号氨基酸组成(编码根据文献Schechter，I.and Berger，A.(1967)On the size of the active site in proteinases，I.Papain(关于蛋白酶活性部位的大小I.木瓜蛋白酶).Biochem.Biophys.Res.Commun.27，157-162)。对于北极甜虾组织蛋白酶L1，成熟木瓜蛋白酶的氨基酸序列中的67和68号氨基酸为Val，133号为Cys，157号为Ile，160号为Ala，205号为Gln。对于北极甜虾组织蛋白酶L2，成熟木瓜蛋白酶的氨基酸序列中的67号氨基酸为Trp，68号为Pro，133号为Cys，157号为Ala，160号为Ala，205号为Tyr。

本发明包括由在北极甜虾组织蛋白酶L1或L2的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸的缺失、置换或添加的氨基酸序列组成、并具有与北极甜虾组织蛋白酶L1或L2具有相同的底物特异性的组织蛋白酶L样酶活性的蛋白。所述蛋白的特征为：成熟木瓜蛋白酶氨基酸序列中的(1)67和68号氨基酸为Val，133号为Cys，157号为Ile，160号为Ala，205号为Gln或(2)67号氨基酸为Trp，68号为Pro，133号为Cys，157号为Ala，160号为Ala，205号为Tyr，从而保留北极甜虾组织蛋白酶L1或L2的S2袋。

                    图表简述

图1显示北极甜虾组织蛋白酶L1的碱基序列以及推测的氨基酸序列；

图2显示北极甜虾组织蛋白酶L2的碱基序列以及推测的氨基酸序列；

图3显示北极甜虾组织蛋白酶L1的SDS-PAGE：

泳道1：分子量标记，泳道2：北极甜虾组织蛋白酶L1(10μg)；

图4显示北极甜虾组织蛋白酶L1的胶原蛋白分解图：

泳道1：分子量标记，泳道2：胶原蛋白，泳道3：无反应，泳道4：25℃反应30分钟；

图5显示北极甜虾组织蛋白酶L1的最适pH；

图6显示北极甜虾组织蛋白酶L1的最适温度；

图7显示北极甜虾组织蛋白酶L1的热稳定性；

图8显示北极甜虾组织蛋白酶L1和L2、其它甲壳类动物的组织蛋白酶L、大鼠组织蛋白酶L以及木瓜蛋白酶氨基酸序列之间的序列比较：

位置编号基于木瓜蛋白酶的位置编号。相同的残基以点表示，并插入间隔符以获得最大的匹配。形成三个二硫键的半胱氨酸以灰色表示，而活性中心的Cys、His、Asp反转印刷。北极甜虾组织蛋白酶L1和L2分别对应于北极甜虾1和2；

图9(A)显示属于木瓜蛋白酶类的组织蛋白酶的系统发生谱系，而(B)显示氨基酸序列之间的同源性：

系统发生谱系基于成熟酶序列的平行排列，采用邻接法绘制。图8中出现过的序列用黑体表示。分枝点处的数字代表自引值(％)。北极甜虾组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶L1和L2(分别缩写为NSL1和NSL2)与木瓜蛋白酶、大鼠组织蛋白酶B、H、K、S和L(分别缩写为RCB、RCH、RCK、RCS和RCL)、美洲螯龙虾(Homarus america)半胱氨酸蛋白酶1、2和3(分别缩写为LCP1、LCP2和LCP3)、挪威海龙虾(Nephrops norvegicus)神经系统和胃中的组织蛋白酶L(分别缩写为NCP1和NCP2)和白对虾(Penaeus vannamei)组织蛋白酶L1和L2(分别缩写为PCP1和PCP2)；

图10显示丙烯酰胺中北极甜虾组织蛋白酶L1的PAS(过碘酸希夫氏，Periodic Acid Schiff)染色：

泳道1：分子量标记

泳道2：北极甜虾组织蛋白酶L1(10μg)

泳道3：转铁蛋白(10μg)；

图11：

“采用二肽或三肽荧光底物分析北极甜虾组织蛋白酶L1的底物特异性。使用的二肽或三肽荧光MCA底物用Z-Xaa-Xaa-Arg-MCA(Xaa表示一个不同的氨基酸，也可用单字母氨基酸字符表示)表示。”：

图中，FR代表Z-Phe-Arg-MCA，RR代表Z-Arg-Arg-MCA，PR代表Z-Pro-Arg-MCA，VVR代表Z-Val-Val-Arg-MCA，LLR代表Z-Leu-Leu-Arg-MCA，FVR代表Z-Phe-Val-Arg-MCA；

图12显示由酵母表达系统生产的北极甜虾组织蛋白酶L2的SDS-PAGE(图12A)和明胶酶谱(图12B)：

泳道1显示包含北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)的前肽，泳道2显示成熟的北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)；

图13显示北极甜虾组织蛋白酶L2活性的pH图和pH稳定性：

A：关于在准一级反应条件下测量Z-Pro-Arg-MCA和Z-Phe-Arg-MCA的水解，北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)的pH依赖性二级反应常数(K_cat/K_m)分别表示于左轴和右轴。

B：在不同pH的缓冲液中处理30分钟后，pH6.0时对Z-Pro-Arg-MCA的残留活性。每一pH下的数据以相对于未处理样品的百分率表示；

图14显示北极甜虾组织蛋白酶L2的热稳定性；

图15显示北极甜虾组织蛋白酶L2的底物特异性；

所用的二肽或三肽荧光MCA底物以Z-Xaa-Xaa-Arg-MCA(Xaa指一个不同的氨基酸，它用三字母氨基酸字符表示)表示。

在图15中，FR代表Z-Phe-Arg-MCA，RR代表Z-Arg-Arg-MCA，PR代表Z-Pro-Arg-MCA，VVR代表Z-Val-Val-Arg-MCA，LLR代表Z-Leu-Leu-Arg-MCA；

图16显示北极甜虾组织蛋白酶L2对高血糖素的降解：

A：峰显示的是用反相HPLC对由北极甜虾组织蛋白酶L2降解高血糖素所产生的片段(用数字表示)进行分离的结果

B：反相HPLC分离所得片段(峰数)的氨基酸序列测定。

高血糖素的氨基酸序列列示于图下方。每一切割位点的敏感性由色谱峰的高度来估算。主要切割位点用粗箭头表示，一般切割位点用细箭头表示，次要切割位点用不连续线条表示，同时标出的是大鼠组织蛋白酶L的切割位点。

该图很好地显示了与其它组织蛋白酶L对比在切割位点上的不同；

图17是显示北极甜虾组织蛋白酶L2对I型胶原蛋白降解的结果的SDS-PAGE。

                优选实施方案的详细描述

实施例仅用来举例说明本发明，并不对本发明构成限制。

[实施例1]

从北极甜虾分离和纯化组织蛋白酶L样酶

<北极甜虾组织蛋白酶L1的纯化>

活的北极甜虾购自渔业合作协会，解剖以获得肝胰腺。向该肝胰腺中加入两倍体积的50mM Tris-HCl(pH7.5)，均浆。然后加入1/5体积的四氯甲烷，于4℃搅拌1小时脱脂，离心(18,000g，4℃，30min)。对所得上清进行硫酸铵分级分离。将用17.6-47.2％(w/v)硫酸铵沉淀所得的沉淀物溶解于含5mM CaCl₂和0.02％NaN₃的20mM Tris-HCl(pH7.5，缓冲液A)中，透析，然后加到用缓冲液A平衡的Q-Sepharose柱(Amersham Pharmacia)上。用缓冲液A洗下未结合部分，然后用缓冲液A和含0.6M NaCl的缓冲液A的线性梯度进行洗脱。

收集活性部分，对10mM磷酸钾缓冲液(pH6.9)透析，上样于用相同缓冲液平衡的羟基磷灰石(Bio-Rad)柱，用相同缓冲液和400mM磷酸钾缓冲液(pH6.9)的线性梯度进行洗脱。然后将活性部分加到Mono Q柱上。用缓冲液A和含1M NaCl的缓冲液A的线性梯度进行洗脱。北极甜虾组织蛋白酶L1用上述的方法纯化。用合成的底物测量得的每一纯化步骤的相对活性如表1和2所示。

<酶活性的测量方法>

在pH7.5和25℃下反应30分钟后，由SDS-PAGE确认每一纯化步骤中的活性部分以及纯化酶的胶原蛋白分解活性，所用底物为酸溶性I型胶原蛋白(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)(图4)。

此外，纯化过程中的酶活性可通过采用下述合成底物的方法进行定量监测。

DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg(Peptide Institute，Inc)(下文称作DNP-肽)用作测量胶原蛋白酶样酶活性的底物。将DNP-肽溶解于含150mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，使浓度为1mM，制成底物溶液。将相同体积的来自每一活性部份的酶溶液加入到100ml底物溶液中，于25℃下反应10分钟。加入1N HCl 0.5ml中止反应。加入乙酸乙酯和正丁醇(1∶0.15)的混合物，剧烈振荡。然后，在离心后于365nm波长处测量上清的吸光度。一个单位定义为每分钟水解1μmol底物的酶量。

用于测量胰蛋白酶样酶和弹性蛋白酶样酶活性的底物包括Bz-DL-Arg-pNA(BAPA)、Suc-(Ala)3-pNA(STANA)(Peptide Institute，Inc)、Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA(AAPR)和Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA(AAPL)(BACHEM)(Bz代表苯甲酰基，pNA代表对硝基苯胺，Suc代表琥珀酰基)。胰蛋白酶样酶活性的存在可由BAPA的降解来测定，而弹性蛋白酶样酶活性的存在可由STANA的降解来测定。AAPL和AAPR为来源于螃蟹的丝氨酸胶原蛋白酶作用的底物。浓度为50mM的底物溶液用二甲基亚砜来制备。来自每一活性部分的酶溶液加入到含150mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，预热，然后加入底物溶液至终浓度为0.5mM，于25℃下反应5分钟，于405nm波长处比色测定释放的对硝基苯胺。一个单位定义为每分钟水解1μmol底物的酶量。

每一活性部分中的蛋白量用Bradford法进行定量，用BSA作标准品。

表1

用DNP-肽分析的每一纯化步骤中的相对活性

步骤  总蛋白    总活性  相对活性  纯化程度   产率   (mg)       (U)    (U/mg)     (倍)     (％)硫酸铵沉淀Q-Sepharose FF羟基磷灰石MonoQ    916      30.605   0.033     1        100    31.7     7.892    0.249     7.4      25.8    1.16     2.562    2.213     66.2     8.37    0.153    1.521    9.944     297.5    4.97

表2

步骤         相对活性(U/mg)  AAPL    AAPR    BAPA     STANA硫酸铵沉淀Q-Sepharose FF羟基磷灰石MonoQ  0.169   0.068   0.006    0.018  0.351   0.112   0.002    0.020  2.548   0.722   0.000    0.106  12.094  2.441   0.000    0.182

纯化的北极甜虾组织蛋白酶L1能较好地作用于合成的胶原蛋白酶底物(表1)。它一点都不作用于BAPA，而很好地作用于P2位具有脯氨酸的底物(AAPL，AAPR)(表2)。

进一步用Z-Phe-Arg-MCA作为测定组织蛋白酶L样活性的底物来测量活性。用二甲基亚砜来配制浓度为20mM的底物溶液。酶溶液加入到含150mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，预热，然后加入底物溶液至终浓度为50μM，于25℃下反应5分钟，在380nm激发波长处及460nm发射波长处测量游离的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的荧光强度。用AMC(Peptide Institute，Inc)来制作标准曲线并定量。一个单位U定义为每分钟水解1μmol底物的酶量。在最终纯化步骤中观测到的活性为10.2U/mg。

北极甜虾组织蛋白酶L1的胶原蛋白分解图如图4所示。正如图中所示，本发明的酶在25℃30分钟的反应中能较好地降解胶原蛋白。

北极甜虾组织蛋白酶L1的SDS-PAGE图如图3所示。约30kDa处的单一条带即是获得的组织蛋白酶。

PAS染色按如下进行。

SDS-PAGE凝胶浸泡于12.5％三氯乙酸中30分钟，用蒸馏水洗涤30秒钟，浸泡于0.5％过碘酸溶液(用于PAS染色)(Wako PureChemical Industries，Ltd.)中50分钟，用蒸馏水充分洗涤，共6次，每次10分钟，用Cold Schiffs Reagent(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)处理50分钟，用含0.5％亚硫酸氢钠的0.05N HCl洗涤10分钟×3次，用蒸馏水洗涤，然后浸泡于5％乙酸中。结果表明北极甜虾组织蛋白酶L1具有糖链(图10)。

<最适pH>

在25℃ Britton-Robinson缓冲液(pH4-13)中用DNP-肽进行活性测量。最终反应溶液为200μl，DNP-肽和酶的最终浓度分别为0.5mM和1.5μg/ml。本发明酶的最适pH约为7-8(图5)。

<最适温度>

1mM DNP-肽和含150mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)在不同的温度下预热5分钟，然后加入酶测量活性。最终反应溶液为200μl，DNP-肽和酶的最终浓度分别为0.5mM和1.5μg/ml。本发明酶的最适温度约为35℃(图6)。

<热稳定性>

将本发明酶(300ng)加入到含150mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，在不同的温度下(20℃-70℃)保温30分钟和60分钟，然后立即在冰上冷却。用DNP-肽作底物于25℃测量残留活性。最终反应溶液为200μl，DNP-肽和酶的最终浓度分别为0.5mM和1.5μg/ml。本发明酶在25℃下保温1小时以及在30℃下保温30分钟是稳定的，在50℃保温1小时以及在60℃保温30分钟可被灭活(图7)。

[实施例2]

<N末端氨基酸序列分析>

将纯化的北极甜虾组织蛋白酶L1进行电泳，然后将其从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜。切下相应的条带并进行蛋白测序。本发明酶的N末端氨基酸序列为DTVDWRDKGAVTPVKDQGQ。根据同源性检索的结果，它与活性半胱氨酸蛋白酶的N末端邻近区域相符。

[实施例3]

<组织蛋白酶L的克隆>

参考测得的N末端氨基酸部分序列——DWRDKGA，制备寡核苷酸。制备的引物为5′-GAY TGG CGN GAY AAR GGN GC-3′(R：A/G，Y：C/T，N：A/G/C/T)。

用ISOGEN(Nippon Gene Co.，Ltd.)从北极甜虾肝胰腺中制备总RNA。然后用3′RACE System(GIBCO BRL)合成单链cDNA。以单链cDNA为模板，用上述的引物以及3′RACE System的AUAP进行PCR(30循环；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟)，得到约900bp的PCR产物。这此片段被插入到pGEM-T Easy Vector(Promega)中，亚克隆并测定3′末端的碱基序列。结果获得了两种序列，在这些序列的基础上制备反义链的引物，如表3所示。采用类似的方法对用5′RACE System(GIBCO BRL)获得的PCR片段进行亚克隆并且测定其5′末端的碱基序列。

表3

用于5′RACE的引物

                     核苷酸序列L1-R1    5′-GCA TCA ATA CAG ACG CTG AC-3′L1-R2    5′-CAT CAG CAT AAG GGA TAT CTG-3′L1-R3    5′-AAC GTG TGC AGC GTC GAA TC-3′L2-R1    5′-GTC TCA TCT CCT TCG GTT AC-3′L2-R2    5′-ACC TTG AAT GGT GGC ACC GA-3′L2-R3    5′-CGC ACT TGT CAT CAA CAG CA-3′

此外，表4中所列引物是由5′末端制备，而编码北极甜虾组织蛋白酶L1和L2的全长cDNA分离自上述的单链cDNA。

表4

用于克隆全长cDNA的引物

                      核苷酸序列L1-F    5′-TGA GTC AGT TCT GCT CAA CTC TGA TAC G-3′L2-F    5′-CAC TTT AGC AAG ATG AGG TCT CTG-3′

北极甜虾组织蛋白酶L1和L2的测定的碱基序列和推测的氨基酸序列分别如图1(SEQ ID：1和2)和图2(SEQ ID：3和4)所示。除估计的信号序列(1-15位残基：Met至Ala)和前序列(16-105：Ser至Ala)外，北极甜虾组织蛋白酶L1的N末端部分与纯化酶的氨基酸序列完全一致。编码北极甜虾组织蛋白酶L1信号序列的碱基为SEQ ID：1中的29-73位。编码前序列的碱基为SEQ ID：1和图1中74-343位。此外，估计的组织蛋白酶L2信号序列为Met至Val：1-14残基，估计的前序列为Ser至Met：15-106残基。编码这些序列的碱基分别为SEQ ID：3中13-54位以及55-330位。

北极甜虾组织蛋白酶L1和L2酶原以及其它生物的组织蛋白酶L之间的氨基酸序列的同源性如表5所示。

从图8中可以清楚地看出，北极甜虾组织蛋白酶L1和L2的催化基团Cys、His和Asn是保守的，它们同属于木瓜蛋白酶类的半胱氨酸蛋白酶。二硫键的位置也是保守的。从用邻接法创建的系统发生谱系(图9)也可看出L1和L2同为组织蛋白酶L样酶。

表5

与其它生物组织蛋白酶L的比较

        同源性(％)北极甜虾组织  北极甜虾组织  蛋白酶L1      蛋白酶L2北极甜虾组织蛋白酶L2美洲螯龙虾(Homarus americanus)1美洲螯龙虾(Homarus americanus)2美洲螯龙虾(Homarus americanus)3挪威海龙虾(Nephrops norvegicus)1挪威海龙虾(Nephrops norvegicus)2太平洋白对虾(Penaeus vannamei)1太平洋白对虾(Penaeus vannamei)2家蚕(Bombyx mori)果蝇(Drosophila melanogaster)小鼠(Mus musculus)挪威大鼠(Rattus norvegicus)牛(Bos Taurus)人(Homo sapiens)    55            -    55            57    57            55    55            53    57            54    53            56    52            52    54            51    52            48    54            47    47            45    47            44    47            46    47            43

北极甜虾组织蛋白酶L1酶原与美洲螯龙虾的半胱氨酸蛋白酶2具有最大同源性(57％)(表5)。北极甜虾组织蛋白酶L2酶原与美洲螯龙虾的半胱氨酸蛋白酶1具有最大同源性(57％)(表5)。

[实施例4]

从冰冻北极甜虾样品中分离和纯化组织蛋白酶L样酶

<北极甜虾组织蛋白酶L1的粗抽提物>

所有纯化步骤在4℃下进行。将冻存于-80℃的肝胰腺部分融化，加入两倍体积的50mM Tris-Hcl(pH7.5，含有150mM NaCl和3mM NaN₃)，用Polytron Homogenizer均浆器均浆5分钟。然后，边缓慢搅拌边加入1/5体积的四氯甲烷，离心(19,000g，30分钟)，脂被抽提到下层四氯甲烷中。脱脂的上清用作粗抽提物。

<北极甜虾组织蛋白酶L样蛋白酶的纯化>

粗抽提物用25-70％(v/v)的冷丙酮进行分级分离，19,000×g离心15分钟。所得沉淀重新溶解于50mM Tris-HCl(pH7.5，含有50mMNaCl)(缓冲液1)中，对相同的缓冲液1透析过夜。透析液用0.45μm滤器过滤，加到用相同的缓冲液1平衡的Q-Sepharose离子交换柱(1.6×40cm Amersham Pharmacia Biotech)上。用相同的缓冲液洗柱，结合的蛋白用0-0.5M范围的NaCl线性梯度进行洗脱。

活性部分的蛋白水解活性用Z-Phe-Arg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA以及明胶酶谱来进行测量。

收集对Z-Phe-Arg-MCA具有高度活性而对Z-Arg-Arg-MCA几乎无活性的部分，对50mM Tris-HCl(pH7.5，含150mM NaCl)(缓冲液2)透析，然后用Biomax-5K Ultrafree(Millipore)进行超滤浓缩。将收集得的浓缩部分上样于用缓冲液2平衡的Superdex 75pg凝胶过滤柱(1.6×100cm，Amersham Pharmacia Biotech)，以0.4ml/min的流速进行洗脱。

收集对Z-Phe-Arg-MCA具有活性的部分，对10mM磷酸钾缓冲液(pH6.8)透析。透析液上样于用相同缓冲液平衡的Bio-Scale CHT10-I羟基磷灰石(1.2×8.8cm，Bio-Rad)柱。洗下非特异性结合的蛋白，结合的蛋白用10-400mM线性梯度的磷酸钾缓冲液(pH6.8)进行洗脱。

鉴定N末端氨基酸序列，该蛋白被确认为L1。

<组织蛋白酶L样酶分析>

于25℃，在含100mM乙酸钠、100mM NaCl、2mM DTT、2mMEDTA和0.01％Brij-35的缓冲液(pH6.0)中，用分子内猝灭MCA(甲基香豆酰胺)底物分析酶的活性。底物溶液用二甲亚砜配制，浓度为20mM。加入用相同缓冲液稀释的酶，开始水解。酶活性通过在380nm激发波长处及460nm发射波长处测量游离的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的荧光强度而进行测定。

<底物特异性分析>

在准一级反应条件(本说明书中所用的准一级反应是指所用底物浓度远低于预计的Km的条件，其中初始反应率v₀与k_cat/K_m值直接成正比)下，用各种二肽MCA或三肽MCA底物测量S2亚位的底物特异性。结果如图11所示。

用以下荧光肽底物作底物：Z-Phe-Arg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA、Z-Pro-Arg-MCA、Z-Val-Val-Arg-MCA、Z-Leu-Leu-Arg-MCA、Z-Phe-Val-Arg-MCA、H-Arg-MCA and Z-Arg-MCA。

从图11可以看出，北极甜虾组织蛋白酶L1高特异性地切割P2位(采用的编码见Schechter and Berger，1967，On the size of the activesite in proteinases，I.Papain.Biochem.Biophys.Res.Commun.27，157-162)上具有非芳族疏水残基的合成底物。该特异性与组织蛋白酶K和S类似，而这两种组织蛋白酶在此位对Leu比Phe更特异。在另一方面，组织蛋白酶L对Phe比Leu更特异。

然而，与组织蛋白酶K和S不同的是，在P2位上，北极甜虾组织蛋白酶L1选择性地接受Val而不是Phe。

<抑制剂作用>

在缓冲液(含有100mM乙酸钠、2mM DTT、2mM EDTA和0.05％Triton X-100)中，用E64(L-顺式-环氧琥珀酰-亮氨酰-鲱精胺)、Z-Phe-Phe-CHN₂、Z-Phe-Tyr(t-Bu)-CHN₂、亮抑酶肽、抗蛋白酶、PMSF(苯甲基磺酰氟)和1，10-邻二氮杂菲中任一种抑制剂对酶溶液进行预处理。然后用荧光底物Z-Phe-Arg-MCA测量残留酶活性。酶和底物的终浓度分别为1nM和100μM。用上述方法测量残留酶活性。

结果如表6所示。

表6

    化合物    浓度    残留活性(％)对照    100％E64    0.1μM    1μM    0    0组织蛋白酶L抑制剂Z-Phe-Phe-CHN₂    1μM    10μM    78    55Z-Phe-Tyr(t-Bu)-CHN₂    1μM    10μM    94    86丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制剂亮抑酶肽    1μM    10μM    0    0抗蛋白酶    1μM    10μM    0    0丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF    1mM    10mM    100    100金属蛋白酶抑制剂1，10-邻二氮杂菲    1mM    10mM    99    98

如表6所示，北极甜虾组织蛋白酶L1表现出典型的半胱氨酸蛋白酶抑制方式。北极甜虾组织蛋白酶L1可被甚至0.1μM浓度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64强烈抑制。L1还可被同为半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的亮抑酶肽和抗蛋白酶强烈抑制。

虽然Z-Phe-Phe-CHN₂是有效的组织蛋白酶L抑制剂，但是已知它也轻微地抑制组织蛋白酶B和S。此外，Z-Phe-Tyr(t-Bu)-CHN₂是组织蛋白酶L特异性的抑制剂。

然而，Z-Phe-Phe-CHN₂和Z-Phe-Tyr(t-Bu)-CHN₂并不在很大程度上抑制本发明酶。丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶特异性的抑制剂对其也没有抑制活性。

由上可以得出如下结论：本发明的北极甜虾组织蛋白酶L1与通常所知的组织蛋白酶L样蛋白水解酶相比，在其特异性和抑制剂的抑制作用两个方面都不同。还可得出它是一种全新的酶的结论。

[实施例5]

北极甜虾组织蛋白酶L2的表达

可用EasySelect^TM Echo-Adapted^TM毕赤酵母表达试剂盒(Invitrogen)在甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中异源表达编码北极甜虾组织蛋白酶L2(北极甜虾半胱氨酸蛋白酶：NsCys)的基因。

编码全长北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)(不包括其信号肽)的924bp cDNA用PCR进行扩增，并根据试剂盒的方案将其克隆入试剂盒中的pUniD/V5-His-TOPO载体。所得载体通过Cre重组酶进行质粒融合而重组入巴斯德毕赤酵母穿梭载体pPICZα-E中，使北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)的cDNA置于酵母α-结合因子分泌信号的下游。

融合质粒载体用限制性酶Pme I线性化，然后通过电穿孔(GenePulser，Bio-Rad)转化巴斯德毕赤酵母KM71H菌株(arg4aoxl：：ARG4)。其中整合有多个拷贝北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)的阳性转化子，通过提高培养基(YPDS，含酵母抽提物、蛋白胨抽提物和山梨醇)中的zeocin浓度至2000μg/ml而进行选择。选择具有高产量克隆的单菌落用于重组蛋白的大规模生产，并仅用一步凝胶过滤层析从浓缩的培养基中获得北极甜虾组织蛋白酶L2(北极甜虾半胱氨酸蛋白酶，NsCys)的纯制品。

在诱导表达前，将巴斯德毕赤酵母克隆接种于1L GCM(甘油复合培养基)，于30℃有氧条件下培养4天。在室温下，3000×g离心5分钟收集细胞。于100ml ofBMM培养基(缓冲甲醇基础培养基)或MM培养基(甲醇基础培养基)中诱导表达。每天加入甲醇使终浓度为0.75％，以避免由于蒸发导致培养基甲醇损失。为证实表达，每天收集样品，于4℃ 12000×g离心20分钟，对上清用4-20％梯度的聚丙烯酰胺凝胶板进行SDS-PAGE分析。

<重组蛋白的纯化>

于4℃，用YM-10滤器(Amicon)将不含细胞的培养基上清超滤浓缩至约10ml。将浓缩液对50mM Tri-HCl(含150mM NaCl)透析。对透析液用相同缓冲液平衡的Superdex 75pg柱(1.6×100cm)进行凝胶过滤层析。用FPLC系统以0.3ml/min的流速洗脱蛋白。用Z-Phe-Arg-MCA测量各部分的酶活性，具有最高活性的部分进一步用SDS-PAGE和酶谱法进行分析以确定纯化度的一致性。采用的明胶酶谱法为稍做改进的Heussen及Dowdle法。

于4℃，用含0.1％明胶的15％的聚丙烯酰胺凝胶板进行电泳。电泳后，在2.5％Triton-X中洗涤两次，每次30分钟以除去SDS。于室温下，将凝胶在酶反应溶液(100mM乙酸钠，pH5.5，100mMNaCl、2mM DTT、2mM EDTA和0.01％Brij)中保温3小时。用考马斯亮蓝R250染色，用10％乙酸脱色。

结果如图12所示(对照1，图5)。

对图12A(泳道2)中的30KDa蛋白的N末端氨基酸序列进行鉴定。它与由碱基序列推测的成熟的北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)的N末端氨基酸序列一致。

<蛋白浓度的测定>

纯化的重组北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)的浓度用Bradford法进行测量，用牛血清白蛋白作标准品。为研究虾蛋白酶的动力学，酶的摩尔量采用Barrett及Kirschke法，通过用E-64滴定活性位点来进行测量。

<酶活性>

酶活性的测量按实施例4进行。

<活性和稳定性的pH和热依赖性>

按上述方法，在准一级反应条件下，用浓度为10μM的底物测量重组北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)的pH活性曲线。

所用缓冲液如下：100mM柠檬酸钠缓冲液，pH3.0-6.0；100mM磷酸钠缓冲液，pH6.0-8.0；和100mM硼酸钠缓冲液，pH8.0-11.0。每种pH缓冲液还含有2mM DTT、2mM EDTA和300mM NaCl。

于25℃，将酶在这些缓冲液中保温30分钟以测定pH稳定性。残留活性用上述荧光底物测量。

结果如图13所示。在碱性范围，哺乳动物的组织蛋白酶L被完全灭活或仅有极低的活性，但是本发明的北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)即使是在pH8.5时也保留约80％的活性。

为测量温度对北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)水解Z-Pro-Arg-MCA的活性的影响，将含底物的缓冲液置于不同的温度下预热10分钟，然后加入酶液。反应5分钟，按上述方法记录下荧光变化。为考察热稳定性，于30-60℃处理酶溶液，按某一时间间隔收集样品，迅速于冰上冷却，于25℃测量对Z-Pro-Arg-MCA的残留活性。

结果如图14所示。

<底物特异性分析>

按实施例4中的方法测量底物特异性。

结果如图15所示。

一般来说，组织蛋白酶L和S适宜于作用带Phe和Leu并具有大的疏水侧链的底物，而不适宜于作用带Val并在P2位具有小的β-枝链的底物。相反，北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)对Leu与Val的偏好次序正好相反。此外，与已知的其它组织蛋白酶不同的是，北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)对Phe的亲和性比对Pro的高10倍。哺乳动物组织蛋白酶也偏好于P2位Pro，但是不同的是，它同样接受Leu为P2位残基并对Phe也有很高的亲和性。

<高血糖素的降解>

1μM高血糖素样品于25℃在含100mM NaCl、2mM DTT和0.01％Brij-35的100mM乙酸钠缓冲液(pH6.0)中，用12.5nM重组北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)降解4小时。样品用15％乙酸酸化，所得肽片段立即用反相HPLC(ODS-120A柱(25×0.4cm，Tosoh))分离。用含0.1％三氟乙酸的水洗柱至215nm处的吸光度到达基线，用含0.1％三氟乙酸的95％乙腈，以0-60％线性梯度和1.0ml/min的流速进行洗脱。

收集215nm处的每一个吸收峰所对应的洗脱液，真空干燥，用Applied Biosystems公司生产的476A型蛋白测序仪(Protein SequencerModel 476A)进行分析。

结果如图16所示。

虽然高血糖素中不含Pro，但结果与合成底物的降解结果相符。P2位残基的偏好顺序为Val、Thr和Ala。不存在P2中具有Leu的片段的事实表明它对Leu的亲和性极低。

<对胶原蛋白的消化>

对含有大量Pro的I型胶原蛋白的降解进行了试验。

猪皮酸溶性I型胶原蛋白用100mM乙酸钠缓冲液(pH6.0，含150mMNaCl、2mMDTT和2mMEDTA)稀释至浓度为2.5μM，并在有或无10μM E-64的存在下，用125nM北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)处理。

按预先设定的时间间隔收集样品，立即加入到SDS-PAGE样品缓冲液中，煮沸5分钟。用4-20％梯度胶(TEFCO)通过考马斯蓝染色来证实胶原蛋白的水解。

结果如图17所示。

结果与已知的半胱氨酸蛋白酶进行了比较。我们发现北极甜虾组织蛋白酶L2(NsCys)对I型胶原蛋白降解极强。

本发明提供来源于北极甜虾的新颖的水解胶原蛋白的组织蛋白酶L样酶。本发明酶可从北极甜虾的肝胰腺中获得，或者通过培养经转化导入编码本发明酶基因的宿主细胞来获得。本发明可用于广泛的领域如食品、化妆品和药品。

本申请要求2002年6月17日提交到日本专利厅的日本专利申请(Shutsugan)2002-175773以及2003年5月20日提交到美国专利商标局的美国临时申请60/471733的优先权。这两个申请的内容被本发明通过引用结合到本说明书中。

                           序列表

<110>Nichirei Corporation

<120>来源于北极甜虾(Pandalus eous)的新型降解胶原的组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶、其生产方法

<130>PH-1804US

<150>JP 2002-175773

<151>2002-06-17

<150>US 60/471,733

<151>2003-05-20

<160>12

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1246

<212>DNA

<213>北极甜虾(Pandalus eous)

<400>1

tgagtcagtt ctgctcaact ctgatacgat gaaggttctt cttttcctgt gtggtctggc 60

catagtcgcc gctagtgaat gggaaaactt caagttgacc catgctaaag tttacaccca 120

tggcaaggaa gatctttaca ggaggtccat ctttgagaac aaccagaagg ttgtcgagga 180

acacaatgaa cgattccgtc agggacttgt caccttcgac ctcaagatga acagattcgg 240

agatatgacg acagaggagt ttgtatccca gatgaccggg ctcaacaaag tagagaggac 300

cgttggtaag gtgttcgctc actaccctga agtagaaagg gctgacactg ttgactggag 360

agacaaagga gctgtgaccc cagttaagga tcagggtcag tgtggatcat gctgggcctt 420

ctctaccact ggagctctgg aaggagcaca tttcctgaaa cacggcgatt tagtcagtct 480

gtccgaacaa aatctggtcg attgctcaac tgagaacagt ggctgtaacg gcggtgtggt 540

ccaatgggcc tacgactaca tcaagtccaa caacggaatt gatactgaat cttcataccc 600

ctacgaagct caagatttaa cttgtcgatt cgacgctgca cacgttggtg ctaccgttac 660

tggatacgca gatatccctt atgctgatga agtgacccag gcctcagctg tccatgatga 720

tggtccagtc agcgtctgta ttgatgctgg acacaattcc ttccagttgt acagctcagg 780

tgtgtactac gagcctaact gcaatcctag ctctatcaac cacgctgtgt tgcccgtagg 840

atacggaaca gaggaaggca gtgactactg gctcatcaag aactcttggg gaactggctg 900

gggtctgagt ggatacatga agctcacaag gaacaagagc aatcattgtg gtgtcgccac 960

ccaatcttgt taccctaatg tctaagagct caatttaaga catggttttc cacttaaaca 1020

acggaggtaa tgtttaacca tttcaaaaac acctcaggaa agccttatgg ataaaagtaa 1080

tggatatctt caaacaattt tccactgaat tttcttgtgt gacgataaaa catctacttc 1140

cgccatttta agattacacc tgactcaaac tatacatatt aatgtgtgta gcattctagt 1200

agaaaataaa gaaagcatta caaaataaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                1246

<210>2

<211>318

<212>PRT

<213>北极甜虾(Pandalus eous)

<400>2

Met Lys Val Leu Leu Phe Leu Cys Gly Leu Ala Ile Val Ala Ala Ser

  1               5                  10                  15

Glu Trp Glu Asn Phe Lys Leu Thr His Ala Lys Val Tyr Thr His Gly

             20                  25                  30

Lys Glu Asp Leu Tyr Arg Arg Ser Ile Phe Glu Asn Asn Gln Lys Val

         35                  40                  45

Val Glu Glu His Asn Glu Arg Phe Arg Gln Gly Leu Val Thr Phe Asp

     50                  55                  60

Leu Lys Met Asn Arg Phe Gly Asp Met Thr Thr Glu Glu Phe Val Ser

 65                  70                  75                  80

Gln Met Thr Gly Leu Asn Lys Val Glu Arg Thr Val Gly Lys Val Phe

                 85                  90                  95

Ala His Tyr Pro Glu Val Glu Arg Ala Asp Thr Val Asp Trp Arg Asp

            100                 105                 110

Lys Gly Ala Val Thr Pro Val Lys Asp Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys

        115                 120                 125

Trp Ala Phe Ser Thr Thr Gly Ala Leu Glu Gly Ala His Phe Leu Lys

    130                 135                 140

His Gly Asp Leu Val Ser Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser

145                 150                 155                 160

Thr Glu Asn Ser Gly Cys Asn Gly Gly Val Val Gln Trp Ala Tyr Asp

                165                 170                 175

Tyr Ile Lys Ser Asn Asn Gly Ile Asp Thr Glu Ser Ser Tyr Pro Tyr

            180                 185                 190

Glu Ala Gln Asp Leu Thr Cys Arg Phe Asp Ala Ala His Val Gly Ala

        195                 200                 205

Thr Val Thr Gly Tyr Ala Asp Ile Pro Tyr Ala Asp Glu Val Thr Gln

    210                 215                 220

Ala Ser Ala Val His Asp Asp Gly Pro Val Ser Val Cys Ile Asp Ala

225                 230                 235                 240

Gly His Asn Ser Phe Gln Leu Tyr Ser Ser Gly Val Tyr Tyr Glu Pro

                245                 250                 255

Asn Cys Asn Pro Ser Ser Ile Asn His Ala Val Leu Pro Val Gly Tyr

            260                 265                 270

Gly Thr Glu Glu Gly Ser Asp Tyr Trp Leu Ile Lys Asn Ser Trp Gly

        275                 280                 285

Thr Gly Trp Gly Leu Ser Gly Tyr Met Lys Leu Thr Arg Asn Lys Ser

    290                 295                 300

Asn His Cys Gly Val Ala Thr Gln Ser Cys Tyr Pro Asn Val

305                 310                 315

<210>3

<211>1242

<212>DNA

<213>北极甜虾(Pandalus eous)

<400>3

cactttagca agatgaggtc tctgtttctt atccttctcg ggctggctgc ggtctccgcc 60

attggagaat gggaaaactt caagacgaag tttggcaaga agtatgccaa ctcagaagag 120

gagagtcaca gaatgtctgt tttcatggac aaactgaagt tcattcagga gcacaatgaa 180

cgatacgata agggagaagt cacttattgg ctgaaaatca acaacttctc cgatttgacc 240

cacgaagagg tcttggccac caagactgga atgaccagga gacgacaccc tctttccgta 300

ttgcccaaat ctgccccaac cacaccaatg gccgcagacg ttgactggag gaataagggg 360

gctgtcaccc ccgtcaagga tcagggacaa tgcggatcat gctgggcttt ctcagctgtc 420

gccgccttgg aaggagcgca cttcctgaag accggagatt tggtcagcct gtctgaacag 480

aatttggttg actgctcttc gtcttacggt aaccaaggat gtaatggtgg atggccatac 540

caagcttatc aatacatcat tgccaatcgt ggcattgaca ccgaatcgtc atacccttac 600

aaggcaattg atgacaattg ccgatatgat gccggaaaca tcggcgccac cgtcagcagt 660

tatgtcgaac cagcttcagg agatgagtcc gcacttcagc atgctgtcca gaatgaagga 720

cccgtcagcg tctgcattga tgctggtcaa tcatctttcg gtagttacgg aggaggtgtt 780

tactatgaac caaactgcga ttcctggtac gccaaccatg ccgtgacagc cgtcggctac 840

ggcaccgacg ccaacggagg agattactgg atcgtcaaga actcgtgggg tgcatggtgg 900

ggagagagtg gctacatcaa gatggccaga aacagggaca acaactgtgc cattgctacc 960

tatagtgtct accctgttgt ttaagatctt ttattgacac tcacaatgat tttctttcca 1020

tcatttatca ttggggaact tttaatattc atttggggtt ttcatttgat attttgtgta 1080

agtctcagtc aatcccatta gacatgtttt gttacggtgg attcttaagt caacctttga 1140

atcaaacact tttgtcaaat tacaatgaac acatccaaca gatgatgata catatgaaaa 1200

taaagataca acagataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa                    1242

<210>4

<211>323

<212>PRT

<213>北极甜虾(Pandalus eous)

<400>4

Met Arg Ser Leu Phe Leu Ile Leu Leu Gly Leu Ala Ala Val Ser Ala

  1               5                  10                  15

Ile Gly Glu Trp Glu Asn Phe Lys Thr Lys Phe Gly Lys Lys Tyr Ala

             20                  25                  30

Asn Ser Glu Glu Glu Ser His Arg Met Ser Val Phe Met Asp Lys Leu

         35                  40                  45

Lys Phe Ile Gln Glu His Asn Glu Arg Tyr Asp Lys Gly Glu Val Thr

     50                  55                  60

Tyr Trp Leu Lys Ile Asn Asn Phe Ser Asp Leu Thr His Glu Glu Val

 65                  70                  75                  80

Leu Ala Thr Lys Thr Gly Met Thr Arg Arg Arg His Pro Leu Ser Val

                 85                  90                  95

Leu Pro Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Met Ala Ala Asp Val Asp Trp

            100                 105                 110

Arg Asn Lys Gly Ala Val Thr Pro Val Lys Asp Gln Gly Gln Cys Gly

        115                 120                 125

Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Val Ala Ala Leu Glu Gly Ala His Phe

    130                 135                 140

Leu Lys Thr Gly Asp Leu Val Ser Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp

145                 150                 155                 160

Cys Ser Ser Ser Tyr Gly Asn Gln Gly Cys Asn Gly Gly Trp Pro Tyr

                165                 170                 175

Gln Ala Tyr Gln Tyr Ile Ile Ala Asn Arg Gly Ile Asp Thr Glu Ser

            180                 185                 190

Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Ile Asp Asp Asn Cys Arg Tyr Asp Ala Gly

        195                 200                 205

Asn Ile Gly Ala Thr Val Ser Ser Tyr Val Glu Pro Ala Ser Gly Asp

    210                 215                 220

Glu Ser Ala Leu Gln His Ala Val Gln Asn Glu Gly Pro Val Ser Val

225                 230                 235                 240

Cys Ile Asp Ala Gly Gln Ser Ser Phe Gly Ser Tyr Gly Gly Gly Val

                245                 250                 255

Tyr Tyr Glu Pro Asn Cys Asp Ser Trp Tyr Ala Asn His Ala Val Thr

            260                 265                 270

Ala Val Gly Tyr Gly Thr Asp Ala Asn Gly Gly Asp Tyr Trp Ile Val

        275                 280                 285

Lys Asn Ser Trp Gly Ala Trp Trp Gly Glu Ser Gly Tyr Ile Lys Met

    290                 295                 300

Ala Arg Asn Arg Asp Asn Asn Cys Ala Ile Ala Thr Tyr Ser Val Tyr

305                 310                 315                 320

Pro Val Val

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gcatcaatac agacgctgac                                          20

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>6

catcagcata agggatatct g                                      21

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>7

aacgtgtgca gcgtcgaatc                                        20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>8

gtctcatctc cttcggttac                                        20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>9

accttgaatg gtggcaccga                                        20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>10

cgcacttgtc atcaacagca                                         20

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>11

tgagtcagtt ctgctcaact ctgatacg                                28

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>12

cactttagca agatgaggtc tctg                                    24